代建麗+周斯荻+劉銘軒等

摘 要：以水提醇沉法提取白芨多糖，應(yīng)用濾紙片法研究白芨多糖對(duì)大腸桿菌、變形桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的生長(zhǎng)抑制作用，并測(cè)定大腸桿菌菌液的電導(dǎo)率、堿性磷酸酶含量和蛋白質(zhì)含量探討白芨多糖的抑菌機(jī)理。結(jié)果表明，白芨多糖對(duì)4種菌的生長(zhǎng)均有抑制作用，20mg/mL的白芨多糖抑菌效果較好，白芨多糖可導(dǎo)致大腸桿菌細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的通透性增大，引起細(xì)胞內(nèi)容物外泄而起到抑菌作用。

關(guān)鍵詞：白芨多糖；抑菌活性；抑菌機(jī)理

中圖分類號(hào) Q946.3 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-7731（2015）19-19-03

Study on the Antibacterial Activity of Bletilla striata Polysaccharide

Dai Jianli et al.

（College of Life Science，Wuchang University of Technology，Wuhan 430223，China）

Abstract：Water-soluble polysaccharides were separated from Bletilla striata by hot-water extraction and its antibacterial activity against Escherichia coli，Proteus vulgaris，Staphyloccocus aureus and Bacillus subtilis were studied with filter method. The changes in electric conductivity，alkaline phosphatase（AKP）content and protein concentration in the medium were measured to study the antibaeterial mechanism. Results showed that the polysaccharides of Bletilla striata had antibacterial activity against the four bacteria and had strong inhibition effect at the concentration of 20mg/mL. The permeability of cell membrane and cell wall of Escherichia coli were increased after treated with Bletilla striata polysaccharide，which resulted in the release of cell components.

Key words：Bletilla striata polysaccharide；Antibacterial activity；Antibaeterial mechanism

中藥白芨為蘭科植物白芨（Bletilla striata（Thunb.）Reichb.f.）的干燥塊莖，具有收斂止血、消腫生肌之功效，臨床上廣泛用于治療咳血、吐血、潰瘍疼痛、手足皸裂等癥?，F(xiàn)代研究顯示，白芨的主要藥用成分為白芨膠，又稱白芨多糖[1]。白芨甘露聚糖膠漿對(duì)人上消化道出血有良好的止血療效[2]。白芨多糖能促進(jìn)大鼠背部切割傷創(chuàng)面的創(chuàng)傷愈合[3]，并能促進(jìn)大鼠應(yīng)激性胃潰瘍的愈合[4]。但是，有關(guān)白芨抑菌作用的研究較少。目前有少量研究表明白芨提取物具有抑菌效果，Michinori等發(fā)現(xiàn)白芨的乙醇浸提液對(duì)黃色葡萄糖菌和枯草桿菌有抑制作用[5]，陳玉等發(fā)現(xiàn)白芨水煎劑能抑制變形鏈球菌的生長(zhǎng)[6]，白芨中起抑菌作用的有效成分及其抑菌機(jī)理尚缺乏研究。植物多糖作為一類重要的生物活性物質(zhì)，已在許多種屬中被證明具有抑菌作用[7-10]。本實(shí)驗(yàn)對(duì)白芨多糖的抑菌作用和機(jī)理進(jìn)行了初步研究，以拓展中藥白芨的藥用范圍。

1 材料與方法

1.1 材料 白芨購(gòu)自武漢國(guó)藥股份有限公司中藥飲片廠；金黃色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus）、枯草芽抱桿菌（Bacillus subtilis）、大腸桿菌（Escherichia coli）、變形桿菌（Proteus vulgaris）購(gòu)于武漢大學(xué)中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，武昌理工學(xué)院生科院實(shí)驗(yàn)室活化保存。

1.2 方法

1.2.1 白芨多糖的提取及含量測(cè)定 白芨飲片粉碎、過(guò)篩，稱取30g，按1∶20（W/V）比例加入蒸餾水，80℃浸提2h，重復(fù)提取3次，合并提取液，過(guò)濾，濾液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中減壓濃縮至稠膏狀，加3倍體積95%乙醇沉淀。過(guò)濾，取沉淀，加10mL蒸餾水溶解，Sevag法脫蛋白，透析，再次加入3倍體積95%乙醇沉淀。過(guò)濾，取沉淀，50℃干燥得白芨多糖。以葡萄糖制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，苯酚硫酸法測(cè)定多糖含量[11]。

1.2.2 白芨多糖的抑菌試驗(yàn) 將大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和變形桿菌用LB活化，同時(shí)將白芨多糖稀釋成5mg/mL、10mg/mL、20mg/mL、40mg/mL4種濃度的多糖溶液，過(guò)濾除菌備用。試驗(yàn)時(shí)采用濾紙片法[7]測(cè)定白芨多糖的抑菌效果，以無(wú)菌水為陰性對(duì)照，25μg/mL氯霉素為陽(yáng)性對(duì)照，4種多糖溶液為處理組進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，菌液濃度為108CFU/mL。以抑菌圈的大小表示抑菌活性的大小。

1.2.3 白芨多糖對(duì)大腸桿菌細(xì)胞膜通透性的影響 將白芨多糖用適量蒸餾水溶解，過(guò)濾除菌，加入到LB液體培養(yǎng)基中使其終濃度40mg/mL備用。將震蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的大腸桿菌菌液調(diào)整濃度為108CFU/mL，轉(zhuǎn)入加有白芨多糖的LB培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)，分別于0、1h、2h、3h、4h測(cè)定菌液的電導(dǎo)率[12]，以不加白芨多糖的培養(yǎng)基為對(duì)照。

1.2.4 白芨多糖對(duì)大腸桿菌細(xì)胞壁通透性的影響 將白芨多糖加入到LB液體培養(yǎng)基中使其終濃度為40mg/mL。調(diào)整培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的大腸桿菌菌液使其濃度為108CFU/mL，轉(zhuǎn)入到含有40mg/mL白芨多糖的LB培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)，分別于0、1h、2h、3h、4h取樣5mL，3 500r/min離心10min，取上清液20μL用堿性磷酸酶檢測(cè)試劑盒和酶標(biāo)儀測(cè)定堿性磷酸酶的含量[13]，以不加白芨多糖的培養(yǎng)基為對(duì)照，酶活性單位為DEA單位。

1.2.5 白芨多糖對(duì)大腸桿菌培養(yǎng)液中蛋白質(zhì)濃度的影響 將白芨多糖加入到LB液體培養(yǎng)基中使其終濃度為40mg/mL。調(diào)整培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的大腸桿菌菌液使其濃度為108CFU/mL，轉(zhuǎn)入到含有40mg/mL白芨多糖的LB培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)，分別于0、1h、2h、3h、4h用Bradford法測(cè)定菌液中的蛋白質(zhì)含量[14]，以不加白芨多糖的培養(yǎng)基為對(duì)照。

2 結(jié)果

2.1 白芨多糖的提取及含量測(cè)定 采用水提醇沉法從30g白芨飲片粉末中獲得5.56g白芨粗多糖，苯酚硫酸法測(cè)得多糖質(zhì)量為4.62g，粗多糖中多糖含量為83.1%，多糖得率為15.4%。

2.2 白芨多糖的抑菌效果 采用濾紙片法測(cè)定白芨多糖對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和變形桿菌的抑菌作用，以25μg/mL氯霉素為陽(yáng)性對(duì)照，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在40mg/mL濃度范圍內(nèi)，白芨多糖對(duì)四種菌的生長(zhǎng)都有一定的抑制作用。在低濃度即多糖濃度為5mg/mL時(shí)白芨多糖對(duì)四種菌的抑制作用均不明顯，糖濃度為10mg/mL時(shí)對(duì)枯草芽孢桿菌和變形桿菌表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制作用，20mg/mL時(shí)對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制作用，高濃度即多糖濃度為40mg/mL時(shí)對(duì)大腸桿菌和枯草芽孢桿菌表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制作用，其中，白芨多糖對(duì)大腸桿菌的抑制作用超過(guò)了陽(yáng)性對(duì)照氯霉素（圖1）。

[A][B][C][D][E][F]

A：陰性對(duì)照；B：氯霉素陽(yáng)性對(duì)照；C：大腸桿菌；D：變性桿菌；

E：枯草芽孢桿菌；F：金黃色葡萄桿菌

圖1 白芨多糖對(duì)四種細(xì)菌的抑菌效果

2.3 白芨多糖對(duì)大腸桿菌細(xì)胞膜通透性的影響 經(jīng)白芨多糖處理后，大腸桿菌培養(yǎng)液的電導(dǎo)率值明顯高于對(duì)照，在2h時(shí)最為顯著，且隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，培養(yǎng)液的電導(dǎo)率持續(xù)增加且均高于對(duì)照，表明白芨多糖能引起大腸桿菌細(xì)胞膜的通透性改變，使細(xì)胞膜透性增大導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的離子外滲（圖2）。

圖2 白芨多糖對(duì)大腸桿菌細(xì)胞膜通透性的影響

圖3 白芨多糖對(duì)大腸桿菌細(xì)胞壁通透性的影響

2.4 白芨多糖對(duì)大腸桿菌細(xì)胞壁通透性的影響堿性磷酸酶存在于細(xì)菌細(xì)胞壁與細(xì)胞膜之間，正常情況下該酶不能透過(guò)細(xì)胞壁滲透到細(xì)胞外。在大腸桿菌培養(yǎng)液中添加白芨多糖后，菌液的堿性磷酸酶含量呈現(xiàn)先升后降趨勢(shì)，在培養(yǎng)2h時(shí)達(dá)到最大值，以后呈下降趨勢(shì)，但均高于對(duì)照，說(shuō)明白芨多糖能夠破壞細(xì)菌細(xì)胞壁的完整性，在短時(shí)間內(nèi)造成細(xì)菌細(xì)胞壁通透性增加（圖3）。

2.5 白芨多糖對(duì)大腸桿菌培養(yǎng)液中蛋白質(zhì)濃度的影響 在大腸桿菌培養(yǎng)液中添加白芨多糖后，菌液的蛋白質(zhì)含量在4h內(nèi)一直呈上升趨勢(shì)，且顯著高于對(duì)照，說(shuō)明白芨多糖引起了大腸桿菌胞內(nèi)蛋白質(zhì)的外滲。胞內(nèi)蛋白的外滲進(jìn)一步說(shuō)明大腸桿菌細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的通透性變大，細(xì)胞內(nèi)的一些大分子物質(zhì)可以滲出細(xì)胞。由于提取的白芨多糖沒(méi)有進(jìn)一步純化，其中含有少量的蛋白質(zhì)雜質(zhì)，約為2.93μg/mL，樣品組0h的A595值要高于對(duì)照（圖4）。

圖4 白芨多糖對(duì)大腸桿菌菌液蛋白質(zhì)含量的影響

3 討論

報(bào)道表明，很多植物的多糖具有抑菌作用，其作用濃度為1%～25mg/mL[7-10]，其中葛根多糖和大豆多糖對(duì)大腸桿菌的最小抑菌濃度均為8mg/mL。本實(shí)驗(yàn)據(jù)此設(shè)計(jì)了5mg/mL、10mg/mL、20mg/mL、40mg/mL4種多糖濃度，考察白芨多糖對(duì)常見(jiàn)的革蘭氏陽(yáng)性菌金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌及革蘭氏陰性菌大腸桿菌、變形桿菌的作用效果，結(jié)果表明，5mg/mL的白芨多糖無(wú)抑菌效果，較高濃度即20mg/mL多糖對(duì)4種菌具有較強(qiáng)的抑制作用。白芨多糖的有效抑菌濃度偏高，并顯著高于茶多酚[14]、蒲公英黃酮[15]等其他類型的次生物質(zhì)。

藥物的抑菌機(jī)制包括干擾細(xì)菌細(xì)胞壁的合成、抑制細(xì)菌核酸、蛋白質(zhì)的合成及損傷細(xì)菌的細(xì)胞膜等。本實(shí)驗(yàn)表明，白芨多糖能改變大腸桿菌細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的通透性，使其通透性增大，使細(xì)胞代謝發(fā)生紊亂而抑制其生長(zhǎng)。電導(dǎo)率、堿性磷酸酶、胞外蛋白含量的變化規(guī)律與已有的研究基本一致[12-15]，在時(shí)間節(jié)點(diǎn)上略有不同。電導(dǎo)率的對(duì)照組2h時(shí)菌液的電導(dǎo)值下降，可能是由大腸桿菌吸收利用培養(yǎng)液中的NaCl引起，實(shí)驗(yàn)組大腸桿菌在利用NaCl時(shí)胞內(nèi)離子有外滲，因此沒(méi)有出現(xiàn)電導(dǎo)值的顯著變化。白芨多糖是否存在其他的抑菌機(jī)制有待進(jìn)一步研究，多糖的不同組分是否存在功能上的差異也需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)觀察。

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（責(zé)編：張長(zhǎng)青）