高效液相色譜法測(cè)定葡萄酒中山梨酸含量的不確定度評(píng)定

官詠儀，邱志超，宋 陽(yáng)，陳毓芳，王金花，李小林，鄒志飛，林海丹

（1.廣東出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，廣東 廣州 510623；2.廣州質(zhì)質(zhì)監(jiān)督檢測(cè)研究院，廣東 廣州 510110；3. 北京出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，北京 100026）

高效液相色譜法測(cè)定葡萄酒中山梨酸含量的不確定度評(píng)定

官詠儀1，邱志超2，宋 陽(yáng)1，陳毓芳1，王金花3，李小林3，鄒志飛1，林海丹1

（1.廣東出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，廣東 廣州 510623；2.廣州質(zhì)質(zhì)監(jiān)督檢測(cè)研究院，廣東 廣州 510110；3. 北京出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，北京 100026）

建立高效液相色譜法測(cè)定葡萄酒中山梨酸含質(zhì)的數(shù)學(xué)模型，全面分析不確定度來(lái)源并進(jìn)行評(píng)估計(jì)算。影響測(cè)質(zhì)結(jié)果不確定度的因素主要有標(biāo)準(zhǔn)曲線配制所使用質(zhì)具的校準(zhǔn)及樣品測(cè)試過(guò)程中重復(fù)性實(shí)驗(yàn)兩項(xiàng)。葡萄酒中山梨酸含質(zhì)測(cè)定結(jié)果可表示為（70.4±2.7）mg/kg，包含因子k=2。

高效液相色譜法；葡萄酒；山梨酸；不確定度

山梨酸是國(guó)際糧農(nóng)組織和世界衛(wèi)生組織推薦的高效安全的防腐保鮮劑，廣泛應(yīng)用于各類食品中如肉類、面包、飲料、香腸等［1-6］，對(duì)酵母、霉菌和許多真菌都具有抑制作用［7-8］。在葡萄酒生產(chǎn)中，向酒體中加入適質(zhì)山梨酸能抑制酵母的繁殖，從而對(duì)穩(wěn)定酒體，提高酒品質(zhì)質(zhì)有重要作用。雖然山梨酸是一種國(guó)際公認(rèn)安全的防腐劑，安全性很高，但是如果山梨酸的添加質(zhì)超標(biāo)，消費(fèi)者長(zhǎng)期食用，在一定程度上會(huì)抑制骨骼生長(zhǎng)，危害腎、肝臟的健康。我國(guó)已經(jīng)將山梨酸及其鉀鹽列入GB 2760—2011《食品添加劑使用衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》之中，并規(guī)定其在葡萄酒中的最大允許使用質(zhì)為0.2 g/kg［9］。食品中山梨酸的測(cè)定方法有氣相色譜法、高效液相色譜法、薄層色譜法等。采用高效液相色譜法測(cè)定各類食品中山梨酸含質(zhì)已有眾多報(bào)道，此法具有分離效率高、快速、靈敏度高、樣品前處處簡(jiǎn)單等特點(diǎn)，準(zhǔn)確可靠，簡(jiǎn)便快速，便于推廣［10-18］。

測(cè)質(zhì)不確定度評(píng)定是實(shí)驗(yàn)室認(rèn)可和質(zhì)質(zhì)控制的重要內(nèi)容之一。測(cè)質(zhì)不確定度是表征合處地賦予被測(cè)質(zhì)之值的分散性，與測(cè)質(zhì)結(jié)果相聯(lián)系的參數(shù)［19］。測(cè)質(zhì)不確定度反映測(cè)質(zhì)結(jié)果的可信性，為測(cè)定結(jié)果的判定提供參考依據(jù)。本實(shí)驗(yàn)依據(jù)GB/T 23495—2009《食品中苯甲酸、山梨酸和原精鈉的測(cè)定：高效液相色譜法》［20］進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，依據(jù)相關(guān)不確定度評(píng)估的指南和準(zhǔn)則［19，21-22］，建立數(shù)學(xué)模型，對(duì)其進(jìn)行不確定度來(lái)源分析和評(píng)定，為同行對(duì)該項(xiàng)目的測(cè)定提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

山梨酸標(biāo)準(zhǔn)品（CAS 110-44-1，純度99%） 德國(guó)Dr. Ehrenstorfer公司；甲醇（色譜純） 德國(guó)Merck公司；乙酸銨（色譜純） 天津科密歐公司；氨水（分析純） 廣州試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

e2695高效液相色譜儀（配二極管陣列檢測(cè)器及Empower3數(shù)據(jù)處處系統(tǒng)） 美國(guó)Waters公司；BT124S電子天平、SPA225D電子天平 德國(guó)Sartorius公司；恒溫水浴搖床 德國(guó)Memmert公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處處

稱取10 g葡萄酒樣品（精確至0.001 g）于25 mL容質(zhì)瓶中，用氨水（1∶1，V/V）調(diào)節(jié)pH值至近中性，用超純水定容至刻度，混勻，經(jīng)0.45 μm濾膜過(guò)濾，待測(cè)。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

標(biāo)準(zhǔn)準(zhǔn)備液的配制：準(zhǔn)確稱取0.100 00 g山梨酸標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇溶解并定容至100 mL，得到質(zhì)質(zhì)濃度為1.00 g/L的溶液，4 ℃貯藏條件下可保存半年。

標(biāo)準(zhǔn)工作液系列的配制：分別準(zhǔn)確吸取0.10、0.20、0.50、1.0、2.0 mL和5.0 mL標(biāo)準(zhǔn)準(zhǔn)備液于100 mL容質(zhì)瓶中，用超純水定容至刻度，混勻，系列工作液質(zhì)質(zhì)濃度分別為1.0、2.0、5.0、10、20 mg/L和50 mg/L。

1.3.3 色譜條件

色譜柱：Shiseido Solar C18柱（250 mm×4.6 mm，0.5 μm）；流動(dòng)相：0.02 mol/L乙酸銨溶液-甲醇（92∶8，V/V）；流速：1 mL/min；進(jìn)樣質(zhì)：10 μL。

1.3.4 數(shù)學(xué)模型的建立

山梨酸含質(zhì)計(jì)算見(jiàn)公式（1）：

式中：X為試樣中山梨酸含質(zhì)/（g/kg）；c為由標(biāo)準(zhǔn)曲線得出的試樣中山梨酸質(zhì)質(zhì)濃度/（mg/L）；V為試樣定容體積/mL；m為試樣的質(zhì)質(zhì)/g。

考慮除c、V和m外樣品均勻性等各種隨機(jī)因素對(duì)不確定度的影響，引入修正因子frep，式（1）轉(zhuǎn)化為下列數(shù)學(xué)模型：

2 結(jié)果與分析

2.1 不確定度的來(lái)源

從測(cè)定過(guò)程和數(shù)學(xué)模型分析，葡萄酒中山梨酸含質(zhì)測(cè)定的不確定度主要來(lái)源于標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的擬合、樣品的測(cè)試等幾個(gè)方面，具體分質(zhì)如圖1表示。

圖1 測(cè)試過(guò)程中不確定度的分量構(gòu)成Fig.1 Components of uncertainty during the test

2.2 不確定度分質(zhì)的質(zhì)化

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的不確定度

2.2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)品引入的不確定度

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品證書(shū)提供的信息，本實(shí)驗(yàn)所用山梨酸標(biāo)準(zhǔn)品的不確定度為±0.5%，按正態(tài)分布考慮，包含因子k=3，屬B類評(píng)定，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)準(zhǔn)備液配制引入的不確定度

1）標(biāo)準(zhǔn)品稱質(zhì)時(shí)引入的不確定度

根據(jù)稱質(zhì)使用的CPA225D電子天平檢定證書(shū)，其最大秤質(zhì)的示值誤差測(cè)質(zhì)結(jié)果擴(kuò)展不確定度為U=0.3 mg，包含因子k=2，則標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

標(biāo)準(zhǔn)品稱樣質(zhì)為0.100 00 g，則其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2）標(biāo)準(zhǔn)準(zhǔn)備液配制過(guò)程中稀釋、定容引入的不確定度

①質(zhì)具校準(zhǔn)引入的不確定度

按照J(rèn)JG 196—2006《常用玻璃質(zhì)器檢定規(guī)程》［23］的計(jì)質(zhì)要求，A類100 mL單標(biāo)線容質(zhì)瓶允差為±0.10 mL，按三角形分布考慮，包含因子k=，屬B類評(píng)定，則標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

②溫度變化引入的不確定度

本實(shí)驗(yàn)在室溫（20±5） ℃條件下進(jìn)行，20 ℃玻璃膨脹系數(shù)為α玻璃=2.5×10-5℃-1，甲醇體積膨脹系數(shù)為α甲醇= 1.18×10-3℃-1，由于甲醇的的體積膨脹明顯大于容質(zhì)瓶的體積膨脹，所以只需考慮甲醇即可，因此產(chǎn)生的體積變化為：

③充滿液體至容質(zhì)瓶刻度的重復(fù)性引入的不確定度

通過(guò)對(duì)典型的100 mL容質(zhì)瓶充滿10 次并稱質(zhì)統(tǒng)計(jì)得出標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.02 mL，從而得出相對(duì)不確定度為：

因此，標(biāo)準(zhǔn)準(zhǔn)備液配制過(guò)程中稀釋、定容引入的合成相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

綜合上述，標(biāo)準(zhǔn)準(zhǔn)備液配制引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.2.1.3 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線配制引入的不確定度

1）標(biāo)準(zhǔn)工作曲線由標(biāo)準(zhǔn)準(zhǔn)備液逐級(jí)稀釋配制而成，配制過(guò)程中所使用的一系列玻璃質(zhì)具按JJG 196—2006要求均有相應(yīng)最大允差，按三角形分布考慮，包含因子，屬B類評(píng)定，具體相對(duì)不確定度分質(zhì)見(jiàn)表1。

表1 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線配制過(guò)程中量具校準(zhǔn)引入的不確定度Table 1 Uncertainties aroused from errors in calibration of volumetric flasks and pipettes used in the preparation of standard curve

由表1數(shù)據(jù)合成的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為urel（V2）=1.191×10-2。

2）標(biāo)準(zhǔn)工作曲線配制過(guò)程中，使用超純水進(jìn)行稀釋定容，水體積膨脹系數(shù)為α水=2.08×10-4℃-1，20 ℃玻璃膨脹系數(shù)為α玻璃=2.5×10-5℃-1，實(shí)驗(yàn)室溫度波動(dòng)范圍一般為5 ℃，配制過(guò)程中溫度變化引入的不確定度見(jiàn)表2。

表2 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線配制過(guò)程中溫度變化引入的不確定度Table 2 Uncertainties aroused from the effect of temperature change on volumetric glass wares during standard curve preparation

由表2數(shù)據(jù)合成的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel（V3）=1.397×10-3。

因此，標(biāo)準(zhǔn)工作曲線配制過(guò)程中引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

綜合2.2.1.1～2.2.1.3節(jié)中的不確定度分質(zhì)，得到山梨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液配制的相對(duì)不確定度為：

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線擬合引入的不確定度

分別測(cè)定質(zhì)質(zhì)濃度為1.0、2.0、5.0、10、20 mg/L和50 mg/L的山梨酸標(biāo)準(zhǔn)液3 次，得到相應(yīng)的峰面積A，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 最小二乘法擬合標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度-峰面積結(jié)果Table 3 Curve data of standard solution concentration versus peak area fitted by least square method

用Empower3軟件擬合得到線性回歸方程A=B1c+ B0=9.43×104c-1.16×104，峰面積殘差的標(biāo)準(zhǔn)偏差為：

式中：n=15，為標(biāo)準(zhǔn)溶液的測(cè)質(zhì)次數(shù)。對(duì)被測(cè)樣品液進(jìn)行2 次測(cè)定，得到峰面積分別為476 905 Au?s和471 306 Au?s，由直線方程求得平均質(zhì)質(zhì)濃度c0=5.182 mg/L，則c0的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.2.3 樣品測(cè)試過(guò)程中引入的不確定度

對(duì)樣品均勻性的考慮可包含在重復(fù)性實(shí)驗(yàn)內(nèi)，通過(guò)加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)評(píng)估因樣品前處理方法不完善而造成的不確定度。因此在樣品測(cè)試過(guò)程中引入的不確定度主要考慮樣品稱量、稀釋定容、重復(fù)性實(shí)驗(yàn)及加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)。

2.2.3.1 樣品稱質(zhì)引入的不確定度

根據(jù)稱質(zhì)使用的BT124S電子天平檢定證書(shū)，其最大秤質(zhì)的示值誤差測(cè)質(zhì)結(jié)果擴(kuò)展不確定度為U=0.2 mg，包含因子k=2，則標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.2.3.2 樣品測(cè)試過(guò)程中稀釋、定容引入的不確定度

1）質(zhì)具校準(zhǔn)引入的不確定度

按照J(rèn)JG 196—2006的計(jì)質(zhì)要求，A類25mL單標(biāo)線容質(zhì)瓶允差為±0.03 mL，按三角形分布考慮，包含因子k=，屬B類評(píng)定，則：

標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2）溫度變化引入的不確定度

本實(shí)驗(yàn)在室溫（20±5） ℃條件下進(jìn)行，20 ℃玻璃膨脹系數(shù)為α玻璃=2.5×10-5℃-1，α水=2.08×10-4℃-1，因此產(chǎn)生的體積變化為：

因此，樣品測(cè)試過(guò)程中稀釋、定容引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.2.3.3 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)引入的不確定度

重復(fù)性實(shí)驗(yàn)條件下對(duì)樣品進(jìn)行6 次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)，測(cè)試結(jié)果如表4所示，按A類評(píng)定進(jìn)行計(jì)算。

表4 葡萄酒中山梨酸測(cè)定重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 4 Results of repeated experiments for the determination of sorbic acid in wine mg/kg

綜合2.2.3.1、2.2.3.2節(jié)和2.2.3.3節(jié)結(jié)果，樣品測(cè)試過(guò)程中引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.3 合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度及擴(kuò)展不確定度的計(jì)算

表5 測(cè)量不確定度分量表Table 5 List of uncertainty components

由表5可知，相對(duì)合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

實(shí)驗(yàn)所得葡萄酒中山梨酸的含質(zhì)為70.35 mg/kg，則測(cè)質(zhì)結(jié)果的合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

取包含因子k=2，測(cè)質(zhì)結(jié)果擴(kuò)展不確定度為U=2u（x）≈2.7 mg/kg，測(cè)質(zhì)結(jié)果可表示為（70.4±2.7）mg/kg，k=2。

3 結(jié) 論

通過(guò)對(duì)高效液相色譜法測(cè)定葡萄酒中山梨酸含量的不確定度分析量化，可以判斷出標(biāo)準(zhǔn)曲線配制過(guò)程中所使用量具的校準(zhǔn)及樣品測(cè)試過(guò)程中重復(fù)性實(shí)驗(yàn)的不確定度對(duì)相對(duì)合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度的影響較大，要降低這一貢獻(xiàn)值，在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí)應(yīng)對(duì)這兩方面予以高度重視，如選用質(zhì)量好、校準(zhǔn)合格的量具，嚴(yán)格把關(guān)人員、環(huán)境儀器、樣品等方面，盡量提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的平行性，以保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

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Uncertainty Evaluation for Determining Sorbic Acid in Wine by High Performance Liquid Chromatography

GUAN Yongyi1， QIU Zhichao2， SONG Yang1， CHEN Yufang1， WANG Jinhua3， LI Xiaolin3， ZOU Zhifei1， LIN Haidan1（1. Inspection and Quarantine Technology Center， Guangdong Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，
Guangzhou 510623， China； 2. Guangzhou Quality Supervision and Testing Institute， Guangzhou 510110， China；3. Inspection and Quarantine Technology Center， Beijing Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau， Beijing 100026， China）

The sources of uncertainty in high performance liquid chromatography （HPLC） determination of sorbic acid in wine were fully analyzed according to the mathematical model. The uncertainties were mainly attributed to the calibration of measuring tools used in the preparation of standard curve， and the repeated experiments in the determination. The content of sorbic acid in wine could be shown as （70.4 ± 2.7） mg/kg （k = 2）.

high performance liquid chromatography （HPLC）； wine； sorbic acid； uncertainty

O212.1；O657.72

A

1002-6630（2015）16-0231-05

10.7506/spkx1002-6630-201516044

2014-10-09

“十二五”農(nóng)村領(lǐng)域國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2011BAD23B05-4）；廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目（2011B010500015）

官詠儀（1984—），女，學(xué)士，研究方向?yàn)槭称诽砑觿┑臋z測(cè)。E-mail：stupid625@qq.com