四臂星型生物素化聚乙二醇－聚丙交酯的合成與性能研究

（山東省藥學(xué)科學(xué)院山東省醫(yī)用高分子材料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東濟(jì)南250101）

聚丙交酯（PLA）由于其優(yōu)良的生物降解性、生物相容性及安全性，一直被視為一種具有優(yōu)越應(yīng)用前景的醫(yī)用可降解高分子材料，其作為藥物控釋載體方面的應(yīng)用一直是近年來的研究熱點(diǎn)［1］。但由于PLA 的疏水性，其在體內(nèi)與細(xì)胞的相容性較差，容易被體內(nèi)的巨噬細(xì)胞吞噬。此外，PLA 作為藥物載體也不具有主動(dòng)靶向性。因而，對(duì)其進(jìn)行親水性改性和靶向修飾的研究非常多［2－4］。使用改性和修飾的PLA 作為藥物載體可以大大提高藥物的生物利用度，降低藥物的毒副作用。相對(duì)于線性PLA，多支化、星型PLA 分子表面有高密度的官能團(tuán)且內(nèi)部易形成大量的空腔，使藥物分子可以物理包封于聚合物的內(nèi)部空腔中，從而提高藥物的包載率［5］。

生物素－親和素系統(tǒng)（biotin－avidin system，BAS）是20世紀(jì)70年代末發(fā)展起來的一種新型生物反應(yīng)放大系統(tǒng)，具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、穩(wěn)定性高的特點(diǎn)［6－7］。目前，通過BAS介導(dǎo)的腫瘤靶向治療已成為最新研究熱點(diǎn)之一。將藥物或藥物載體進(jìn)行生物素化，與含有生物素的抗體通過親和素的橋連作用而連接，然后通過抗體－抗原間的特異識(shí)別作用，便可以實(shí)現(xiàn)對(duì)靶細(xì)胞的定向輸送［8－9］。

作者合成了一種四臂星型生物素化聚乙二醇－聚丙交酯嵌段共聚物［PET－（PLA－PEG－biotin）4］，并對(duì)其化學(xué)結(jié)構(gòu)和性能進(jìn)行了研究。擬為其作為一種新型的靶向藥物載體的研究和應(yīng)用提供參考。合成路線如圖1所示。

圖1 四臂星型生物素化聚乙二醇－聚丙交酯的合成路線Fig.1 The synthetic route of 4－arms star polymer PET－（PLA－PEG－biotin）4

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 試劑

丙交酯（LA，左旋，純度≥99.5%），參照文獻(xiàn)［10］自制；季戊四醇（PET），分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；辛酸亞錫，分析純，Sigma 公司；聚乙二醇（PEG，分子量1 500g·mol－1），EHSY 公司；丁二酸酐（SA），分析純，天津致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；三乙胺（TEA），分析純，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司；二環(huán)己基碳二亞胺（DCC）、4－二甲氨基吡啶（DMAP）、N－羥基琥珀酰亞胺（NHS）、生物素，純度≥99%，上海源葉生物科技有限公司；氯仿，色譜純，美國(guó)JT Baker公司；乙醇、二氯甲烷、二甲基亞砜，分析純，天津廣成化學(xué)試劑公司。

1.2 四臂星型生物素化聚乙二醇－聚丙交酯的合成

1.2.1 四臂星型聚丙交酯－聚乙二醇嵌段共聚物［PET－（PLA－PEG）4］的合成

PET－PLA4的合成：將一定量的PET 置于反應(yīng)瓶中，加入0.2%（以單體質(zhì)量計(jì)）的辛酸亞錫，然后加入一定質(zhì)量的LA，在150 ℃、70 Pa 下磁力攪拌反應(yīng)24h，產(chǎn)物用二氯甲烷溶解后用乙醇沉淀純化，50 ℃真空干燥48h。

羧基化PET－PLA4的合成：稱取一定量的PETPLA4和丁二酸酐（物質(zhì)的量比1∶4.5），加入適量三乙胺及4－二甲氨基吡啶，溶于一定量的二甲基亞砜中，室溫下反應(yīng)24h，產(chǎn)物于無水乙醇中沉淀洗滌3次，真空干燥48h。

PET－（PLA－PEG）4的合成：稱取一定量的羧基化PET－PLA4和PEG（物質(zhì)的量比1∶4），加入適量二環(huán)己基碳二亞胺和4－二甲氨基吡啶，溶于二氯甲烷中，40 ℃磁力攪拌反應(yīng)24h，產(chǎn)物于無水乙醇中沉淀，40℃真空干燥48h。

1.2.2 琥珀酰亞胺生物素酯（biotin－NHS）的合成

稱取一定量的生物素和N－羥基琥珀酰亞胺（物質(zhì)的量比1∶1.2），加入二環(huán)己基碳二亞胺，以二甲基甲酰胺為溶劑，置于80℃油浴中磁力攪拌至完全溶解后于室溫下繼續(xù)攪拌反應(yīng)24h。產(chǎn)物于冷的異丙醇中沉淀，抽濾得白色粉末，然后再溶于二甲基甲酰胺中，重結(jié)晶2次，產(chǎn)物于40 ℃真空干燥48h。

1.2.3 四臂星型生物素化聚乙二醇－聚丙交酯［PET－（PLA－PEG－biotin）4］的合成

稱取一定量的PET－（PLA－PEG）4和biotin－NHS（物質(zhì)的量比1∶1.2），加適量二甲基亞砜溶解，通氮?dú)獗Ｗo(hù)，40 ℃磁力攪拌反應(yīng)48h。產(chǎn)物于無水乙醇中沉淀，40 ℃真空干燥48h，得白色粉末狀固體。

1.3 表征方法

以CDCl3為溶劑，采用德國(guó)Bruker Avance 400 MHz型核磁共振儀測(cè)定聚合物的核磁圖譜；采用美國(guó)Waters 2414型凝膠滲透色譜儀（GPC）測(cè)定聚合物的重均分子量、數(shù)均分子量及分子量分布系數(shù)，氯仿為流動(dòng)相，聚苯乙烯為標(biāo)準(zhǔn)品，流速1.0mL·min－1，測(cè)試溫度30℃；采用日本島津DSC60型示差掃描量熱儀測(cè)定聚合物的熱性能，升溫速率10 ℃·min－1；采用瑞士Krüss公司Krüss－K12型程序界面張力儀測(cè)定聚合物靜態(tài)水接觸角。

2 結(jié)果與討論

2.1 嵌段共聚物的結(jié)構(gòu)表征

2.1.1 PET－PLA4與PET－（PLA－PEG－biotin）4的核磁共振氫譜（圖2）

圖2 PET－PLA4（a）與PET－（PLA－PEG－biotin）4（b）的核磁共振氫譜Fig.2 1 HNMR Spectra of PET－PLA4（a）and PET－（PLA－PEG－biotin）4（b）

在PET－PLA4的圖譜（圖2a）中：5.1～5.2ppm處是PLA 鏈段上次甲基的質(zhì)子峰；1.5～1.6ppm 處是PLA 的甲基質(zhì)子峰；4.2ppm 處的小峰是與丙交酯聚合后的季戊四醇分子上亞甲基的質(zhì)子峰。

在PET－（PLA－PEG－biotin）4的圖譜（圖2b）中：PLA 鏈段上的甲基和次甲基的質(zhì)子峰位置與PETPLA4一致；3.65ppm 處是PEG 鏈段上亞甲基的質(zhì)子峰；而4.2ppm 和4.5ppm 處的小峰分別為生物素分子上與亞胺基相鄰的兩個(gè)次甲基的特征峰。

從PET－PLA4的圖譜中可以看出，原季戊四醇的亞甲基在3.45ppm 處的特征峰消失，與丙交酯聚合后其亞甲基峰位移至4.2ppm 處，說明季戊四醇與丙交酯反應(yīng)完全。通過4.2ppm 處季戊四醇亞甲基質(zhì)子峰面積與1.5～1.6ppm 處PLA 鏈段甲基的質(zhì)子峰面積之比，推算得出所合成的PET－PLA4的數(shù)均分子量約為17 000g·mol－1。從PET－（PLA－PEG－biotin）4的圖譜中生物素相應(yīng)的質(zhì)子峰面積與PEG 和PLA 的質(zhì)子峰面積的比例，可以推算出生物素的接枝率為4.43%，此接枝率遠(yuǎn)高于同分子量的線性聚合物。

2.1.2 PET－PLA4與PET－（PLA－PEG－biotin）4的分子量

凝膠滲透色譜測(cè)定結(jié)果表明，PET－（PLA－PEGbiotin）4的分子量高于PET－PLA4，PET－PLA4的數(shù)均分子量為18 498g·mol－1，稍大于核磁推算的理論值17 000g·mol－1，其重均分子量為31 674g· mol－1，PDI 為1.712。而PET－（PLAPEG－biotin）4的為23 872g·mol－1，略小于核磁理論推算值23 896g·mol－1，其為43 957g·mol－1，PDI為1.841，分子量分布較窄。該測(cè)量結(jié)果與核磁推算結(jié)果基本一致，兩者數(shù)值上的差異主要源于兩種測(cè)試方法的不同及系統(tǒng)本身的誤差。

2.2 嵌段共聚物的熱性能分析

PET－PLA4和PET－（PLA－PEG－biotin）4的示差掃描量熱曲線如圖3所示。

從圖3可以看出：PET－PLA4僅在160 ℃左右有一明顯的吸熱峰，這是聚丙交酯的熔融峰；PET－（PLA－PEG－biotin）4在相同溫度下也有一吸熱峰，是共聚物中聚丙交酯鏈段的熔融引起的，除此以外，共聚物在45 ℃左右還有一較小的吸熱峰，與PEG 的熔融溫度一致，而生物素由于熔融溫度高，且相對(duì)含量低，在DSC譜圖中未有表現(xiàn)。

圖3 PET－PLA4 與PET－（PLA－PEG－biotin）4 的示差掃描量熱曲線Fig.3 DSC Curves of PET－PLA4and PET－（PLA－PEG－biotin）4

2.3 嵌段共聚物的親水性分析

PET－PLA4和PET－（PLA－PEG－biotin）4的靜態(tài)水接觸角圖片如圖4所示。

圖4 PET－PLA4 與PET－（PLA－PEG－biotin）4 的靜態(tài)水接觸角圖片F(xiàn)ig.4 Static water contact angle images of PET－PLA4and PET－（PLA－PEG－biotin）4

由圖4可知，PET－PLA4的靜態(tài)水接觸角明顯大于PET－（PLA－PEG－biotin）4。接觸角越大，說明其親水性越差，可知PET－（PLA－PEG－biotin）4的親水性優(yōu)于PET－PLA4。在共聚物結(jié)構(gòu)單元中，PLA 鏈段及生物素分子都是疏水性的，而PEG 為親水性，說明PEG的引入明顯改善了材料表面的親水性。

3 結(jié)論

以季戊四醇為引發(fā)劑，合成了四臂星型聚丙交酯，然后與聚乙二醇反應(yīng)，合成了四臂星型聚丙交酯－聚乙二醇共聚物［PET－（PLA－PEG）4］，最后生物素活化后與共聚物末端羥基反應(yīng)，合成了四臂星型生物素化聚乙二醇－聚丙交酯［PET－（PLA－PEG－biotin）4］。核磁表征發(fā)現(xiàn)，PET－（PLA－PEG－biotin）4四臂星型結(jié)構(gòu)大大提高了生物素的接枝率；凝膠滲透色譜測(cè)定表明，其分子量分布較窄；DSC 測(cè)試表明，其熱性能和PETPLA4不同；靜態(tài)水接觸角測(cè)試表明其親水性有明顯改善。

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