食用菌深層發(fā)酵物中生物活性物質(zhì)含量的比較

金紅，楊孝麗，任燦，徐娜，王英超，張斌

（1.天津農(nóng)學(xué)院農(nóng)學(xué)與資源環(huán)境學(xué)院，天津300384；2.天津農(nóng)學(xué)院基礎(chǔ)科學(xué)學(xué)院，天津300384；3.天津市食品研究所有限公司，天津301609）

食用菌深層發(fā)酵物中生物活性物質(zhì)含量的比較

金紅1，楊孝麗1，任燦1，徐娜1，王英超2，張斌3，*

（1.天津農(nóng)學(xué)院農(nóng)學(xué)與資源環(huán)境學(xué)院，天津300384；2.天津農(nóng)學(xué)院基礎(chǔ)科學(xué)學(xué)院，天津300384；3.天津市食品研究所有限公司，天津301609）

食用菌深層發(fā)酵物中含有很多與免疫相關(guān)的生物活性物質(zhì)。本文以白靈菇、金針菇、茶樹菇、平菇、香菇、桑黃、云芝和灰樹花八種食用菌為實(shí)驗(yàn)材料，利用搖瓶深層發(fā)酵技術(shù)，對(duì)相同發(fā)酵條件下，8種食用菌發(fā)酵物中的胞外多糖、胞內(nèi)多糖、黃酮、總酚、VC和可溶性蛋白含量進(jìn)行了比較。結(jié)果表明，灰樹花深層發(fā)酵物中總多糖產(chǎn)量最高為0.349g/100mL，桑黃中的黃酮和可溶性蛋白的產(chǎn)量最高分別為3.92μmol/100mL和0.58mg/mL，云芝中的VC產(chǎn)量最高為19.95 g/100mg，金針菇的總酚產(chǎn)量最高為5.07mg/100m L。通過比較，白靈菇的綜合指標(biāo)表現(xiàn)最好，以白靈菇為實(shí)驗(yàn)材料進(jìn)行發(fā)酵罐深層發(fā)酵，比較搖瓶與發(fā)酵罐深層發(fā)酵液中各物質(zhì)的含量變化。結(jié)果表明，在發(fā)酵罐條件下，白靈菇的胞外多糖和胞內(nèi)多糖產(chǎn)量明顯提高，但黃酮和VC產(chǎn)量增幅不大，說明發(fā)酵條件對(duì)發(fā)酵物中活性物質(zhì)產(chǎn)量有很大的影響。

食用菌；深層發(fā)酵；多糖；黃酮；VC

食用菌深層發(fā)酵技術(shù)是一種新型的技術(shù)，具有周期短、產(chǎn)量高、產(chǎn)生的活性物質(zhì)多、菌體污染少等特點(diǎn)[1]。我國擁有極其豐富的高等真菌資源，隨著現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，目前，食用菌深層發(fā)酵技術(shù)日趨成熟，但如何有效地利用深層發(fā)酵物中的生物活性物質(zhì)仍處于研究階段，多數(shù)以研究單一菌種的發(fā)酵技術(shù)為主[2]。摸清一些常用食用真菌深層發(fā)酵液中生物活性物質(zhì)的成分，特別是對(duì)它們的發(fā)酵液成分作以橫向比較，對(duì)這些活性物質(zhì)進(jìn)行有效的混合利用，開發(fā)功能食品和生物制劑具有主要意義。由于食用菌發(fā)酵物中含有多種與免疫相關(guān)的活性物質(zhì)，對(duì)提高機(jī)體的免疫技能，克服抗生素和疫苗的副作用，具有較好的作用。本文以8種常見食用菌為研究材料，通過搖瓶深層發(fā)酵培養(yǎng)，測(cè)定其發(fā)酵液中多糖、黃酮等多個(gè)與免疫相關(guān)的物質(zhì)含量，篩選出各指標(biāo)較高的食用菌，并對(duì)其進(jìn)行發(fā)酵罐深層發(fā)酵初探，為食用菌深層發(fā)酵物的混合加工利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

食用菌：白靈菇、金針菇、茶樹菇、香菇、平菇、云芝、桑黃和灰樹花：均由天津農(nóng)學(xué)院農(nóng)學(xué)與資源環(huán)境學(xué)院生物技術(shù)系班立桐老師惠贈(zèng)。

1.2 主要設(shè)備和儀器

75-23型可見分光光度計(jì)：天津喀納斯光學(xué)分析儀器有限公司；HZQ-Q型全溫振蕩器：哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司；LGJ-18S型冷凍干燥機(jī)：北京松源華興科技發(fā)展有限公司；RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；TGL16A型高速冷凍離心機(jī)：福建凱達(dá)集團(tuán)有限公司；GBJT-7AUTOBIO2000型7L發(fā)酵罐：鎮(zhèn)江東方生物工程設(shè)備技術(shù)公司。

1.3 方法

1.3.1 培養(yǎng)基的配制

1.3.1.1 種子培養(yǎng)基

1%蔗糖、0.5%蛋白胨、0.05%KH2PO4、0.05% MgSO4·7H2O、10mg/LVB1；

1.3.1.2 搖瓶深層發(fā)酵液體培養(yǎng)基

3%蔗糖、2%玉米粉、4%麩皮、0.1%KH2PO4、0.05%MgSO4·7H2O；

1.3.1.3 白靈菇發(fā)酵罐深層發(fā)酵液體培養(yǎng)基

0.5%葡萄糖、0.5%蔗糖、5%玉米粉、4%麩皮、0.2%蛋白胨、0.1%KH2PO4、0.05%MgSO4·7H2O、0.5%羧甲基纖維素鈉、VB1微量。

1.3.2 8種食用菌搖瓶深層發(fā)酵培養(yǎng)方法

取0.5 cm2大小的各菌塊接種在斜面培養(yǎng)基的中部，25℃下暗培養(yǎng)。待各菌生長(zhǎng)旺盛時(shí)，各取2塊0.5cm2大小的菌塊分別接種到相應(yīng)的100mL種子液培養(yǎng)基中，25℃，170 r/min搖床培養(yǎng)7 d。取10mL各菌種的種子液分別接種到相應(yīng)的90m L發(fā)酵培養(yǎng)基中，25℃，170 r/min搖床繼續(xù)培養(yǎng)7 d。

1.3.3 8種食用菌發(fā)酵液多糖的提取及含量測(cè)定

將發(fā)酵液于3 600 r/min離心20min，取下層沉淀，用蒸餾水沖洗3次，放入60℃干燥箱中烘至恒重。將恒重的菌絲體研磨成粉末用于提取胞內(nèi)多糖，方法參照文獻(xiàn)進(jìn)行[3-4]。提取胞外多糖時(shí)，將發(fā)酵液3 600 r/ min離心20min，收集上清液。60℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至1/ 4體積，加入3倍體積預(yù)冷的95%乙醇，于4℃冰箱中醇析24 h，4 200 r/min離心20 min，棄上清液，沉淀分別用無水乙醇、乙醚和丙酮清洗數(shù)次，然后再加入一定體積60℃熱水，使沉淀充分溶解，得胞外多糖溶液。多糖含量的測(cè)定參照文獻(xiàn)進(jìn)行[5-7]。

1.3.4 8種食用菌發(fā)酵液中黃酮和總酚的提取和含量測(cè)定

取發(fā)酵液于3 600 r/min離心20min。取15mL上清液于-20℃冰箱中凍實(shí)，然后放入冷凍干燥機(jī)24 h，待濃縮至原液1/5，停止干燥。黃酮的測(cè)定方法采用NaNO2-Al（NO3）3比色法，參照文獻(xiàn)進(jìn)行[8]；測(cè)定總酚時(shí)，將發(fā)酵液全部轉(zhuǎn)入離心管中，3 000 r/min離心15min，取上清。將樣品濃縮到吸光度值范圍內(nèi)。測(cè)定方法參照文獻(xiàn)進(jìn)行[9]。

1.3.5 8種食用菌發(fā)酵液中VC的含量測(cè)定

取發(fā)酵液于3 600 r/min離心20min，取上清液40mL置于冷凍干燥機(jī)干燥成粉末后，2%草酸溶解，定容至40m L。含量測(cè)定采用2，6-二氯酚靛酚法，參照文獻(xiàn)進(jìn)行[10]。

1.3.6 8種食用菌發(fā)酵液中菌絲體干重和可溶性蛋白含量的測(cè)定

將發(fā)酵液于3 000 r/min離心10min，得到菌絲體，攪碎，用蒸餾水洗滌3次，3 000 r/min離心10min后，60℃烘干至恒重，菌絲體干重測(cè)定參照文獻(xiàn)進(jìn)行[8]；測(cè)定可溶性蛋白時(shí)，將發(fā)酵液轉(zhuǎn)入離心管中，3 000 r/min離心15min，取上清。參照文獻(xiàn)的方法進(jìn)行[10]。由于樣品顏色較深，將樣品稀釋到吸光度值范圍內(nèi)。

1.3.7 白靈菇發(fā)酵罐深層發(fā)酵條件

7 L發(fā)酵罐裝培養(yǎng)基4.5 L，接種量10%，溫度25℃，初始攪拌轉(zhuǎn)速300 r/min，pH 6，罐壓0.08MPa，通氣量1 vvm，通過改變轉(zhuǎn)速和增加罐壓調(diào)節(jié)溶氧，發(fā)酵培養(yǎng)5 d。

2 結(jié)果與分析

2.1 8種食用菌搖瓶發(fā)酵液中多糖的比較分析

取8種食用菌的搖瓶深層發(fā)酵液，按照1.3.3的方法分別提取胞內(nèi)多糖和胞外多糖和測(cè)定其含量，結(jié)果見表1。

從表1中可以看出，八種食用菌深層發(fā)酵物中胞外多糖和胞內(nèi)多糖含量高低呈現(xiàn)出大致相同的趨勢(shì)，胞外多糖含量從高到低前三名依次為香菇>灰樹花>白靈菇，胞內(nèi)多糖含量從高到低前三名依次為灰樹花>白靈菇>金針菇。說明在本研究中采用相同的實(shí)驗(yàn)條件下，該實(shí)驗(yàn)條件比較適合香菇深層發(fā)酵物胞外多糖的產(chǎn)生，達(dá)0.134 g/100mL，是產(chǎn)量最低的云芝的2.39倍；也比較有利于灰樹花深層發(fā)酵物中胞內(nèi)多糖的產(chǎn)生，達(dá)到0.218 g/100mL，是產(chǎn)量最低的云芝的4.11倍。而多糖總含量則是灰樹花的最高，達(dá)到0.349 g/100mL，其次是白靈菇和香菇。日本學(xué)者通過對(duì)灰樹花發(fā)酵液成份的研究發(fā)現(xiàn)：其中的灰樹花胞外多糖是發(fā)酵液主要的生物活性成份[11]。大量的藥理藥效的研究證明，灰樹花胞外多糖在抗腫瘤、抗HIV病毒以及防治糖尿病、高血壓、高血脂、肥胖癥、老年癡呆癥等方面具有良好的效果，有些方面甚至超過臨床效果較好的香菇多糖。

表1 8種食用菌搖瓶深層發(fā)酵液中多糖含量的比較Table1 Comparison of contents of polysaccharides of eight edible fungus fermentation products

2.2 8種食用菌搖瓶發(fā)酵液中黃酮和總酚含量的比較分析

取2種食用菌的搖瓶深層發(fā)酵液，按照1.3.4和1.3.5的方法分別測(cè)定黃酮、總酚和VC的含量，結(jié)果見表2。

表2 8種食用菌搖瓶深層發(fā)酵物中黃酮、總酚和VC的含量比較Table 2 Comparison of contents of flavonoids,total phenols and VCin eight edible fungus fermentation products

從表2可以看出，8種食用菌深層發(fā)酵也中黃酮含量相對(duì)差異變化不是很大，變化范圍為2.72μmol/ 100m L～3.92μmol/100m L。高低前三名的依次為：桑黃>白靈菇>平菇；總酚含量前三名為：金針菇＞灰樹花＞平菇。金針菇的總酚含量最高為5.07mg/100mL，是最低的白靈菇總酚含量的5倍；維生素C含量則差異很大，變化范圍達(dá)到1.77mg/100mL～19.95mg/100mL，VC含量前三名依次為云芝＞白靈菇＞金針菇。

2.3 8種食用菌搖瓶發(fā)酵液中菌絲干重和可溶性蛋白含量的比較分析

取8種食用菌的搖瓶深層發(fā)酵液，按照1.3.6的方法分別測(cè)定可溶性蛋白含量以及菌絲體干重，結(jié)果見表3。

表3 8種食用菌搖瓶深層發(fā)酵物中可溶性蛋白含量和菌絲體干重的比較Table3 Comparison of contents of soluble protein and dry weight of mycelium of eight edible fungus fermentation products

由表3可以看出，這8種樣品的發(fā)酵上清液中均含有蛋白質(zhì)，且含量由大到小的順序?yàn)椋荷｜S＞云芝＞白靈菇＞平菇＞金針菇＞香菇＞茶樹菇＞灰樹花。桑黃蛋白質(zhì)含量最高，即0.579 2mg/mL，云芝和白靈菇也很高，分別為0.292 2mg/mL和0.284 5mg/mL，而且相差不大?；覙浠ǖ牡鞍踪|(zhì)含量最低為0.157 1mg/mL。桑黃的蛋白質(zhì)含量是灰樹花的4倍。從菌絲體干重看，這8種發(fā)酵液的菌絲體干重由大到小的順序?yàn)椋喊嘴`菇＞金針菇＞平菇＞灰樹花＞茶樹菇＞香菇＞桑黃＞云芝。白靈菇的菌絲體干重最高為1.92 g/100m L，而云芝菌絲體干重最低為0.71 g/100mL。

2.4 白靈菇發(fā)酵罐深層發(fā)酵下多糖等物質(zhì)含量的變化

通過比較表1～表3，對(duì)八種食用菌搖瓶深層發(fā)酵液中的多糖、黃酮、總酚、VC和可溶性蛋白含量等5個(gè)指標(biāo)進(jìn)行綜合比較，表現(xiàn)較好的為白靈菇。所以，為了探討在發(fā)酵罐深層發(fā)酵條件下，是否會(huì)提高各種物質(zhì)的含量，選取白靈菇作為發(fā)酵罐深層發(fā)酵的菌種。經(jīng)發(fā)酵罐深層發(fā)酵后分別測(cè)定各物質(zhì)的含量，結(jié)果見表4。

從表4中可見，以發(fā)酵罐的方式進(jìn)行深層發(fā)酵，發(fā)酵液中各物質(zhì)的產(chǎn)量均有提高，但增加的幅度不同，胞外多糖和胞內(nèi)多糖的產(chǎn)量分別增加了3.12倍和1.86倍，而總多糖含量增加了3.29倍；總酚量增加2.44倍；黃酮、和VC產(chǎn)量增加的幅度略小些，說明該發(fā)酵條件下比較適合于多糖的產(chǎn)生，而對(duì)黃酮、可溶性蛋白和VC產(chǎn)量的增加不太適合。發(fā)酵時(shí)不同的發(fā)酵方式，會(huì)對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物含量產(chǎn)生較大的影響。

表4 白靈菇在搖瓶和發(fā)酵罐兩種深層發(fā)酵條件下發(fā)酵液中各物質(zhì)含量的比較Table4 Comparison of contents of materials above from pleurotus nebrodensis submerged ferments under two different conditions

3 結(jié)論與討論

1）從8種食用菌搖瓶深層發(fā)酵液中各指標(biāo)的測(cè)定結(jié)果可以得出，在發(fā)酵條件、培養(yǎng)時(shí)間相同時(shí)，灰樹花深層發(fā)酵物中總多糖和胞內(nèi)多糖產(chǎn)量最高，桑黃中的黃酮和可溶性蛋白產(chǎn)量最高，云芝中的VC產(chǎn)量最高，金針菇的總酚產(chǎn)量最高。由于每種食用菌具有各自最適的培養(yǎng)條件，如pH、溫度、轉(zhuǎn)速及生長(zhǎng)周期等，為了比較八種菌的發(fā)酵物中各物質(zhì)的產(chǎn)量，本研究采用了相同的培養(yǎng)條件。但同時(shí)也出現(xiàn)一個(gè)問題，就是測(cè)定時(shí)各種代謝產(chǎn)物可能不是其產(chǎn)量最高的時(shí)期，如測(cè)定桑黃深層發(fā)酵物中黃酮的含量時(shí)，第9天的黃酮含量0.0416μmol/mL，稍高于第7天測(cè)定時(shí)的0.0392μmol/mL。所以，針對(duì)具體的食用菌種發(fā)酵液中某個(gè)物質(zhì)應(yīng)選用其最適的發(fā)酵條件。

2）搖瓶發(fā)酵和發(fā)酵罐發(fā)酵是深層發(fā)酵的兩種方式。從兩種條件下深層發(fā)酵物中各指標(biāo)含量的結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵罐具有明顯的優(yōu)勢(shì)。它可以通過補(bǔ)料，調(diào)節(jié)pH、溫度、溶氧等使食用菌處于最佳的生長(zhǎng)狀態(tài)，同時(shí)也便于在線觀測(cè)參數(shù)變化，更好地掌握發(fā)酵周期，及時(shí)取樣和下罐。通過白靈菇兩種深層發(fā)酵方式的測(cè)定結(jié)果可以看出，培養(yǎng)基的碳源、氮源以及培養(yǎng)時(shí)間發(fā)生變化時(shí)對(duì)多糖、黃酮和VC等的產(chǎn)量有不同的影響，其中多糖產(chǎn)量大幅度提高，而黃酮和VC的產(chǎn)量增幅不大，這可能是由于碳氮源的變化更有利于多糖的產(chǎn)生，也可能是發(fā)酵時(shí)間太短，諸如黃酮和VC等次級(jí)代謝產(chǎn)物還未大量積累。培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)和環(huán)境因素很大程度上影響著發(fā)酵物中次生代謝物的產(chǎn)量，所以發(fā)酵培養(yǎng)基中的碳源、氮源、無機(jī)鹽和生長(zhǎng)因子以及發(fā)酵條件如裝液量、接種量、起始pH、培養(yǎng)溫度、轉(zhuǎn)速和接種菌齡對(duì)食用菌深層發(fā)酵物產(chǎn)量都可能產(chǎn)生重要的影響，這一點(diǎn)有待于進(jìn)一步研究。

3）食用菌深層發(fā)酵過程中產(chǎn)生的諸如多糖、黃酮、總酚和VC等具有生理活性的物質(zhì)對(duì)于提高免疫、抗腫瘤、抗細(xì)菌病毒均有作用。如VC可起預(yù)防、促進(jìn)免疫球蛋白合成、提高白細(xì)胞吞噬能力等作用。如吞噬細(xì)胞對(duì)VC的需求比其他細(xì)胞高出50倍。據(jù)查，獼猴桃的VC含量為62mg/100 g，辣椒的為59mg/100 g，而本研究中云芝的搖瓶發(fā)酵液和白靈菇的發(fā)酵罐深層發(fā)酵液中的VC含量就可達(dá)到19.95mg/100 g和16.10mg/100 g。可見，合理利用食用菌深層發(fā)酵液并進(jìn)行混合使用，用于制備免疫增強(qiáng)的功能食品將會(huì)產(chǎn)生很可觀的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益。

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The Comparison of the Contents of Bioactive Substances in Edible Fungus by Submerged Ferments

JIN Hong1，YANG Xiao-li1，REN Can1，XU Na1，WANG Ying-chao2，ZHANG Bin3，*
（1.College of Agronomy and Resources Environment，Tianjin Agricultural College，Tianjin 300384，China；2College of Basic Sciences，Tianjin Agricultural College，Tianjin 300384，China；3.Tianjin Institute of Food Co.，LTD.，Tianjin 301609，China）

The submerged ferments of edible fungus contain many biologically active substances related to the immune.In this study，we made a compared research about the contents of extracellular polysaccharides，intracellular polysaccharides，flavonoids vitamin C and soluble protein of eight edible fungus including pleurotus nebrodensis，flammulina velutipes，agrocybe cylindracea，pleurotus ostreatus，lentinula edodes，phellinus，coriolus versicolor and grifola frondosa under the flask cultural condition of submerged fermentation. Results showed that The total yield of polysaccharide of grifola frondosa，flavonoids and soluble protein yield of phellinus，the yield of vitamin C of coriolus versicolor，the yield of total phenols of flammulina velutipes reached the top，they were respectively 0.349 g/100m L，3.92μmol/100m L and 0.58mg/m L，19.95 g/100mg，5.07 mg/100 mL.By comparison，pleurotus nebrodensis showed the best among all comprehensive targets. Next，the pleurotus nebrodensis was cultivated in a stirred-tank bioreactor.The contents of extracellular polysaccharides and intracellular polysaccharides were obviously increased，but the contents of flavonoids and vitamin C were increased a little，which was noted that the fermentation condition had a great effect on the contents of fermentation products.

edible fungi；submerged fermentation；polysaccharide；flavonoids；vitamin C

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.03.023

2014-10-23

天津市市級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（201410061092）

金紅（1967—），女（漢），研究員，碩士，研究方向：轉(zhuǎn)基因檢測(cè)與生物分離工程。

*通信作者：張斌（1984—），男（漢），工程師，碩士，研究方向：保健功能食品加工與評(píng)價(jià)。