范素芳， 李 強 ， 馬俊美， 李 揮， 張 巖

（河北省食品檢驗研究院，河北省食品安全重點實驗室，河北 石家莊050091）

二甲基黃、二乙基黃為偶氮類染料，其中二甲基黃又叫對二甲氨基偶氮苯或二甲氨基偶氮苯，常作為酸堿指示劑、非水溶液滴定指示劑及用于胃液中游離鹽酸的測定［1］，二甲基黃還用于銥［2］、碘［3］、銅［4］等元素的測定；二乙基黃作為染劑常添加于汽油、柴油、蠟油、油墨、塑料等物質(zhì)中。2014 年臺灣的“毒豆干”事件將二甲基黃、二乙基黃推到了食品安全的風口浪尖，再次給我們的食品安全敲響了警鐘。張協(xié)光等［5］建立了食品中蘇丹橙G、二甲基黃、蘇丹黑B 的固相萃取-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜方法，樣品經(jīng)含10% 乙醇的丙酮溶液提取，MAX 強陰離子交換固相萃取柱凈化，二甲基黃的檢出限為1.0 μg／kg。但該方法操作比較繁瑣。更多關(guān)于二甲基黃、二乙基黃測定的方法未見報道。因此開發(fā)二甲基黃、二乙基黃快速測定的方法很有必要。

QuEChERS 方法是Anastassiades 等［6］于2003年提出。該方法具有快速、簡單、便宜、高效、可靠和安全等特點。QuEChERS 方法適用于不含脂肪的食物（脂肪含量低于2%，如水果、蔬菜）和低脂肪的食物（脂肪含量2% ～20%，如牛奶、雞蛋和油梨）［7］。近年來，QuEChERS 方法已經(jīng)廣泛應用于蔬菜、水果中農(nóng)藥殘留檢測及水產(chǎn)品中獸藥的分析測定［8-10］。

本實驗建立了基于QuEChERS 方法結(jié)合液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜快速測定腐竹、豆干中甲基黃和二乙基黃的方法。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Q-TRAP 5500 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（AB 公司，美國），配有加熱電噴霧離子源（H-ESI 源）；UFLC 液相色譜系統(tǒng)（島津公司，日本）；Sigma 3K13 離心機（Sigma 公司，德國）；渦旋儀（IKA，德國）。

乙腈（色譜純，F(xiàn)isher Scientific 公司，美國）；NaCl（分析純，北京化學試劑公司）；去離子水由Milli-Q 系統(tǒng)（Millipore 公司，美國）制備；二甲基黃、二乙基黃標準品（純度≥98.5%，Supelco Analytical 公司）；N-丙基二乙胺（primary secondary amine，PSA，Agilent 公司，美國）。

標準溶液的配制：準確稱取二甲基黃、二乙基黃標準品10.0 mg（精確至0.01 mg）于10 mL 容量瓶中，用乙腈溶解定容，配制成1 000 mg／L 標準儲備液，于-20 ℃保存。用乙腈稀釋標準儲備液，配制質(zhì)量濃度為10 mg／L 的標準工作溶液，于4 ℃保存，備用。用空白提取液稀釋標準儲備液，配制系列質(zhì)量濃度的基質(zhì)混合工作液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.2 提取與凈化

分別稱取腐竹、豆干樣品2.0 g 于50 mL 離心管中，加入5 mL 去離子水，混勻后加入10 mL 乙腈，渦旋混勻1 min；加入1.0 g NaCl、2.0 g 無水硫酸鎂，渦旋混勻1 min 后于10 000 r／min 離心5 min；取1 mL 上清液于2 mL 離心管中，加入50 mg PSA，渦旋30 s，于10 000 r／min 下離心1 min；取上清液過0.22 μm 有機濾膜，濾液待測定。

1.3 LC-MS／MS 條件

1.3.1 LC 條件

采用配有Phenomenex C18分析柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）的超高效液相色譜系統(tǒng)分離分析物，以乙腈（A）和含有0.1% （v／v）甲酸的水溶液（B）為流動相，流速為0.3 mL／min，采用梯度洗脫模式：A 相初始比例為60%，保持1 min；4 min 時A相比例線性增加至90%，保持2 min；6.1 min 時，A相比例降至60%，平衡色譜柱1.9 min。進樣量為2 μL，分析時間為8 min。

1.3.2 質(zhì)譜條件

H-ESI 正離子電離，源溫度500 ℃；噴霧電壓5 500 V；氣簾氣流速30 L／min；輔助氣1（GS1）流速50 L／min，輔助氣2（GS2）流速50 L／min。采用多反應監(jiān)測（MRM）模式，監(jiān)測離子及質(zhì)譜參數(shù)見表1。二甲基黃和二乙基黃的化學結(jié)構(gòu)及MRM 譜圖見圖1。

表1 二甲基黃和二乙基黃的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 MS parameters of dimethyl yellow and diethyl yellow

2 結(jié)果與討論

2.1 QuEChERS 方法的改良

圖1 二甲基黃和二乙基黃的化學結(jié)構(gòu)及MRM 質(zhì)譜圖Fig.1 Chemical structures and MRM mass spectra of dimethyl yellow and diethyl yellow

QuEChERS 方法最初是針對水果、蔬菜等含水量高于80% 的基質(zhì)開發(fā)的樣品處理方法，因此處理含水量低于25% 的樣品基質(zhì)時需要減少稱樣量并添加一定體積的水以保證待分析物的提取效率［11］。本試驗考察了去離子水用量分別為0、2 和5 mL，添加水平為2 μg／kg 時二甲基黃和二乙基黃的回收率，結(jié)果見表2?？梢?，2.0 g 腐竹、豆干樣品用5 mL 去離子水浸泡后再用乙腈提取的提取效果更好。原始的QuEChERS 方法為：稱取10 g 樣品，加入10 mL 乙腈提取，加入4 g 無水硫酸鎂和1 g 氯化鈉液液分離。本試驗將其改進為：在2.0 g 樣品中加入5 mL 水浸泡，加入10 mL 乙腈提取，加入2.0 g 無水硫酸鎂和1.0 g 氯化鈉液液分離。本試驗未對無水硫酸鎂的用量進行進一步的優(yōu)化。

表2 不同加水量對不同基質(zhì)中目標物提取回收率的影響Table 2 Influence of different dosages of water added in the samples on the recoveries of the analytes in different matrices

多壁碳納米管具有較大的比表面積，所以具有較強的吸附作用可以有效去除色素等干擾物，近年來已經(jīng)開始應用于農(nóng)藥殘留分析中［12-14］。本試驗比較了PSA 與多壁碳納米管的凈化效果，其中PSA的用量為每毫升提取液50 mg，多壁碳納米管的用量為每毫升提取液10 mg。結(jié)果表明，多壁碳納米管對二甲基黃、二乙基黃均有吸附作用，多壁碳納米管加入時方法的回收率低于20%，這與二甲基黃、二乙基黃的化學結(jié)構(gòu)有關(guān)，而且與文獻［15］結(jié)果（分析物結(jié)構(gòu)中由兩個以上環(huán)或者帶苯并雜環(huán)的，用多壁碳納米管凈化時回收率偏低）吻合。所以試驗采用PSA 分散固相萃取凈化材料進行凈化。

2.2 方法驗證

2.2.1 基質(zhì)效應

基質(zhì)是樣品中分析物以外的組分，與分析物共洗脫出的樣品基質(zhì)會干擾分析物的離子化過程，造成離子化抑制或增強，產(chǎn)生基質(zhì)效應（ME）［16］?；|(zhì)效應是Paul 和Tang［17］在1993 年研究電噴霧原理時發(fā)現(xiàn)的?；|(zhì)效應會影響方法的檢出限、定量限、準確度和精密度等［18］。

二甲基黃、二乙基黃在腐竹和豆干中的基質(zhì)效應通過溶劑標準溶液和基質(zhì)匹配標準溶液在線性范圍內(nèi)的斜率比進行評價。按下列公式計算ME：

式中：Slopematrix為基質(zhì)匹配標準曲線的斜率，Slopesolvent為溶劑標準曲線的斜率。

基質(zhì)效應大于100% 時，表明存在離子化增強效應；基質(zhì)效應小于100% 時，表明存在離子化抑制效應。二甲基黃、二乙基黃的基質(zhì)效應見表3。二甲基黃、二乙基黃在腐竹、豆干中的基質(zhì)效應分別為83.6%、87.2% 和79.7%、71.4%，都為離子化抑制作用，其中豆干中的離子化抑制程度高于腐竹。由于基質(zhì)效應的存在，我們采用基質(zhì)匹配的標準溶液來定量以抵消基質(zhì)效應的干擾。

表3 分析物的保留時間、溶劑標準曲線方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍、基質(zhì)效應、檢出限和定量限Table 3 Retention times，standard curve equations （matrix），correlation coefficients （R2），linear ranges，matrix effects，limits of detection and limits of quantification of the analytes

2.2.2 方法的線性方程、檢出限和定量限

本實驗采用基質(zhì)匹配標準曲線定量以補償基質(zhì)效應。分別在腐竹、豆干空白提取液中添加標準溶液配制0.01 ～1 μg／L 范圍內(nèi)7 個濃度的基質(zhì)匹配標準樣品，以目標物的定量離子峰面積（Y）為縱坐標，以各組分的質(zhì)量濃度X（μg／L）為橫坐標做標準曲線。二甲基黃、二乙基黃的保留時間分別為4.76 min 和5.05 min，二甲基黃、二乙基黃的線性方程、檢出限、定量限見表3。結(jié)果表明，二甲基黃在0.03～1 μg／L，二乙基黃在0.01 ～1 μg／L 范圍內(nèi)，兩種基質(zhì)中標準曲線的線性相關(guān)系數(shù)為0.999 1 ～0.999 8。二甲基黃的檢出限（S／N ＝3）、定量限（S／N＝10）分別為0.1 μg／kg 和0.3 μg／kg，二乙基黃的檢出限（S／N＝3）、定量限（S／N ＝10）分別為0.05 μg／kg 和0.1 μg／kg。添加水平為1 μg／kg 時，二甲基黃、二乙基黃在腐竹、豆干中的色譜-質(zhì)譜圖分別見圖2 和圖3。

圖2 腐竹中二甲基黃、二乙基黃的（a）總離子流和（b，c）MRM 譜圖（添加水平1 μg／kg）Fig.2 （a）TIC and （b，c）MRM chromatograms of dimethyl yellow and diethyl yellow spiked in yuba at 1 μg／kg

圖3 豆干中二甲基黃、二乙基黃的（a）總離子流和（b，c）MRM 譜圖（添加水平1 μg／kg）Fig.3 （a）TIC and （b，c）MRM chromatograms of dimethyl yellow and diethyl yellow spiked in dried beancurd at 1 μg／kg

2.2.3 準確度與精密度

方法的準確度用回收率表示。在空白基質(zhì)中做添加回收試驗，二甲基黃的添加水平分別為0.3、1.0 和10.0 μg／kg，二乙基黃的添加水平分別為0.1、1.0 和10.0 μg／kg，每個添加水平重復測定5次。方法的精密度用5 次平行測定的相對標準偏差（RSD）表示。二甲基黃和二乙基黃的加標回收率范圍分別為73.5% ～84.5% 和70.5% ～81.2%，RSD 低于11% （見表4）。

表4 空白基質(zhì)中二甲基黃和二乙基黃的加標回收率和精密度（n＝5）Table 4 Recoveries and precisions of dimethyl yellow and diethyl yellow spiked in blank matrices （n＝5）

2.3 實際樣品的測定

采用本方法對當?shù)爻兄匈徺I的10 個腐竹、10個豆干樣品中二甲基黃、二乙基黃的含量進行了檢測，結(jié)果在1 個豆干中檢出二甲基黃，但含量低于定量限；其他樣品中均未檢出目標物。

3 結(jié)論

建立了基于改進的QuEChERS 方法結(jié)合液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定腐竹、豆干樣品中二甲基黃和二乙基黃的方法。該方法凈化效果好，準確度、精密度、檢出限、定量限滿足測定要求。該方法可用于腐竹、豆干中二甲基黃和二乙基黃的快速篩查和定量分析。

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