徐 彬余元勛章小琳李建平劉 萍

◇生育與婦幼衛(wèi)生◇

無創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測在產(chǎn)科門診的應(yīng)用研究

徐 彬1余元勛1章小琳2李建平1劉 萍1

目的：應(yīng)用新的基因DNA測序方法研究其對孕中期孕母血漿中胎兒游離DNA（cffDNA）進(jìn)行染色體非整倍體檢測的靈敏度和特異性，并與羊水核型分析結(jié)果比較。方法：收集2013年1月～2014年7月在安徽省立醫(yī)院產(chǎn)科門診2596例孕婦的血樣本，進(jìn)行唐氏綜合癥血清學(xué)篩查、12-plex高通量Hiseq2000平臺檢查；對血清學(xué)篩査中的cffDNA檢測陽性者，進(jìn)行羊水細(xì)胞遺傳學(xué)診斷。結(jié)果：孕中期血清學(xué)篩查共2596例，發(fā)現(xiàn)高危孕婦197例，占7.59%；對高危孕婦176例進(jìn)行cffDNA檢測發(fā)現(xiàn)43例陽性，陽性率為24.43%；同時進(jìn)行羊水染色體核型分析發(fā)現(xiàn)42例核型異常，陽性率為23.86%；兩種方法結(jié)果基本一致。結(jié)論：孕婦血的胎兒cffDNA檢測，是無創(chuàng)產(chǎn)前診斷方法；檢測靈敏度較高。

無創(chuàng)性產(chǎn)前診斷 唐氏綜合癥 胎兒游離DNA 核型

唐氏綜合征（Down syndrome,DS）又稱21-三體（Trisomy 21，T21）綜合征、先天愚型,是最常見的染色體非整倍體疾病，新生兒發(fā)病率在1/700～1/800，占新生兒染色體病的70%～80%[1],其他比較常見的還包括18-三體（Trisomy18，T18）、13-三體（Trisomy13，T13）、Turner綜合癥等。目前簡便、經(jīng)濟(jì)、無創(chuàng)的孕中期血清學(xué)標(biāo)志物篩查，是檢測胎兒染色體非整倍體疾病的重要篩查手段。研究表明，血清學(xué)標(biāo)志物篩查的假陽性率較高（5%～7.5%）[2]。因此應(yīng)用更好的方法產(chǎn)前發(fā)現(xiàn)這些染色體疾病胎兒,能有效減少患兒的出生,是當(dāng)前圍產(chǎn)優(yōu)生學(xué)的重要任務(wù)之一。

1997年Lo等報道，母血中存在胎兒游離DNA（cffDNA），可進(jìn)行無創(chuàng)診斷胎兒染色體異常，即僅抽取母血，對血中cffDNA進(jìn)行測序，即可診斷胎兒是否為染色體異常[3]；2008年Lo等先后報道，使用對血中cffDNA測序、進(jìn)行無創(chuàng)產(chǎn)前檢測（NIPT）時，T21的檢測準(zhǔn)確度為100%[4]。隨后多項臨床研究證實，使用對血中cffDNA測序，檢測T21、T18、T13的靈敏度、特異度及陰性預(yù)測值（NPV）均較高[5～6],適用于產(chǎn)前診斷，目前已成為常用方法。本文通過血清學(xué)篩查、cffDNA測序檢測，診斷染色體異常，能為該方法在安徽大規(guī)模臨床研究和應(yīng)用，提供循證醫(yī)學(xué)證據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對象 選擇2013年1月～2014年7月安徽省立醫(yī)院產(chǎn)科門診孕期產(chǎn)檢的2596例孕婦，年齡22～44歲，孕11～24周，采取血樣本者均有知情同意書，本研究經(jīng)過該醫(yī)院的倫理委員會審批通過。入組條件:＞孕11周;單胎妊娠;體重在100kg以下。排除條件:多胎妊娠;孕婦是染色體異常患者;孕婦在抽血當(dāng)天有侵入性手術(shù)經(jīng)歷;孕婦接受過異體輸血、移植手術(shù)、干細(xì)胞治療等;拒絕行cffDNA檢測者。

1.2 方法 常規(guī)抽取靜脈血3～5ml,血液凝固后分離血清，將血清裝入血清保存管,4℃保存，注明標(biāo)本編號。血清于1周內(nèi)在安徽省立醫(yī)院檢驗科完成TRAFIA法檢測AFP、Free-βHCG、uE3的血清濃度；剩余血清-20℃保存。實驗過程嚴(yán)格按照說明書操作，并有質(zhì)控。研究中保證孕婦臨床資料信息準(zhǔn)確，孕周正確估計。孕早期超聲孕周核對應(yīng)以頭臀長作為標(biāo)準(zhǔn)，孕中期核對時應(yīng)以雙頂徑作為標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.1 按文獻(xiàn)[6]進(jìn)行cffDNA檢測標(biāo)本采集 應(yīng)用孕婦血漿樣本采集標(biāo)準(zhǔn)作業(yè)程序（SOP），采集孕婦外周血10ml，一般置于數(shù)個標(biāo)準(zhǔn)真空采血管內(nèi)（EDTA抗凝），充分混勻，在抽血后6小時內(nèi)進(jìn)行以下處理：在4℃下兩次離心10min，將上清血漿轉(zhuǎn)入新的1.5ml離心管中，-80℃保存。

1.2.2 按文獻(xiàn)[6]進(jìn)行DNA標(biāo)本的SOP 血漿樣本DNA抽提（磁珠分離法）時，先用1ml血漿，加2ml binding buffer;70μl（20μg/μl）蛋白酶K;120μl（1μg/μl）carrier RNA;15μl（10μg/μl） 糖原; 30μlBEADS;室溫下混勻 15～20min；分裝到1.5mlEP管中，靜置1～2min，吸去廢液;加入40μl EB液，55℃水浴10min（每30s混勻一次）；靜置1～2min，收集液體至新的EP管中。Qubit定量樣品DNA濃度。按文獻(xiàn)[6]進(jìn)行DNA末端修整、末端加A、連接。

1.2.3 PCR與測序、羊水細(xì)胞培養(yǎng)染色體核型分析 配制如下反應(yīng)體系，含DNA液22 μl、PhusionDNA polymerase25μl、PCR primer1.0μl、PCR primer2.0μl；總體積50μl。反應(yīng)條件:98℃30 s熱變性;再98℃10 s，65℃30 s，72℃30 s，15個循環(huán);延長72℃10 min。按照QIAquick PCR purification kit說明，柱純化DNA。Qubit定量DNA濃度。使用12-plex高通量Hiseq2000平臺進(jìn)行高通量測序。運(yùn)用序列比對軟件BWA map，將DNA測序所得的cffDNA序列，比對于人類基因組參考序列。計算每條染色體所占比例（%），并利用公式計算各個染色體Z值。利用Z值來評估樣本的實際患病情況（cut off:Z=3）。按文獻(xiàn)[6]進(jìn)行羊水細(xì)胞培養(yǎng)染色體核型分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 本研究所有的研究數(shù)據(jù)均使用Microsoft Office Excel 2007進(jìn)行錄入和統(tǒng)計。用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。計量資料用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用方差分析檢驗，計數(shù)資料用卡方檢驗。P＜0.05為差異存在統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 孕婦一般情況分析 本次共收入2596例單胎妊娠孕婦進(jìn)行研究分析，年齡22～44歲，平均年齡32.28±3.72歲。2509例（96.45%）為低齡組（≤35歲），平均年齡（28.83±2.407）歲。87例（3.35%）為高齡組（＞35歲），平均年齡（38.13±2.02）歲。采血樣孕周為11～24周，平均（16±3）周；1768例（68.10%）為首次妊娠；2171例（83.63%）為首次生育；208例（8.01%）有流產(chǎn)史。

2.2 血清學(xué)篩查結(jié)果 血清學(xué)篩査2596例后，發(fā)現(xiàn)高?；颊吖?97例，陽性率7.59%，不同年齡孕婦血清學(xué)篩查的DS高風(fēng)險率分布情況見表1；C、D年齡組與A、B年齡組間DS高風(fēng)險發(fā)生率差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。隨著高齡孕婦的增加，唐氏綜合癥篩查的陽性率也增加，高齡組DS風(fēng)險更高。

表1 不同年齡組孕婦血清學(xué)篩查DS高風(fēng)險率分布情況

2.3 cffDNA檢測結(jié)果 共收集高危孕婦樣本176例，cffDNA檢測43例陽性：28例T21;5例T18;1例T13;4例45，XO；3例45，X；2例47，XXY，總體陽性率為24.43%（43/176）。

2.4 羊水染色體核型分析結(jié)果 血清學(xué)篩查后共收集高危孕婦經(jīng)腹羊膜腔穿刺羊水樣本176例，進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)染色體核型分析；其中染色體核型異常陽性共42例，陽性率23.86%（42/176），包括 27例 T21;5例 T18;1例 T13;4例 45，XO;3例45，X;2例47，XXY，胎兒染色體核型分析結(jié)果與cffDNA檢測結(jié)果基本一致；無創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測與染色體核型分析準(zhǔn)確率的比較見表2。

表2 無創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測與染色體核型分析準(zhǔn)確率的比較

3 討 論

過去診斷胎兒染色體非整倍體疾病，常通過侵入性產(chǎn)前診斷操作，如絨毛活檢、羊膜腔穿刺而獲得樣本。由于侵入性操作可帶來流產(chǎn)風(fēng)險，而利用血清學(xué)生物標(biāo)記物、超聲等對普通妊娠人群進(jìn)行篩查，篩選出高危人群進(jìn)行產(chǎn)前染色體確診，顯得尤為重要；但是篩查后，約3%～5%的人群仍需進(jìn)行侵入性操作取樣[7]。許多研究表明，血漿cffDNA檢測不受孕周與年齡的限制，為無創(chuàng)產(chǎn)前診斷的較優(yōu)方法。用孕母血漿cffDNA檢測胎兒非整倍體，尤其是T21時，有較高的敏感性和特異性[6]。本研究選擇普通孕婦作為研究人群，應(yīng)用第二代DNA測序技術(shù)對孕母血漿中cffDNA進(jìn)行無創(chuàng)胎兒染色體非整倍體檢測，同時平行進(jìn)行羊水染色體核型分析。

2011年有人發(fā)表了一系列研究cffDNA檢測的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)用cffDNA法對胎兒非整倍體產(chǎn)前檢測的效率較高。Ehrich M等[8]對孕母血漿cffDNA進(jìn)行無創(chuàng)胎兒T21檢測，共檢測480例高危者，結(jié)果顯示，對T21檢測的靈敏度為100%，特異性為99.7%。Chiu RW等[9]發(fā)現(xiàn)，對胎兒T21高風(fēng)險孕婦血漿進(jìn)行cffDNA檢測時較有效、可行。2012年P(guān)alomaki GE等[6]對DNA GC含量進(jìn)行校正后，采用第二代DNA測序方法，對孕母血漿檢測cffDNA，對 T18和 T13檢出率分別為 100%和91.7%，假陽性率分別為0.28%和0.97%；這一方法可使侵入性產(chǎn)前診斷操作率降低95%。ACOG在美國進(jìn)行了一項多中心研究，前瞻性研究評價cffDNA法對孕母血漿胎兒非整倍體診斷的準(zhǔn)確性[10]，結(jié)果較好。

本研究在安徽省立醫(yī)院產(chǎn)科門診采集2596例孕婦的血樣本，血清學(xué)篩查高危者共197例，結(jié)果陽性率為7.59%。高/低齡組間DS高風(fēng)險發(fā)生率差異有統(tǒng)計學(xué)意義，隨著高齡孕婦的增加，唐氏綜合癥篩查陽性率也增加，高齡組DS高風(fēng)險發(fā)生率較高。研究中共收集高危者樣本176例，檢測cffDNA后檢出43例陽性：28例T21；5例T18；1例T13；4例45，XO；3例45，X；2例47，XXY，總陽性率為24.43%；經(jīng)羊水細(xì)胞染色體核型分析證實的染色體非整倍體異常共42例，總陽性率為23.86%;兩種方法結(jié)果基本一致，P＞0.05。

本研究應(yīng)用第二代DNA測序技術(shù)對孕母血漿中cffDNA進(jìn)行無創(chuàng)胎兒染色體非整倍體檢測，顯示了較高的靈敏度和特異性，初步證明cffDNA產(chǎn)前檢測技術(shù)可以檢測常染色體與性染色體等，產(chǎn)前檢測效率較高，質(zhì)量控制較簡單，無年齡依賴性和孕周依賴性，可避免大量不必要的侵入性產(chǎn)前診斷操作；應(yīng)用于孕中期產(chǎn)前篩查時方法可行，但仍需進(jìn)一步大樣本研究。

1 中華人民共和國衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)：胎兒常見染色體異常與開放性神經(jīng)管缺陷的產(chǎn)前篩查與診斷技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)，第1部分:孕中期母血清產(chǎn)前篩查[S]．北京，中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2010：1～9．

2 楊燦鋒，王峻峰，朱云霞，等．15230例孕中期唐氏篩查產(chǎn)前診斷的臨床應(yīng)用價值[J]．實用婦產(chǎn)科雜志，2011，27（2）:142～145．

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Applicativeresearchofnoninvasiveprenatalgenecheckingintheobstetricalclinics

1.Anhui Medical College,Anhui Provice Medical Genetics Center,Hefei 230061,Anhui 2.Anhui Provincial Hospital,Hefei 230001,Anhui XU Bin1,YU Yuan-xun1,ZHANG Xiao-lin2,et al

Objective:To study the sensitivity and specificity of using new gene DNA sequencing method to check the cffDNA in their mother's plasma for the chromosome abnormality,and to compare the results with the results of amniotic fluids karyotyping.Methods:The bloods of 2596 pregnant women from the clinic of the Anhui Province Hospital from January 2013 to July 2014 were screened applying DS serelogical screening method,12-plex high rate Hiseq 2000 checking,we found the cffDNA positive samples that were analyzed by amniotic fluids karyotyping again.Results:From the 2596 pregnant women,we found 197 high riskers（7.59%）,from 176 high riskers were cffDNA positive（24.43%）,from 176 high riskers,we found that 42 high riskers were abnormal karyotype（23.86%）,The two methods can get nearly same result.Conclusion:Checking the cffDNA from their mother's plasmas is the noninvasive prenatal diagnostic method with high sensitivity.

Noninvasive prenatal diagnosis；Down's syndrome;cffDNA;Kryotype

R473．71

A

1671-8054（2015）06-0089-03

/（編審：吳大保 施仲賦）

1.安徽醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校安徽省遺傳醫(yī)學(xué)中心 合肥 230061 2.安徽省立醫(yī)院產(chǎn)科 合肥 230001

安徽高校省級自然科學(xué)研究項目（編號：KJ2014A128）

徐彬，男，副研究員

2015-10-07收稿，2015-11-13修回