豬圓環(huán)病毒Ⅱ型抗體檢測(cè)ELISA試劑盒的制備

王愛(ài)萍, 李鵬飛， 周景明， 張改平， 祁艷華，扣莉云， 車志芬， 蔣 敏

(鄭州大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 河南 鄭州 450001)

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豬圓環(huán)病毒Ⅱ型抗體檢測(cè)ELISA試劑盒的制備

王愛(ài)萍, 李鵬飛， 周景明， 張改平， 祁艷華，扣莉云， 車志芬， 蔣 敏

(鄭州大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 河南 鄭州 450001)

豬圓環(huán)病毒(PCV)兩個(gè)血清型中只有PCV2為致病性病毒.將ORF2蛋白作為抗原建立區(qū)別兩型PCV的血清學(xué)檢測(cè)方法.去除N端信號(hào)肽的ORF2片段在大腸桿菌中BL21(DE3)中進(jìn)行了表達(dá).SDS-PAGE凝膠電泳表明在26 kD處有一個(gè)明顯的表達(dá)條帶，并且可以和豬圓環(huán)病毒陽(yáng)性血清發(fā)生反應(yīng)，表明重組蛋白表達(dá)成功.以表達(dá)的ORF2蛋白作為包被原，建立了檢測(cè)豬圓環(huán)病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗體的間接ELISA方法.與商品化試劑盒同時(shí)檢驗(yàn)78份臨床血清，符合率為95 %；同時(shí)與豬瘟病毒、豬細(xì)小病毒、豬偽狂犬病毒均無(wú)交叉反應(yīng).

豬圓環(huán)病毒； ORF2； 抗體檢測(cè)； 試劑盒

0 引言

豬圓環(huán)病毒病是由豬圓環(huán)病毒Ⅱ型(porcine circovirus type 2, PCV2)引起的一種豬的重要傳染性疾病，PCV2的感染會(huì)引起免疫抑制，引發(fā)其他疾病的感染，如斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(post weaning multisystemic wasting syndrome, PMWS)、豬呼吸道疾病綜合征(porcine respiratory disease complex, PRDC)、豬皮炎與腎病綜合征(porcine dermatitis and nephropathy syndrome, PDNS)和繁殖障礙[1].

PCV2自被發(fā)現(xiàn)以來(lái)，在世界范圍內(nèi)廣泛流行，對(duì)養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的損失[2].PCV2目前被分為PCV2a、PCV2b和PCV2c 3個(gè)基因型，其中PCV2b的毒力最強(qiáng)，在自然條件下流行范圍最廣[3].堿基突變率較高可能是PCV2流行的一大原因，這也暗示了未來(lái)將會(huì)出現(xiàn)新的PCV2亞型.對(duì)于PCV2的感染，目前尚無(wú)有效的預(yù)防和治療措施，傳統(tǒng)的檢測(cè)方法大多需要復(fù)雜的實(shí)驗(yàn)儀器和操作，僅適用于實(shí)驗(yàn)室檢測(cè).所以，建立一種特異性強(qiáng)、敏感性高、快速簡(jiǎn)便的檢測(cè)方法對(duì)疾病的早期診斷是至關(guān)重要的，可以從根本上有助于相關(guān)疾病的防控.目前，對(duì)PCV2開(kāi)放閱讀框研究較深入的是ORF1和ORF2[4].ORF1編碼的Rep蛋白，與病毒的復(fù)制有關(guān)，其序列非常保守，在兩型PCV中同源性很高[5]；而ORF2編碼的Cap蛋白與病毒的結(jié)構(gòu)有關(guān)，是型特異性抗原，含有和PCV2陽(yáng)性血清反應(yīng)的位點(diǎn)[6].本實(shí)驗(yàn)旨在通過(guò)原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)可溶性的ORF2蛋白作為包被抗原，進(jìn)而研制出一種快速有效的豬圓環(huán)病毒抗體ELISA檢測(cè)試劑盒.

1 材料和方法

1.1 主要試劑和酶

IPTG、卡那霉素購(gòu)自Solarbio公司，HRP標(biāo)記羊抗豬IgG購(gòu)自Abbkine公司，AEC酶底物顯色試劑盒購(gòu)自中彬金橋，預(yù)染Marker購(gòu)自Thermo公司，豬圓環(huán)病毒陽(yáng)性血清和陰性血清購(gòu)自美國(guó)VMRD公司，咪唑購(gòu)自科密歐公司，脫脂奶購(gòu)自上海生工.

1.2 重組ORF2蛋白的表達(dá)及條件優(yōu)化

將載體pET-28a-ORF2轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，從平板上挑取陽(yáng)性克隆，接種于含30 mg/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)過(guò)夜.次日取50 μL菌液接種于5 mL含有30 mg/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)2 h至OD600值為0.6～0.8，加入終濃度為1 mM的IPTG，誘導(dǎo)8 h后取樣.同時(shí)誘導(dǎo)菌種pET-28a-BL21(DE3)作為陰性對(duì)照.SDS-PAGE凝膠電泳鑒定蛋白表達(dá)情況.

1.3 重組ORF2蛋白的可溶性分析

取2 μL重組菌種pET-28a-ORF2-BL21 加入2 mL含30 mg/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)過(guò)夜.次日取1 mL菌液接種于100 mL含有30 mg/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)2 h至OD600值為0.6～0.8，加入IPTG后分別于25 ℃，30 ℃，37 ℃誘導(dǎo)蛋白表達(dá).誘導(dǎo)后，12 000 rpm，離心20 min收集菌體，用裂解緩沖液重懸，于冰水浴中超聲破碎.超聲條件為：超聲3 s，停3 s，工作時(shí)間20 min.將超聲后的產(chǎn)物12 000 rpm，離心20 min，沉淀用PBS重懸，分別取上清、沉淀做SDS-PAGE凝膠電泳，鑒定蛋白可溶性.

1.4 重組ORF2蛋白的純化與鑒定

使用鎳柱親和層析對(duì)可溶性的ORF2蛋白進(jìn)行純化，設(shè)置流速為1 mL/min，使蛋白與層析柱充分結(jié)合.分別用250 mM、500 mM的咪唑洗脫目的蛋白. 將收集到的蛋白液用SDS-PAGE凝膠電泳鑒定其組分.洗脫得到的ORF2蛋白立即放入PBS緩沖液中，透析72 h，期間每4 h換液一次.取20 μL純化過(guò)的蛋白樣品，進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳.染色前，進(jìn)行Western blot分析，其中一抗選用PCV2陽(yáng)性血清.

1.5 PCV2抗體檢測(cè)ELISA方法的建立

1.5.1 抗原包被濃度和血清最佳稀釋度的確定 用CBS梯度稀釋ORF2蛋白，使終濃度分別為20 μg/mL，10 μg/mL，5 μg/mL，2.5 μg/mL，1.25 μg/mL，0.625 μg/mL，0.312 5 μg/mL，每孔50 μL加入96孔酶標(biāo)板，4 ℃包被過(guò)夜.37 ℃封閉后，加入陽(yáng)性和陰性血清.按1∶500,1∶1 000,1∶2 000,1∶4 000,1∶8 000將陰陽(yáng)性血清稀釋后，每孔50 μL加入96孔酶標(biāo)板.PBST洗滌3次后加入稀釋過(guò)的HRP-兔抗豬IgG，每孔50 μL，37 ℃反應(yīng)1 h，加入TMB底物顯色.顯色15 min后加入終止液50 μL終止反應(yīng)，在10 min內(nèi)用酶標(biāo)儀讀出各孔的OD450值.比較陰性血清和陽(yáng)性血清的OD450值，選取陽(yáng)性血清OD450值接近1.0且P/N值最低的一組，作為抗原最佳包被濃度和血清的稀釋度.

1.5.2 最佳包被條件的確定 以已經(jīng)確定的包被濃度包被重組ORF2蛋白，50 μL/孔加入酶標(biāo)板.設(shè)置包被條件分別為：37 ℃ 2 h；4 ℃過(guò)夜；37 ℃ 3 h；37 ℃ 4 h.封閉后，加入最佳稀釋度的陰性和陽(yáng)性血清，其余步驟按照常規(guī)ELISA方法操作.顯色后比較陰性血清和陽(yáng)性血清的OD450值及P/N值，確定抗原包被的最佳條件.

1.5.3 最佳封閉液的確定 以最佳包被濃度包被重組ORF2蛋白，50 μL/孔加入酶標(biāo)板.分別用1 % BSA，5 % BSA，5 %脫脂奶，5 %豬血清37 ℃封閉2 h.其余步驟按照常規(guī)ELISA方法操作.顯色后比較陰性血清和陽(yáng)性血清的OD450值及P/N值，確定最佳封閉液.

1.5.4 一抗血清最佳反應(yīng)時(shí)間的確定 以已經(jīng)確定的包被濃度包被重組ORF2蛋白，50 μL/孔加入96孔酶標(biāo)板.封閉后，將陰陽(yáng)性血清按照已經(jīng)確定的稀釋度加入96孔酶標(biāo)板，設(shè)置血清在37 ℃反應(yīng)時(shí)間為30 min,60 min,90 min，其余步驟按照常規(guī)ELISA方法操作.顯色后比較陰性血清和陽(yáng)性血清的OD450值及P/N值，確定一抗血清最佳反應(yīng)時(shí)間.

1.5.5 酶標(biāo)二抗最佳工作濃度的確定 以已經(jīng)確定的包被濃度包被重組ORF2蛋白，50 μL/孔加入酶標(biāo)板.封閉后，將陰陽(yáng)性血清按照已經(jīng)確定的稀釋度加入96孔酶標(biāo)板，37 ℃孵育后，將酶標(biāo)二抗梯度稀釋，按1∶2 000,1∶5 000,1∶8 000加入96孔酶標(biāo)板.其余步驟按照常規(guī)ELISA方法操作.顯色后比較陰性血清和陽(yáng)性血清的OD450值及P/N值，確定酶標(biāo)二抗最佳稀釋濃度.

1.5.6 酶標(biāo)二抗最佳工作時(shí)間的確定 以已經(jīng)確定的包被濃度包被重組ORF2蛋白，50 μL/孔加入酶標(biāo)板.封閉后，將陰陽(yáng)性血清按照已經(jīng)確定的稀釋度加入96孔酶標(biāo)板，37 ℃孵育.加入最佳稀釋濃度的酶標(biāo)二抗，分別設(shè)置二抗反應(yīng)時(shí)間為30 min,45 min,60 min，其余步驟按照常規(guī)ELISA方法操作.顯色后比較陰性血清和陽(yáng)性血清的OD450值及P/N值，確定酶標(biāo)二抗最佳工作時(shí)間.

1.5.7 顯色時(shí)間的確定 以最佳包被濃度包被重組ORF2蛋白，50 μL/孔加入酶標(biāo)板.封閉后，將陰陽(yáng)性血清按照已經(jīng)確定的稀釋度加入96孔酶標(biāo)板，37 ℃孵育.加入最佳稀釋濃度的酶標(biāo)二抗，37 ℃孵育后，加入TMB底物，設(shè)置顯色時(shí)間分別為5 min,10 min,15 min.顯色后比較陰性血清和陽(yáng)性血清的OD450值及P/N值，確定最佳顯色時(shí)間.

1.6 交叉反應(yīng)實(shí)驗(yàn)

用建立的ELISA方法同時(shí)檢測(cè)PCV2、豬瘟病毒(CSFV)、豬繁殖與呼吸綜合癥病毒(PRRSV)、豬細(xì)小病毒(PPV)、豬偽狂犬病毒(PRV)的陽(yáng)性血清，分析此檢測(cè)方法是否會(huì)與其他病原體的抗體產(chǎn)生交叉反應(yīng).

1.7 臨床血清樣品檢測(cè)

用建立的ELISA方法檢測(cè)78份不同抗體效價(jià)的血清樣本，與商品化的試劑盒(深圳綠詩(shī)源)的檢測(cè)結(jié)果比較，確定該檢測(cè)方法結(jié)果的可靠性.

1.8 試劑盒重復(fù)性和保存時(shí)間實(shí)驗(yàn)

使用不同批次組裝的試劑盒檢測(cè)同樣的6份待檢樣品，分析其變異系數(shù).將試劑盒放置在37 ℃，在不同時(shí)間段采樣，分析其各個(gè)組分的P/N值，分析試劑盒各組分保存的時(shí)間.

2 結(jié)果與分析

2.1 重組ORF2蛋白的表達(dá)及鑒定

37 ℃、220 rpm震蕩培養(yǎng)重組菌種pET-28a-ORF2-BL21，待OD600值達(dá)到0.6～0.8時(shí)，加入終濃度為1 mM的IPTG，進(jìn)行誘導(dǎo).誘導(dǎo)8 h后取樣，SDS-PAGE凝膠電泳鑒定蛋白表達(dá)情況，同時(shí)用pET-28a-ORF2-BL21菌液樣品做對(duì)照(圖1)，結(jié)果表明，與pET-28a-BL21相比，重組菌種pET-28a-ORF2-BL21在26 kD處有明顯的表達(dá)條帶.

2.2 重組ORF2蛋白的可溶性分析

本實(shí)驗(yàn)設(shè)置25 ℃、30 ℃和37 ℃3個(gè)溫度梯度分別誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，超聲后分別取上清，沉淀進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳分析(圖2).結(jié)果表明，在30 ℃誘導(dǎo)時(shí)，可溶性蛋白的產(chǎn)量最高.

M:Marker；1～4:pET-28a-ORF2-BL21 誘導(dǎo)產(chǎn)物； 5:pET-28a-BL21誘導(dǎo)產(chǎn)物圖1 重組蛋白ORF2的SDS-PAGE分析Fig.1 SDS-PAGE analysis of recombinant ORF2 protein

M:Marker；1:37 ℃誘導(dǎo)上清；2:37 ℃誘導(dǎo)沉淀； 3:30 ℃誘導(dǎo)上清；4:30 ℃誘導(dǎo)沉淀；5:25 ℃誘導(dǎo)上清； 6:25 ℃誘導(dǎo)沉淀；7.空載對(duì)照?qǐng)D2 重組蛋白ORF2的可溶性分析Fig.2 Solubility analysis of recombinant ORF2 protein

2.3 重組ORF2蛋白的純化與反應(yīng)原性鑒定

由于重組蛋白帶有His標(biāo)簽，故選用鎳柱親和層析對(duì)重組蛋白進(jìn)行純化，結(jié)果見(jiàn)圖3.使用豬圓環(huán)病毒陽(yáng)性血清作為一抗，對(duì)蛋白樣品進(jìn)行Western blot分析(結(jié)果如圖4).結(jié)果表明,表達(dá)的重組ORF2蛋白能夠和PCV2的陽(yáng)性血清反應(yīng)，出現(xiàn)明顯的反應(yīng)條帶，大小約為26 kD.證明了表達(dá)的重組ORF2蛋白可以有效地作為包被原識(shí)別PCV2陽(yáng)性血清中的抗體.

2.4 PCV2抗體檢測(cè)ELISA方法的建立

2.4.1 抗原最佳包被濃度和血清最佳稀釋度的確定 由表1可知，當(dāng)重組蛋白的包被濃度為5 μg/mL時(shí)，OD450值為0.979，P/N值最高，為6.157，此時(shí)血清稀釋濃度為1∶1 000.由此確定出，抗原的最佳包被濃度為5 μg/mL，血清的最佳稀釋度為1∶1 000.

2.4.2 重組抗原包被條件的確定 結(jié)果如表2所示，在抗原4 ℃包被過(guò)夜的條件下，P/N值最高，因此確定4 ℃過(guò)夜為抗原的最佳包被條件.

M：Marker;1：500 mM咪唑洗脫蛋白圖3 重組蛋白ORF2純化結(jié)果Fig.3 Purification of recombinant ORF2 protein

M：Marker；1：重組蛋白與PCV2陽(yáng)性血清反應(yīng)圖4 重組ORF2蛋白與PCV2陽(yáng)性血清反應(yīng)Fig.4 Reaction between ORF2 and PCV2 positive serum 表1 重組ORF2蛋白最佳包被濃度與血清稀釋度的確定Tab.1 The best package concentration of antigen and sera dilution

血清稀釋倍數(shù)抗原包被濃度/μg·mL-1201052．51．250．6250．3125+2．6151．791．1720．5850．410．2190．1541∶500-0．370．3380．290．2240．2670．2180．205P/N7．0685．2964．0412．6121．5361．0050．751+1．8321．7130．9790．5370．2890．2190．1321∶1000-0．2890．2110．1590．1490．1470．1350．145P/N6．3398．1186．1573．6041．9661．6220．91+1．8950．8520．7380．310．2220．170．1141∶2000-0．1810．1490．140．1050．1210．0960．089P/N10．475．7185．2712．9521．8351．7711．281+2．1320．9430．3630．1750．140．1110．0861∶4000-0．2610．1750．0890．0880．0940．0940．087P/N8．1695．3894．0791．9891．4891．1810．989+1．7860．5460．3530．1880．1120．0930．081∶8000-0．270．0650．0680．0630．0640．0690．06P/N6．6158．45．1912．9841．751．3481．333

表2 重組抗原最佳包被條件的確定Tab.2 Best package condition of antigen

2.4.3 最佳封閉液的確定 重復(fù)兩次實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如表3，當(dāng)使用5 %脫脂奶作為封閉液時(shí)，P/N值最高，因此確定最佳封閉液為5 %脫脂奶.

表3 最佳封閉液的確定Tab.3 Determination of best blocking solution

2.4.4 一抗血清最佳反應(yīng)時(shí)間的確定 重復(fù)兩次試驗(yàn)，結(jié)果如表4所示，當(dāng)一抗血清反應(yīng)時(shí)間為30 min時(shí)，陰性血清OD450最低，P/N值最低，因此確定一抗血清最佳反應(yīng)時(shí)間為30 min.

2.4.5 酶標(biāo)二抗最佳稀釋度的確定 重復(fù)兩次實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如表5，當(dāng)酶標(biāo)二抗的稀釋濃度為1∶5 000時(shí)，P/N值最高，因此確定酶標(biāo)二抗最佳稀釋度為1∶5 000.

表4 一抗血清最佳反應(yīng)時(shí)間的確定Tab.4 Determination of optimal reaction time of serum

表5 酶標(biāo)二抗最佳稀釋濃度的確定Tab.5 Determination of second antibody dilution

2.4.6 酶標(biāo)二抗最佳反應(yīng)時(shí)間的確定 通過(guò)兩次重復(fù)試驗(yàn)，結(jié)果如表6，當(dāng)酶標(biāo)二抗反應(yīng)時(shí)間為60 min時(shí)，P/N值最高，因此確定酶標(biāo)二抗最佳工作時(shí)間為60 min.

表6 酶標(biāo)二抗最佳反應(yīng)時(shí)間的確定Tab.6 Determination of optimal reaction time of second antibody

2.4.7 顯色時(shí)間的確定 結(jié)果如表7所示，當(dāng)顯色時(shí)間為 5 min時(shí)，P/N值最高，因此確定最佳顯色時(shí)間為5 min.

表7 最佳顯色時(shí)間的確定Tab.7 Determination of optimal reaction time of TMB

表8 PCV2陰性血清檢測(cè)結(jié)果Tab.8 Detection results of negative serum samples

2.5 交叉反應(yīng)實(shí)驗(yàn)

使用建立的ELISA方法同時(shí)檢測(cè)PCV2、豬瘟病毒(CSFV)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)、豬細(xì)小病毒(PPV)、豬偽狂犬病毒(PRV)的陽(yáng)性血清，結(jié)果如表9所示，除PCV2陽(yáng)性血清外，其他血清的OD450值均小于0.25，說(shuō)明該方法具有很好的特異性.

表9 交叉反應(yīng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.9 Results of crossing reaction

2.6 臨床樣品檢測(cè)

使用上述方法方法對(duì)78份臨床血清樣品進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)和商品化試劑盒(深圳綠詩(shī)源)進(jìn)行對(duì)比.結(jié)果表明，本方法與商品化試劑盒的符合率達(dá)到95%，結(jié)果可信度高.

2.7 試劑盒重復(fù)性和保質(zhì)期的確定

使用3個(gè)不同批次組成的試劑盒對(duì)6個(gè)待檢血清進(jìn)行檢測(cè)，具體結(jié)果如表10所示，該試劑盒的變異系

表10 試劑盒重復(fù)性分析Tab.10 Detection results of repeatability of ELISA kit

數(shù)均小于10 %，說(shuō)明具有良好的重復(fù)性.保存期實(shí)驗(yàn)證明，試劑盒在37 ℃放置1個(gè)月內(nèi)，各組分保持穩(wěn)定.

3 討論

PCV2的基因組為共價(jià)閉合的單鏈、環(huán)狀DNA，含有11個(gè)開(kāi)放閱讀框.ORF1編碼與病毒復(fù)制相關(guān)的Rep蛋白，該蛋白氨基酸序列非常保守，是決定PCV1和PCV2之間抗原交叉反應(yīng)性的區(qū)域.而ORF2編碼的結(jié)構(gòu)蛋白核苷酸同源性比較低，兩型PCV之間無(wú)交叉反應(yīng).PCV2的ORF2蛋白含有4個(gè)反應(yīng)位點(diǎn)，其中第12～18和第34～41位氨基酸殘基與Cap蛋白的定位有關(guān)，而69～83和117～131位氨基酸殘基是與PCV2抗血清反應(yīng)的位點(diǎn)[8].所以用Cap蛋白作為診斷抗原，用來(lái)構(gòu)建快速、靈敏的豬圓環(huán)病毒抗體檢測(cè)方法是可行的.本研究將ORF2基因的信號(hào)肽基因序列去掉后在大腸桿菌BL21(DE3)中進(jìn)行表達(dá)，通過(guò)條件優(yōu)化，最終確定30 ℃，0.8 mM的IPTG誘導(dǎo)時(shí)，可溶性的蛋白最多.使用鎳柱親和層析對(duì)表達(dá)的蛋白進(jìn)行純化，最終得到高純度的重組ORF2蛋白.

本研究在大腸桿菌中表達(dá)了的ORF2蛋白的主要抗原序列，并以此為基礎(chǔ)，成功建立了間接ELISA方法來(lái)進(jìn)行PCV2血清中抗體的檢測(cè).確定了最佳抗原包被濃度(5 μg/mL)、包被時(shí)間(4 ℃過(guò)夜)、封閉液(5 %脫脂奶)、一抗(1∶1 000，1 h)和二抗(1∶5 000，1 h)的稀釋濃度及作用時(shí)間、顯色時(shí)間(5 min)，從而減少了非特異性反應(yīng).在很多報(bào)告中，均以BSA作為封閉液的封閉效果較好，但是本研究中，以5 %的脫脂奶作為封閉液時(shí)，P/N值最高，效果最好.脫脂奶具有廉價(jià)、易得等優(yōu)點(diǎn)，因此非常適用于商品化使用.

用深圳綠詩(shī)源生產(chǎn)的PCV2抗體檢測(cè)試劑盒的檢測(cè)結(jié)果作為基礎(chǔ)，對(duì)本研究建立的檢測(cè)方法進(jìn)行評(píng)估.結(jié)果表明本研究建立的ELISA檢測(cè)方法與商品化試劑盒的符合率為95 %，并且與CSFV，PRRSV，PPV，PRV均無(wú)交叉反應(yīng)，可以用于PCV2的臨床診斷和流行病學(xué)調(diào)查.

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(責(zé)任編輯：王浩毅)

Production of PCV2 Antibody Detection ELISA Kit

WANG Ai-ping， LI Peng-fei, ZHOU Jing-ming， ZHANG Gai-ping, QI Yan-hua,KOU Li-yun, CHE Zhi-fen, JIANG Min

(SchoolofLifeScience,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450001,China)

Porcine circovirous(PCV)can be sub-classified two serotypes and only PCV2 is pathogenic. ORF2 could be used as special antigen to construct a serum detection method. After deleting the signal sequence, the rest ORF2 sequence was expressed in Escherichia coli BL21(DE3). Result of SDS-PAGE gel electrophoresis indicated a 26 kD stripe, which was consistent with the predicted. Besides, the recombinant ORF2 protein could react with PCV2 positive serum. ORF2 without signal sequence was successfully expressed in E. coli. Based on the expressed ORF2 protein, ELISA method was set up for detecting PCV2 antibodies. The method presented 95 % coincidence with commercial ELISA kit and no cross-actions with CSFV, PPV, PRV and PRRSV were detected.

PCV2； ORF2； antibody detection； ELISA

2015-04-18

鄭州市科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目，編號(hào)131PCXTD622；河南省科技攻關(guān)項(xiàng)目，編號(hào)132102110142.

王愛(ài)萍(1970-)，女，青海西寧人，教授，博士，主要從事分子免疫學(xué)和免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)研究，E-mail:pingaw@zzu.edu.cn；通訊作者：祁艷華(1983-)，女，河南焦作人，助理實(shí)驗(yàn)師，研究生，主要從事分子免疫學(xué)研究，E-mail:yanhuaqi2007@163.com.

S85

A

1671-6841(2015)03-0092-07

10.3969/j.issn.1671-6841.2015.03.018

引用文本：王愛(ài)萍，李鵬飛，周景明，等.豬圓環(huán)病毒Ⅱ型抗體檢測(cè)ELISA試劑盒的制備[J].鄭州大學(xué)學(xué)報(bào)：理學(xué)版，2015,47(3)：92-98.