·論著·

索拉菲尼與異硫氰酸4-(甲基亞磺酰)丁酯體外協(xié)同殺傷肝癌細胞實驗研究

何文婷1，鞏志榮2,孫治國2，王美平2，高潔2，鐘延強2，魯瑩1,2(1.福建中醫(yī)藥大學藥學系，福建 福州 350108；2 .第二軍醫(yī)大學藥學院，上海 200433)

[摘要]目的 探討索拉菲尼(sorafenib，SO)聯合異硫氰酸4-(甲基亞磺酰)丁酯(sulforaphane,SF)殺傷肝癌細胞HepG2的協(xié)同比例。方法 采用CCK-8法探討SO和SF對HepG2殺傷效果最強的協(xié)同比例，利用協(xié)同指數(CI)反映協(xié)同殺傷效應：CI>1.1為拮抗；0.91.1)；在10∶1時，為相加作用(0.9

[關鍵詞]肝癌；索拉菲尼；異硫氰酸4-(甲基亞磺酰)丁酯；協(xié)同殺傷

[作者簡介]何文婷，碩士研究生.E-mail:simona49@163.com

[通訊作者]魯瑩，博士，副教授.研究方向：微粒靶向遞藥系統(tǒng).Tel:02-81871290;E-mail:acuace@163.com

[中圖分類號]R965[文獻標志碼]A

DOI[]10.3969/j.issn.1006-0111.2015.02.012

[收稿日期]2014-09-28[修回日期]2014-12-26

Synergic effects of sorafenib combined with sulforaphane against hepatocellular carcinoma cellsinvitro

HE Wenting1,GONG Zhirong2,SUN Zhiguo2,WANG Meiping2, GAO Jie2,ZHONG Yanqiang2,LU Ying1，2(1.Department of Pharmacy, Fujian University of Traditional Chinese Medicine, Fuzhou 350108, China;2.Department of Pharmaceutics,School of Pharmacy, Second Military Medical University, Shanghai 200433,China)

Abstract[]ObjectiveTo investigate the synergic ratio of sorafenib (SO) and sulforaphane (SF) against the hepatocellular carcinoma cell line HepG2 in vitro. MethodsThe synergic effect of SO combined with SF against HepG2 cells was determined by the CCK8 assay (the synergic effect was determined by combination index (CI) value: CI>1.1, antagonistic; 0.91.1), whereas 20∶1,5∶1 and 1∶5 ratio resulted in synergistic activity (CI<0.9). Furthermore, 10∶1 ratio acted as an additive effective (0.9

[Key words]hepatocellular carcinoma; sorafenib(SO); sulforaphane(SF);synergic effect

原發(fā)性肝癌(簡稱：肝癌)在我國癌癥死亡率中已排名第二，索拉菲尼(sorafenib，SO)是一種雙芳基尿素類口服多激酶抑制劑，可以靶向于腫瘤細胞及腫瘤血管上絲氨酸(蘇氨酸)激酶及受體絡氨酸激酶，具有同時抑制腫瘤細胞增殖和阻斷血管生成的雙重作用，是目前世界上第一個被批準應用于臨床的多靶點的分子靶向治療藥物[1]。SO是治療晚期肝癌的一線藥物，能顯著改善晚期肝癌患者的生存狀態(tài)。然而，在胰臟神經內分泌瘤、膠質母細胞瘤和乳腺癌腫瘤鼠模型上研究顯示[2,3]，SO具有與抗血管生成物有關的作用，即增加了腫瘤的生長及腫瘤轉移的可能。在許多惡性腫瘤中，SO可以誘導NF-κB的過表達，而NF-κB 被定義為上皮細胞間質轉換(EMT)和乳腺癌轉移模型的中介物。

異硫氰酸4-(甲基亞磺酰)丁酯(sulforaphane，SF)是一種在綠葉花菜中的異硫氰酸鹽，在SO和SF聯合治療胰腺癌的研究中發(fā)現[4]，盡管SF本身并未增強與啟動子區(qū)域NF-κB復合物的結合，但它可顯著降低SO介導的NF-κB活性。SF下調NF-κB活性在前列腺癌以及結、直腸癌中也有報道[5-7]。此外，也有研究表明,聯合使用SO和SF可顯著抑制由缺氧導致的細胞轉移[4]。

基于以上研究，本實驗首次研究觀察SO聯合SF對肝癌細胞HepG2的體外協(xié)同殺傷作用，以期降低由SO引起的腫瘤細胞轉移副作用，為肝癌的體內研究及綜合治療提供實驗依據。

1材料與方法

1.1藥品與試劑SO(大連美侖生物技術有限公司)，SF(天津大學合成)，DMEM培養(yǎng)基 Hyclone(美國Thermo公司)，小牛血清Gibco、0.25%胰蛋白酶溶液(含0.02%EDTA)Gibco(InvitrogenTM美國Life Technologies Corporation公司)，CCK-8 (cell counting kit-8，日本Dojindo Laboratories)，PBS(美國賽默飛世爾科技公司)，二甲基亞砜 (DMSO，Sigma-Aldrich)，0.4%臺盼藍染液(trypan blue)[研域(上海)化學試劑有限公司]。AnnexinV-FITC細胞凋亡試劑盒(美國BD公司)。

1.2細胞培養(yǎng)人肝癌細胞株HepG2在添加10%小牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基中于37 ℃、5% CO2的條件下連續(xù)培養(yǎng)；每2～3 d傳代。所用細胞均為20代以內。

1.3藥物配制精密稱取SF 18.32 mg，溶解于10 ml水中，配制為10 mmol/L SF水溶液。精密稱取SO 318.5 mg，溶解于5 ml DMSO溶劑中，配成100 mmol/L SO溶液,用聚氧乙烯蓖麻油、無水乙醇以1∶1比例稀釋4倍。-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4實驗方法

1.4.1CCK-8法檢測SO與SF對HepG2細胞的殺傷活性取對數生長期的HepG2細胞，以每孔3 000個的密度接種于96孔板中，接種好的細胞于37 ℃、5% CO2的條件下培養(yǎng)12 h，讓細胞貼壁。實驗分為空白組、未處理組和藥物處理組。進一步用添加10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基稀釋SO與SF至500 μmol/L，進而以3倍比例稀釋，共9個濃度，每組設3個復孔。于37 ℃、5% CO2的條件下藥物作用48 h，加入10%CCK-8培養(yǎng)液，孵育2 h后，酶標儀測定在450 nm處的吸光度值(A)。計算細胞存活率(CV)∶CV(%)=(實驗組A-空白組A)/(未處理組A-空白組A)×100%，Graphpad6.0計算半數抑制濃度(IC50)。實驗重復3次。

1.4.2CCK-8法檢測SO聯合SF對HepG2細胞的殺傷作用細胞接種方法及分組同“1.4.1”。藥物處理組包括單獨SO、SF組以及不同比例SO與SF聯合組。選取標準為單獨SO或SF濃度殺傷范圍涵蓋5%～95%，選擇單獨SO和SF最高濃度分別為20、40 μmol/L，2倍比例稀釋6個濃度；SO與SF聯合組選取摩爾比20∶1、10∶1、5∶1、1∶1、1∶5、1∶10、1∶20 7個比例，且最高濃度比分別為800∶40、400∶40、200∶40、100∶100、40∶200、40∶400、40∶800，3倍比例稀釋，分6個濃度，每個濃度設3個復孔，使得混合比例中單獨的SO或者SF濃度殺傷范圍也能夠涵蓋5%～95%。藥物作用72 h后，使用CCK-8法檢測450 nm處A值，并計算其存活率及殺傷效力Fa，Fa=1-CV,使用Compusyn1.0計算協(xié)同指數(CI)。實驗重復3次。

1.4.3平板克隆形成實驗檢測協(xié)同拮抗及相加比例下的克隆形成數進一步使用平板克隆形成實驗對協(xié)同、拮抗以及相加比例進行驗證。取對數期1×105個/ml HepG2細胞接種于12孔板，同樣在37 ℃、5% CO2的條件下培養(yǎng)12 h讓細胞貼壁。實驗分空白組和藥物處理組。藥物處理組包括單獨SO、SF組，以及不同比例藥物處理組。藥物作用48 h后，棄去藥物，用PBS洗2遍，0.25%胰酶消化后吹打成單個懸浮細胞，細胞計數板計數，逐級稀釋，按照200個/ml、每孔2 ml接種于6孔板中，每組3個復孔，繼續(xù)在37 ℃、5% CO2的條件下培養(yǎng)。每4 d換液，10 d后，當出現肉眼可見克隆時終止培養(yǎng)，棄去培養(yǎng)基，用PBS清洗，1%結晶紫染色20 min，PBS洗2遍，拍照，顯微鏡下計數。

1.4.4AnnexinV/PI檢測協(xié)同拮抗及相加比例下的細胞凋亡采用 FITC-Annexin V和碘化丙啶試劑分析各藥物處理組細胞的凋亡。對數期2×105個/ml HepG2細胞接種于6孔板, 在37 ℃、5% CO2的條件下培養(yǎng)12 h讓細胞貼壁。實驗分組同“1.4.3”，每組2個復孔。藥物作用48 h后，保留上清液，使用不含EDTA 0.25%胰酶消化細胞，PBS洗2遍，加入500 μl結合液，加入5 μl Annexin V-FITC與5 μl碘化丙啶，輕輕混勻。室溫(20～25 ℃)避光孵育10 min。待孵育結束后入流式細胞儀檢測。

2實驗結果

2.1SO與SF單獨殺傷HepG2細胞0.076～500 μmol/L的SO和SF 對HepG2細胞的抑制呈現濃度依賴效應, 即隨著藥物濃度增加，細胞生長抑制效應也增強(圖1)。SO和SF對HepG2細胞作用48 h的半數抑制濃度IC50分別為(8.105±3.098)、(20.93±3.083) μmol/L。

圖1　SO與SF單獨對肝癌細胞 HepG2的細胞存活率(n=3, ±s，%)

2.2SO與SF協(xié)同殺傷HepG2細胞通過比較不同比例下不同濃度的SO和SF對HepG2細胞的抑制率以及協(xié)同指數CI值來評價兩藥的協(xié)同效果。當CI>1.1、0.9200 μmol/L時，CI值遠大于1,表現為拮抗作用；SO與SF摩爾比例為1∶1、1∶10、1∶20時，CI>1.1，表現為拮抗作用；兩藥比例為10∶1時，0.9

圖2　SO與SF聯合治療對HepG2 肝癌細胞的殺傷作用(n=3, ±s)

2.3平板克隆形成實驗驗證SO與SF協(xié)同殺傷效果分別選取SO∶SF協(xié)同、相加、拮抗比例5∶1、10∶1、1∶1，對不同比例下不同濃度的協(xié)同、相加、拮抗作用進行驗證。結果顯示，當SO∶SF在5∶1協(xié)同比例下(圖3G組)其克隆形成數(14.66±4.08)與單獨使用SO(24.0±3.60)或SF(25.7±1.57)相比具有顯著性差異，P<0.01；并且協(xié)同比例下克隆形成數(14.66±4.08)也明顯低于拮抗比例1∶1(圖3H組)克隆形成數(31.33±5.16)，P<0.01；10∶1(圖3F組)相加比例下克隆形成數(24.67±3.52)與單獨使用SO或SF無顯著性差異，P>0.05，結果均在預期范圍之內(圖 3)。

圖3　SO與SF單獨或聯合作用對HepG2 細胞克隆形成數的影響 ( *P<0.05， **P<0.01，與B組比較， △△P<0.01，與G組比較，n=3);A.空白組；B.SO 4 μmol/L;C.SF 4 μmol/L;D.SF 0.8 μmol/L;E.SF 0.4 μmol/L;F.SO (4 μmol/L)+ SF(0.4 μmol/L);G.SO (4μmol/L)+SF(0.8 μmol/L); H.SO(4 μmol/L)+SF(4 μmol/L)

2.4SO與SF協(xié)同比例下促進HepG2細胞的凋亡SO與SF主要抑制HepG2細胞早期凋亡。如表1所示，未經任何藥物處理的細胞，早期以及晚期凋亡的細胞總量不到 10% (8.44%±1.75%)，且在協(xié)同比例5∶1時，SO與SF濃度分別是8、1.6 μmol/L時其早期凋亡率(18.9±3.87)%明顯高于拮抗比例1∶1,兩藥濃度分別是8、8 μmol/L時的早期凋亡率(4.76±0.06)%；且協(xié)同、拮抗比例組的早期凋亡率分別為(18.9±3.87)%、(4.76±0.06)%，與單獨SO組(5.31±1.86)%相比，P<0.01，但相加比例組的早期凋亡率(12.9±2.73)%與單獨SO組(5.31±1.86)%相比也有顯著性差異(P<0.01)。

**P<0.01,與SO=8 μmol/L組比較

3討論

SO聯合奧沙利鉑[9]、5-FU和甲酰四氫葉酸[10]、阿霉素[11]、多烯紫杉醇[12]、紫杉醇和卡鉑[13]等藥，在一些Ⅰ、Ⅱ期臨床試驗中顯示出良好的抗腫瘤活性。從機制上講，SO一方面抑制了由內皮細胞表達的VEGF-2和VEGF-3，另一方面抑制了PDGFR-β、FLT3、Ret及c-Kit[14,15]，從而具有抑制腫瘤細胞增殖和阻斷血管生成的雙重作用。

SF的化學預防腫瘤效果通過阻斷作用和抑制作用兩方面進行評價[16]。阻斷作用表現在SF 通過抑制Ⅰ期新陳代謝酶來抑制致癌前物質轉變?yōu)橹掳┪?，并誘導Ⅱ期新陳代謝酶促進致癌物的排泄。而SF 的抑制作用在于誘導細胞凋亡和與細胞周期停滯相關的分子，包括Bcl-2 蛋白家族、caspases、P21，細胞周期蛋白(cyclins)以及細胞周期蛋白激酶[17]。此外，SF可以通過下調血管內皮生長因子(VEGF)(HIF-1低氧誘導性因子-1)、基質金屬蛋白酶2、基質金屬蛋白酶9來抑制血管生成和腫瘤轉移[17]。

抗腫瘤藥物的聯合作用是協(xié)同還是拮抗取決于兩藥聯合使用的濃度與比例。有研究表明，當喜樹堿與阿霉素以5∶1的比例同時作用于膠質瘤細胞時，顯示出明顯的拮抗作用，而以1.5∶1比例作用時則表現出協(xié)同作用[18]。

本實驗通過比較SO與SF的7種不同摩爾比，每個比例篩選6種不同濃度,利用協(xié)同指數(CI)值，篩選出對肝癌細胞HepG2的協(xié)同、拮抗及相加比例，并通過平板克隆形成實驗及細胞凋亡結果對不同比例進行驗證，結果表明SO與SF在5∶1比例下，其克隆形成數與誘導細胞凋亡的能力均顯著強于兩藥在1∶1拮抗比例下的作用效果(P<0.01)。目前還未見關于兩藥聯合作用于肝癌細胞的相關文獻報道。

此外，腫瘤細胞生長、 增殖、 分化和轉移相關的信號傳導是一個極其復雜、 多因素、多途徑的蛋白網絡系統(tǒng)，因此針對某個單一靶點進行治療，往往不足以遏制腫瘤的進展，需要聯合不同作用途徑和機制的藥物多靶點聯合阻斷信號傳導、 抑制腫瘤生長。SO與SF聯合作用的機制可能與相關信號轉導通路NF-κB相關，兩藥聯合作用的機制以及在體內試驗的作用效果還有待進一步研究。藥物聯合的最佳應用模式及對其他腫瘤的療效仍需大量體內試驗及臨床試驗進一步研究，爭取對特定的、適合的腫瘤患者實施個體化治療，以最小的經濟代價獲得最佳的治療效果。

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[本文編輯]李睿旻