苗藥吊石苣苔的抑菌活性研究

汪志勇，江 峰，徐 紅*，徐 科

(貴州醫(yī)科大學(xué)，貴州貴陽(yáng) 550004)

摘要[目的]研究苗藥吊石苣苔的抑菌活性。[方法]采用體外微生物敏感試驗(yàn)，測(cè)定吊石苣苔不同溶劑提取物的體外抑菌活性。[結(jié)果]正丁醇提取物對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、多殺性巴氏桿菌均有抑制效果，其中對(duì)大腸桿菌的抑制活性顯著，其抑菌圈直徑、最低抑菌濃度(MIC)分別為10.39 mm和3.2 mg/ml；乙酸乙酯提取物對(duì)受試細(xì)菌均具有抑菌效果，特別對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制活性顯著，其抑菌圈直徑、最低抑菌濃度(MIC)分別為12.31 mm和0. 8 mg/ml；而石油醚提取物僅對(duì)金黃色葡萄球菌有較弱抑制作用；水浸提物除對(duì)大腸桿菌、多殺性巴氏桿菌有抑制作用外，對(duì)其他菌株也無(wú)抑制作用。[結(jié)論]吊石苣苔具有較強(qiáng)的抑菌作用，其體外抑菌活性部分主要分布在正丁醇、乙酸乙酯相。

關(guān)鍵詞吊石苣苔；苗藥；抑菌活性；抑菌圈；最小抑菌濃度

中圖分類號(hào)S567

基金項(xiàng)目貴州省科技廳聯(lián)合基金(黔科合LH字[2014]7080)；貴州省教育廳自然科學(xué)研究項(xiàng)目(黔教科研發(fā)〔2013〕405 號(hào))；貴州省中醫(yī)藥管理局(QZYY2013-89)。

作者簡(jiǎn)介汪志勇(1981-)，男，貴州遵義人，副教授，碩士，從事天然產(chǎn)物的提取和分離研究。*

收稿日期2015-06-03

Antibacterial Activities of Extracts from Miao EthnomedicineLysionotuspauciflorus

WANG Zhi-yong, JIANG Feng, XU Hong*et al (Guizhou Medical University, Guiyang, Guizhou 550004)

Abstract[Objective] The purpose was to research antibacterial activities of extracts from Miao Ethnomedicine Lysionotus pauciflorus. [Method] Using microbial sensitivity test in vitro, antibacterial activities of extracts from Miao Ethnomedicine Lysionotus pauciflorus were determined. [Result] It was showed that the extracts of N-butanol from Miao Ethnomedicine Lysionotus pauciflorus has antibacterial activity to Escherichia coli, Staphylococcus aureus and Pasteurella multocida, the best antibacterial activity was Escherichia coli. Inhibition zone diameter and the minimum inhibitory concentration (MIC) were 10.39 mm and 3.2 mg/ml; Yet the extracts of ethyl acetate from Miao Ethnomedicine Lysionotus pauciflorus has antibacterial activity specially to Staphylococcus aureus. Inhibition zone diameter and the minimum inhibitory concentration (MIC) were 12.31 mm and 0.8 mg/ml. But petroleum ether has a weak of antibacterial activity only to Staphylococcus aureus. Except Escherichia coli and Pasteurella multocida, the extracts of water from Miao Ethnomedicine Lysionotus pauciflorus has nothing. [Conclusion] Miao Ethnomedicine Lysionotus pauciflorus has a significant of antibacterial activity mainly in N-butanol and ethyl acetate.

Key wordsLysionotuspauciflorus; Miao Ethnomedicine; Antibacterial activities; Inhibitory circle; MIC

苗藥是苗族人民在漫長(zhǎng)的生產(chǎn)、生活實(shí)踐中預(yù)防和治療疾病經(jīng)驗(yàn)的高度總結(jié)，是人類醫(yī)學(xué)寶庫(kù)的財(cái)富。文獻(xiàn)報(bào)道認(rèn)為，苗藥不管是單味藥還是復(fù)方藥，其化學(xué)成分是具有多種結(jié)構(gòu)類型的化合物庫(kù)，且臨床療效確切，它的作用可能是多種藥理活性相互協(xié)調(diào)的結(jié)果，傳統(tǒng)民族藥經(jīng)現(xiàn)代科技手段進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)更多的藥理作用[1]。在貴州省凱里少數(shù)民族地區(qū)進(jìn)行調(diào)研時(shí)，筆者發(fā)現(xiàn)當(dāng)?shù)孛玑t(yī)習(xí)用桿努盡煙(苗名音譯)治療支氣管炎、感冒咳嗽、肺炎、肺結(jié)核、無(wú)名腫毒等，療效顯著。采集的標(biāo)本經(jīng)貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院有關(guān)專家進(jìn)行了原植物鑒定，發(fā)現(xiàn)桿努盡煙為苦苣苔科吊石苣苔。通過野外調(diào)查，發(fā)現(xiàn)該藥用植物主要分布在鴨塘鎮(zhèn)、龍場(chǎng)鎮(zhèn)的香爐山、爐山、凱堂、旁海、大風(fēng)洞、萬(wàn)潮、灣水、三棵樹的巴拉河，生長(zhǎng)于海拔600～800 m的山谷陡坡石灰?guī)r陰濕處的石壁上或附生于森林的古樹上。文獻(xiàn)資料也顯示貴州全省均有分布且很豐富，系苗族習(xí)用藥材[2-3]，還廣泛分布于我國(guó)南方，如云南東部、四川、貴州、廣西等省區(qū)[3-5]。

經(jīng)貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院相關(guān)專家鑒定桿努盡煙為苦苣苔科(Gesneriaceae)吊石苣苔屬 (L ysionotus)植物吊石苣苔的全草(Lysionotuspauciflorus)。全株入藥，有清肺化痰、涼血止血、祛濕化滯、通絡(luò)止痛作用，在苗族民間還用于治療淋巴結(jié)核病。臨床用于治療淋巴結(jié)核、慢性支氣管炎、吐血、跌打損傷、肺熱咳嗽、崩帶、菌痢、疳積、風(fēng)濕痹痛，療效顯著，無(wú)毒副作用。市場(chǎng)上以苦苣苔科吊石苣苔為主要原料的產(chǎn)品有“復(fù)方巖連片”、“馬蘭感寒膠囊”和“石吊蘭制劑”等。目前對(duì)吊石苣苔化學(xué)成分的研究并不多，報(bào)道了部分有機(jī)成分，如黃酮類、苯乙醇類、脂肪醇類、β-谷甾醇、熊果酸等[6-8]；藥理活性方面也僅側(cè)重報(bào)道了其中的成分——石吊蘭素的抗結(jié)核菌作用[9]。因此吊石苣苔的藥用價(jià)值仍需進(jìn)一步深入研究和開發(fā)利用。該研究選取吊石苣苔為研究對(duì)象，利用不同極性的溶劑對(duì)桿努盡煙的乙醇提取物進(jìn)行萃取，獲得不同溶劑提取物；以民間用藥時(shí)針對(duì)的病癥為藍(lán)本，進(jìn)行吊石苣苔提取物的抑菌作用研究，并對(duì)抑菌活性進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，為進(jìn)一步探索其藥理作用機(jī)制打下基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1藥材。吊石苣苔的全草采自貴州省凱里市爐山鎮(zhèn)五里橋村，經(jīng)貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院相關(guān)專家鑒定為吊石苣苔屬植物吊石苣苔。

1.1.2菌種。大腸桿菌(Escherichiacoli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、多殺性巴氏桿菌(Pasteurellamultocida)。由貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究中心提供。

1.1.3培養(yǎng)基。MH培養(yǎng)基、RPMI 1640 液體培養(yǎng)基。

1.1.4試劑。石油醚、乙酸乙酯、正丁醇，均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.5儀器。RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)、SHB-III型循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司)、生物安全柜、紫外分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限公司)、熱恒溫培養(yǎng)箱、超凈工作臺(tái)。

1.2方法

1.2.1供試樣品的制備。將干燥的吊石苣苔粉碎，稱取2.0 kg，常溫下以6.0 L 95%乙醇浸取15 d，固液分離，將濾液旋蒸回收乙醇，得到總浸膏?？偨嗟谷? L水中振搖后，按照極性從小到大順序，依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取，直至上清液近無(wú)色，分別得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物、水溶性部分，各極性部位的萃取液旋蒸，得到各部位浸膏，常溫晾干。

取水浸提取的浸膏0.1 g，溶于1 ml無(wú)菌水中，制備為100 mg/ml溶液，待用。取石油醚浸膏、乙酸乙酯浸膏、正丁醇浸膏各0.1 g，分別溶于1 ml二甲基甲酰胺，使其充分溶解，均制備為100 mg/ml溶液，待用。

1.2.2各部分粗提物抑菌活性檢測(cè)。

1.2.2.1細(xì)菌懸液制備。金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、多殺性巴氏桿菌、枯草芽孢桿菌采用MH培養(yǎng)基培養(yǎng)。將受試菌種接入相應(yīng)的液體培養(yǎng)基上，在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2 d，將各菌種濃度調(diào)至細(xì)菌細(xì)胞密度(OD600)約為1，待用。

1.2.2.2含菌培養(yǎng)基制備。用移液槍吸取各種細(xì)菌懸液100 μl于MH培養(yǎng)基中，用無(wú)菌三角涂布棒涂布均勻，待干后倒置于37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察培養(yǎng)結(jié)果。

1.2.2.3抑菌效果測(cè)定。采用濾紙片擴(kuò)散法[10]測(cè)定抑菌圈，按無(wú)菌操作規(guī)程[11]將預(yù)先滅菌烘干的濾紙片(直徑為8 mm)分別放在100 mg/ml的萃取物溶液及空白對(duì)照的溶劑中浸泡30 min，適度揮干溶劑，然后放在含菌培養(yǎng)基上，同時(shí)用浸有相應(yīng)溶劑的濾紙片做陰性對(duì)照，每處理3次重復(fù)。將加有細(xì)菌懸液的平板放入37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，觀察抑菌效果，并測(cè)定抑菌圈直徑。

1.2.2.4抑菌濃度測(cè)定。在96孔板上，第1孔加100 μl原藥液；從第2孔開始用RPMI 1640 液體培養(yǎng)基將原藥液對(duì)半稀釋成各種濃度(100.0、50.0、25.0、12.5、6.2、3.2、1.6、0.8、0.4、0.2 mg/ml)，加100 μl的菌懸液；第11孔加200 μl的菌懸液；第12孔加200 μl的RPMI 1640培養(yǎng)液。37 ℃溫箱中培養(yǎng)24 h后觀察，以肉眼觀察澄清孔的最小稀釋倍數(shù)為藥物的最小抑菌濃度(MIC)。

2結(jié)果與分析

2.1吊石苣苔不同溶劑提取物的抑菌效果利用“1.2”試驗(yàn)方法處理供試樣品并進(jìn)行相關(guān)檢測(cè)，獲得吊石苣苔不同溶劑提取物的抑菌圈直徑，從表1可看出，吊石苣苔不同溶劑提取物對(duì)各種受試菌的抑菌活性是不同的，正丁醇提取物對(duì)大腸桿菌抑制作用最強(qiáng)，抑菌圈直徑>10 mm，并對(duì)金黃色葡萄球菌有抑制作用；乙酸乙酯提取物對(duì)金黃色葡萄球菌抑制作用最強(qiáng)，抑菌圈直徑>10 mm，對(duì)其他細(xì)菌均有抑菌作用；石油醚提取物對(duì)金黃色葡萄球菌有抑制作用；水浸提物對(duì)金黃色葡萄球菌、多殺性巴氏桿菌有抑制作用。

2.2吊石苣苔不同溶劑提取物MIC比較由表2可見，正丁醇提取物對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、多殺性巴氏桿菌均有抑制效果，最低抑菌濃度(MIC)分別為3.2、6.2、12.5 mg/ml；乙酸乙酯提取物對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、多殺性巴氏桿菌、枯草芽孢桿菌均有抑制效果，其中對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制效果較好，最低抑菌濃度為0.8 mg/ml；石油醚提取物對(duì)金黃色葡萄球菌有一定的抑制作用，最低抑菌濃度為50.0 mg/ml，對(duì)其他的受試菌無(wú)抑制效果；水浸提物對(duì)大腸桿菌、多殺性巴氏桿菌有一定的抑制效果，最低抑菌濃度分別為12.5、25.0 mg/ml，對(duì)其他受試菌無(wú)抑制效果。

表1　吊石苣苔不同溶劑提取物抑菌圈直徑

注：抑菌圈直徑為3次試驗(yàn)的平均值?！?”表示無(wú)抑菌圈。

表2　吊石苣苔不同溶劑提取物最低抑菌濃度( MIC)

注：“-”表示抑菌濃度>100 mg/ml。

3小結(jié)與討論

該試驗(yàn)采用體外微生物敏感試驗(yàn)，測(cè)定和比較了苗藥吊石苣苔不同溶劑提取物的體外抑菌作用，結(jié)果表明，正丁醇提取物對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、多殺性巴氏桿菌均有抑制活性，其中對(duì)大腸桿菌的抑制效果顯著，其抑菌圈直徑、最低抑菌濃度(MIC)分別為10.39 mm和3.2 mg/ml；乙酸乙酯提取物對(duì)受試的細(xì)菌均具有抑菌活性，特別對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制效果顯著，其抑菌圈直徑、MIC分別為12.31 mm和0.8 mg/ml；而石油醚提取物僅對(duì)金黃色葡萄球菌有較弱抑制作用；水浸提物除對(duì)大腸桿菌、多殺性巴氏桿菌有較弱抑制作用外，對(duì)其他菌株無(wú)抑制作用。說(shuō)明吊石苣苔的抑菌活性部分主要分布在正丁醇、乙酸乙酯相。有關(guān)吊石苣苔抑菌作用的藥理機(jī)理及活性化合物的進(jìn)一步分離和純化，還有待深入研究。

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