王 冕，王如福，焦玉雙

（山西農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院，山西太谷030801）

海藻酸鈉-阿拉伯膠固定化糖化酶及其性質的研究

王 冕，王如福*，焦玉雙

（山西農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院，山西太谷030801）

以海藻酸鈉（SA）與阿拉伯膠（GA）為載體固定化糖化酶，以酶活回收率為評價指標，在單因素試驗基礎上，通過響應面法優(yōu)化固定化條件，得到固定化糖化酶最佳工藝條件為SA-GA質量比2.7∶1，氯化鈣質量濃度6.2 g/100 m L，固化時間0.8 h，此條件下固定化糖化酶酶活回收率為67.91%。通過對固定化酶酶學性質的研究得出：經(jīng)固定化的糖化酶最適反應pH值與最適作用溫度均與游離酶相同，pH值為4.6，溫度45℃，熱穩(wěn)定性及操作穩(wěn)定性均優(yōu)于游離酶。

糖化酶；固定化酶；海藻酸鈉；阿拉伯膠

糖化酶全稱葡萄糖淀粉酶（glucoamylase EC.3.2.1.3.），是由微生物分泌的具有外切酶活性的胞外酶，廣泛應用于酒類和食醋的釀造等食品工業(yè)中[1-4]。海藻酸鈉（sodium alginate，SA）具有溫和無毒、廉價易得等優(yōu)點，是當前使用最為廣泛的固定化載體材料[5-7]。阿拉伯膠（gum arabic，GA）是目前最為廉價且應用廣泛的親水膠體之一，具有一定的營養(yǎng)學及醫(yī)學價值[8]，近年來受到國內(nèi)外專家學者的關注，也是我國食品工業(yè)中應用最為廣泛的膠體之一[9]。目前，有較多關于使用GA制備凝聚微膠囊的研究。董志儉等[10]使用羧甲基纖維素（carboxyl methyl cellulose，CMC）、GA、明膠為材料制作復合凝聚橘油微膠囊，得出CMC/GA/明膠復合凝聚橘油微膠囊具有較高的產(chǎn)率的結論。而將GA應用于固定化載體材料的研究鮮有報道。商品化GA主要有乳化性較強的A.sengeal型和乳化性較弱的A.seyal型兩種[11-12]，前者價格上相對昂貴，而傳統(tǒng)制備微膠囊通常使用前者。本試驗研究發(fā)現(xiàn)由于GA的低濃度高黏度的特點，所制備出的固定化酶具有較好的機械強度。

本試驗使用SA-GA復合制備固定化酶載體吸附糖化酶，研究復合凝膠質量濃度、凝膠比例、氯化鈣質量濃度、固化時間、酶量、吸附時間等因素對SA-GA復合膠體固定化糖化酶工藝條件的影響，通過響應面法優(yōu)化固定化條件，并對固定化酶酶學性質進行研究比較，為固定化糖化酶的實際應用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

食品級糖化酶（100 000 U/g）：江蘇銳陽生物科技有限公司；食品級海藻酸鈉：青島邁潮海洋科技發(fā)展有限公司；食品級阿拉伯膠：艾納提化工科技有限公司；其他試劑為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設備

TGL-20M高速臺式冷凍離心機：湘儀離心機儀器有限公司；PHSJ-3F型pH計：上海精密科學儀器有限公司；BS210S萬分之一電子天平：北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋：常州國華電器有限公司；85-2型恒溫磁力攪拌器：上海思樂儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 固定化糖化酶的制備方法[13]

（1）以載體溶液總體積50 m L計，稱取一定量的SA、GA膠體于低于60℃時蒸餾水中溶解，混合均勻，超聲波快速消泡至復合凝膠中無氣泡。

（2）使用10 m L醫(yī)用注射器，以約1滴/s的速度將復合凝膠滴到氯化鈣溶液中，在4℃冰箱中固化，用紗布濾出載體顆粒，并用pH 4.6的乙酸-乙酸鈉緩沖液沖洗3～5次除去表面的氯化鈣。

（3）用濾紙吸干表面水分，放入pH 4.6的酶液中進行吸附，后用紗布濾出固定化顆粒，用緩沖液清洗，并用濾紙吸干表面的水分，制成球狀顆粒，即得固定化酶，0～4℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 糖化酶固定化條件的優(yōu)化設計

（1）復合凝膠質量濃度對固定化酶活回收率的影響：設定復合凝膠質量濃度分別為2.0 g/100 m L、2.5 g/100 m L、3.0 g/100 m L、3.5 g/100 m L、4.0 g/100 m L、4.5 g/100 m L，按照方法1.3.1制備固定化酶，測定其酶活，下同。

（2）凝膠比例對固定化酶活回收率的影響：取最適復合凝膠質量濃度，設定SA-GA質量比分別為1∶1、2∶1、3∶1、4∶1，考察其對酶活回收率的影響。

（3）氯化鈣質量濃度對固定化酶活回收率的影響：取各已測指標的最適條件，設定氯化鈣質量濃度分別為5.0 g/100 m L、6.0 g/100 m L、7.0 g/100 m L、8.0 g/100 m L、9.0 g/100 m L，考察其對酶活回收率的影響。

（4）固化時間對固定化酶活回收率的影響：取各已測指標的最適條件，設定固化時間分別為0.5 h、1.0 h、1.5 h、2.0 h、2.5 h、3.0 h，考察其對酶活回收率的影響。

（5）給酶量對固定化酶活回收率的影響：取各已測指標的最適條件，設定給酶量分別為1 100 U/g、1 320 U/g、1 540 U/g、1 760 U/g、1 980 U/g、2 200 U/g，考察其對酶活回收率的影響。

（6）吸附時間對固定化酶活回收率的影響：取各已測指標的最適條件，吸附時間設定分別為1.0 h、1.5 h、2.0 h、2.5 h、3.0 h，考察其對酶活回收率的影響。

1.3.3 響應面優(yōu)化試驗設計

結合單因素試驗及分析，采用Design-Expert.V8.0.6軟件進行數(shù)據(jù)處理，根據(jù)Box-Benhnken中心組合試驗設計原理，在單因素試驗基礎上，選取SA-GA質量比、氯化鈣質量濃度、固化時間3個因素為試驗因素，以酶活回收率（Y）為響應值，進行3因素3水平的響應面分析試驗。試驗設計因素與水平見表1。

表1 響應面試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface methodology

1.3.4 糖化酶活力的測定

游離糖化酶活力的測定：參考GB 8276—2006《食品添加劑糖化酶制劑》中的測定方法。

固定化糖化酶活力的測定：取一定質量的固定化酶測定其酶活力，測定方法與游離糖化酶方法相同。

糖化酶活力定義：單位質量的糖化酶在溫度為40℃，pH值4.6條件下，1 h水解可溶性淀粉產(chǎn)生1 μg葡萄糖為1個酶活力單位（U/g或U/m L）。

1.3.5 酶活回收率及相對酶活的計算

固定化酶所顯示的活力占加入酶液中酶的總活力的百分數(shù)為固定化酶的活力回收率，其計算公式：

相對酶活是指以同組最高酶活為參照，用固定化酶活力計算出的比值，設定同組酶活力最高的相對酶活為100%，其計算公式：

1.3.6 固定化蛋白酶酶學性質的研究

（1）溫度對固定化酶以及游離酶相對酶活的影響：取一定量的固定化酶及游離酶，以2%可溶性淀粉為底物，不同溫度條件下，pH 4.6緩沖液中保溫振蕩反應10 m in，測定其酶活。

（2）pH值對固定化酶以及游離酶相對酶活的影響：取一定量的固定化酶及游離酶，以2%可溶性淀粉為底物，不同pH值緩沖液中，45℃保溫振蕩反應10 min，測定其酶活。

（3）固定化酶以及游離酶的熱穩(wěn)定性：取一定量的固定化酶及游離酶在無底物的條件下，pH 4.6的緩沖液中，在不同溫度條件下加熱處理30 m in后，迅速冷卻。45℃條件下，測定其酶活。

（4）固定化酶的操作穩(wěn)定性：取一定量固定化酶，以2%可溶性淀粉為底物，在最適條件下連續(xù)進行幾個批次的操作，每批次操作完成后測定固定化酶酶活力。

2 結果與分析

2.1 載體選擇及固定化條件對固定化糖化酶活力的影響

2.1.1 復合凝膠質量濃度對糖化酶固定化效果的影響

復合凝膠質量濃度對固定化酶活回收率的影響結果見圖1。由圖1可知，隨著復合凝膠質量濃度的增加固定化酶酶活回收率增加，當復合凝膠質量濃度達到3.5 g/100 m L時酶活回收率達到最大，之后隨著凝膠質量濃度的增加酶活回收率開始降低，這是由于當凝膠質量濃度過大時載體表面孔隙緊密，不利于酶的吸附。因此，最適復合凝膠質量濃度為3.5 g/100 m L。

圖1 復合凝膠質量濃度對固定化酶活回收率的影響Fig.1 Effects of compound gel concentration on the recovery rate of immobilized enzyme activity

2.1.2 SA-GA質量比對糖化酶固定化效果的影響

SA-GA質量比對固定化酶活回收率的影響見圖2。由圖2可知，隨著SA-GA質量比的增加酶活回收率呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢，在質量比為3∶1時酶活回收率達到最大，GA所占比例較低是因其本身具有低濃度高黏度的特性，同時GA與SA混合也可產(chǎn)生協(xié)同作用，使黏度倍增。因此，最適SA-GA質量比為3∶1。

圖2 SA-GA質量比對固定化酶活回收率的影響Fig.2 Effects of the SA-GA mass ratio on the recovery rate of immobilized enzyme activity

2.1.3 氯化鈣質量濃度對糖化酶固定化效果的影響

氯化鈣質量濃度對固定化酶活回收率的影響結果見圖3。由圖3可知，在氯化鈣質量濃度為7.0 g/100 m L時酶活回收率達到最大，這是因為SA與氯化鈣作用強弱是由于離子強度所決定，同時離子濃度會影響GA的分子結構，從而影響其效果。因此，隨著離子強度的增強，作用越明顯；而當強度過大時，酶活力會由于離子強度過大的影響而降低。因此，最適氯化鈣質量濃度為7.0 g/100 m L。

圖3 氯化鈣質量濃度對固定化酶活回收率的影響Fig.3 Effects of calcium chloride concentrations on the recovery rate of immobilized enzyme activity

2.1.4 固化時間對糖化酶固定化效果的影響

固化時間對固定化酶活回收率的影響見圖4。SA與氯化鈣形成凝膠是由Ca2+通過SA載體微球從外向內(nèi)置換Na+形成海藻酸鈣，置換需要時間，但時間過長會造成高分子鏈結構太致密而使孔徑過小。由圖4可知，酶活回收率隨固化時間的增加先升高后降低，最適固化時間為1.0 h。

圖4 固化時間對固定化酶活回收率的影響Fig.4 Effects of immobilization time on the recovery rate of immobilized enzyme activity

2.1.5 給酶量對糖化酶固定化效果的影響

圖5 給酶量對固定化酶活回收率的影響Fig.5 Effects of enzyme addition on the recovery rate of immobilized enzyme activity

給酶量對固定化酶活回收率的影響見圖5。由圖5可知，隨著給酶量的增加，酶活回收率呈先增加后減小的趨勢，這是由于一定質量的載體可吸附的酶量有限，當載體的吸附酶量達到飽和后繼續(xù)增加給酶量會造成載體表面孔徑被多余酶覆蓋現(xiàn)象，從而影響固定化酶活力。因此，最適給酶量為1 760 U/g。

2.1.6 吸附時間對糖化酶固定化效果的影響

吸附時間對固定化酶活回收率的影響結果見圖6。由圖6可知，在吸附時間為2.0 h時，固定化酶酶活回收率達到最大值。酶吸附到載體上需要一定時間，時間過短不利于酶與載體的充分接觸，當吸附達到平衡后，隨著時間的增加，吸附量不會再有所上升。故選擇吸附時間為2.0 h。

圖6 吸附時間對固定化酶活回收率的影響Fig.6 Effects of absorption time on the recovery rate of immobilized enzyme activity

2.2 響應面優(yōu)化試驗

2.2.1 模型建立及顯著性檢驗

固定化酶活回收率響應面法分析結果見表2，方差分析見表3。

表2 固定化酶響應面分析方案及結果Table 2 Design and results of response surface methodology for immobilized enzyme activity optimization

以SA-GA質量比、氯化鈣質量濃度及固化時間作為響應因素，糖化酶酶活回收率為響應值Y。采用Design-Expert.V 8.0.6軟件，對固定化糖化酶酶活回收率試驗數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合，得出回歸方程Y=14.419 59+2.870 70A+ 13.95469B+15.17371C+2.86533AB-0.85960AC+4.87894BC-3.654 19A2-2.082 20B2-25.520 77C2。

表3 響應面試驗方差分析Table 3 Variance analysis of response surface methodology

由表3可知，該模型中P＜0.000 1，因此方程顯著，方程中B、C、AB、BC、A2、B2、C2均達到顯著水平（P＜0.000 1），只有A和AC未達到顯著水平（P＞0.0001）。說明各個具體試驗因素對響應值的影響不是簡單的線性關系。相關系數(shù)R為0.982 0，即響應值變化有98.20%來源于所選試驗因素。方程失擬項不顯著說明擬合度好。因此，回歸方程可以較好地描述各因素與響應值之間的真實關系，用此方程模擬試驗因素與響應值之間的關系是可行的。

2.2.2 響應面因素交互作用及優(yōu)化結果

圖7為凝膠比例、氯化鈣質量濃度、固化時間交互作用對酶活回收率影響的響應面及等高線。等高線的形狀反映因素交互效應的強弱大小，橢圓形表示兩因素交互作用顯著性，曲面的斜體度確定兩者對響應值的影響程度[14-15]。由回歸方程以及方差分析可知，AB、BC交互作用對結果影響顯著，AC交互作用對結果影響不顯著。

通過對回歸方程求極值得到固定化糖化酶的最佳固定條件為：凝膠質量比2.72∶1，氯化鈣質量濃度6.19 g/100 m L，固化時間0.84 h，此時的固定化酶預測理論酶活回收率為68.12%。采用所得條件進行驗證試驗，考慮到實際操作的可行性，將條件設定為凝膠質量比2.7∶1，氯化鈣質量濃度6.2 g/100 m L，固化時間0.8 h。在此條件下固定化糖化酶酶活回收率為67.91%，與理論預測值相似。

圖7 SA-GA質量比、氯化鈣質量濃度、固化時間交互作用對酶活回收率影響的響應面圖Fig.7 Response surface plots of effects of interaction between SA-GA ratio,CaCl2concentration and immobilization time on recovery rate of enzyme activity

2.3 固定化酶酶學性質的研究

2.3.1 固定化糖化酶的最適作用溫度

圖8 溫度對游離酶和固定化酶相對酶活的影響Fig.8 Effects of temperature on relative enzyme activity of free enzyme and immobilized enzyme

由圖8可知，隨著溫度升高，固定化酶和游離酶相對酶活先呈現(xiàn)上升趨勢，最適作用溫度均為45℃，之后隨著溫度的升高，酶蛋白逐漸變性從而導致酶活力降低。當溫度為45℃時，固定化酶酶活力高于游離酶，之后隨著溫度的升高，固定化酶酶活變化幅度小于游離酶。

2.3.2 固定化糖化酶的最適反應pH值

圖9 pH值對游離酶和固定化酶相對酶活的影響Fig.9 Effects of pH value on relative enzyme activity of free and immobilized enzymes

由圖9可知，固定化酶和游離酶的最適反應pH值均為4.6，且在相同pH值的情況下固定化酶的相對酶活均高于游離酶，證明經(jīng)過固定化的糖化酶的最適反應pH值不變且穩(wěn)定性有所提高。

2.3.3 固定化糖化酶的熱穩(wěn)定性

圖10 游離酶和固定化酶的熱穩(wěn)定性Fig.10 The thermal stability of free and immobilized enzymes

由圖10可知，隨著溫度的升高，固定化酶和游離酶的酶活力均有所下降，且隨著溫度的升高固定化酶相對酶活高于游離酶的趨勢越明顯，證明固定化酶的熱穩(wěn)定性要高于游離酶，在溫度為55℃時固定化酶相對活力仍能保持在80%左右，相對酶活高于游離酶約12個百分點。

2.3.4 固定化糖化酶的操作穩(wěn)定性

圖11 固定化酶操作穩(wěn)定性Fig.11 Operational stability o f immobilized enzymes

由圖11可知，隨著反應批次的增加，固定化酶酶活力有所降低，固定化糖化酶在反應4次后酶活力為原活力的50%，證明固定化酶可進行重復使用，一般最多可反復操作4次，具有一定的操作穩(wěn)定性。

3 結論

本試驗以SA-GA復合凝膠為載體制備固定化糖化酶的最佳工藝條件為：復合凝膠質量濃度3.5 g/100 m L，SA-GA質量比2.7∶1，氯化鈣質量濃度6.2 g/100 m L，固化時間0.8 h，給酶量1 760 U/g，吸附時間2.0 h，此時固定化糖化酶酶活回收率為67.91%。

通過對固定化糖化酶與游離酶酶學性質的研究得出：固定化酶和游離酶的最適反應pH值均為4.6，最適作用溫度為45℃，固定化酶的熱穩(wěn)定性明顯優(yōu)于游離酶，固定化糖化酶在反應4次后酶活力為原活力的50%，證明固定化酶可進行重復使用，具有一定的操作穩(wěn)定性。表明經(jīng)過固定化處理的糖化酶酶學性質優(yōu)于游離酶，具有一定的應用價值。

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《中國釀造》雜志社

Immobilized glucoamylase with sodium alginate and gum arabic and its properties

WANG Mian,WANG Rufu*,JIAO Yushuang
(College of Food Science and engineering,Shanxi Agricultural University,Taigu 030801,China)

Using sodium alginate(SA)and gum arabic(GA)as the carrier to prepare immobilized glucoamylase,on the basis of single factor experiment,using enzyme activity recovery rate as evaluation indexes,the optimal conditions for glucoamylase immobilization were optimized by response surface methodology.The optimal conditions were SA-GA mass ratio 2.7∶1,calcium chloride concentration 6.2 g/100 m l,and immobilization time 0.8 h.Under these conditions,the immobilized enzyme activity recovery rate was up to 67.91%.The enzymatic properties of the immobilized enzyme were studied,and the results showed that the optimum reaction pH and temperature of immobilized enzyme was the same as the free enzyme of pH 4.6,temperature 45℃,and both the thermal stability and operational stability of the immobilized enzyme were better than the free enzyme.

glucoamylase;immobilized enzyme;sodium alginate;gum arabic

Q814

A

0254-5071（2015）03-0024-06

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.03.006

2015-01-16

“十二五”農(nóng)村領域國家科技計劃（2011AA10090401）；山西省科技攻關項目（20110311042-3；20130311030-2）

王冕（1990-），女，碩士研究生，研究方向為發(fā)酵食品工藝、果蔬采后生理及貯運技術。

*通訊作者：王如福（1960-），男，教授，博士，研究方向為發(fā)酵食品工藝、果蔬采后生理及貯運技術。