·論著·

大蒜素對(duì)空腸彎曲桿菌抑菌作用的研究

潘洪濤1，楊宗興1，趙文萃1，王艷萍1，宋海艷1,2，張琦1(1.解放軍208醫(yī)院，吉林 長(zhǎng)春 130062； 2.延邊大學(xué)藥學(xué)院，吉林 延吉 133000)

[摘要]目的 研究大蒜素對(duì)空腸彎曲桿菌的抑菌作用和強(qiáng)度。方法 采用紙片擴(kuò)散法(K-B法)測(cè)定抑菌圈直徑；采用肉湯稀釋法分別測(cè)定大蒜素、環(huán)丙沙星、紅霉素對(duì)空腸彎曲桿菌的最低抑菌濃度(MIC)，比較大蒜素、環(huán)丙沙星、紅霉素的最低抑菌濃度及抑菌率。結(jié)果 大蒜素(MIC為12.80 μg/ml，抑菌率90.40%)對(duì)空腸彎曲桿菌的抑菌作用較環(huán)丙沙星(MIC為20.48 μg/ml，抑菌率90.21%)和紅霉素(MIC為35.84 μg/ml，抑菌率90.33%)更強(qiáng)。結(jié)論大蒜素對(duì)空腸彎曲桿菌具有抑菌作用。

[關(guān)鍵詞]大蒜素；環(huán)丙沙星；紅霉素；最低抑菌濃度；抑菌率

[作者簡(jiǎn)介]潘洪濤，副主任技師.Tel:15304451257；E-mail:pta208@163.com

[通訊作者]趙文萃，副主任藥師.研究方向：藥劑學(xué).Tel:(0431)86988148；E-mail:zhaowencui208@126.com

[中圖分類號(hào)]R96[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

DOI[]10.3969/j.issn.1006-0111.2015.02.014

[收稿日期]2014-03-03[修回日期]2014-09-24

Study on anti-microbial activity of allicin oncampylobacterjejuni

PAN Hongtao1, YANG Zongxing1,ZHAO Wencui1,WANG Yanping1,SONG Haiyan1，2,ZHANG Qi1(1.Department of Pharmacy, No.208 Hospital of PLA, Changchun 130062, China； 2.College of Pharmacy,Yanbian University, Yanji 133000, China)

Abstract[]ObjectiveTo study the anti-microbial activity and strength of allicin on Campylobacter jejuni.MethodsDisc diffusion method (K-B) was used to determine the diameter of the bacteriostatic ring. The minimal inhibitory concentration (MIC) of allicin, ciprofloxacin and erythromycin were detected by constant broth dilution method, respectively.The minimal inhibitory concentrations and bacteriostatic rate of allicin,ciprofloxacin and erythromycin were compared.ResultsThe anti-microbial activity on Campylobacter jejuni of allicin (MIC 12.8 μg/ml, bactetiostatic rate 90.40%) was better than that of ciprofloxacin (MIC 20.48 μg/ml, bactetiostatic rate 90.21%) and erythromycin (MIC 35.84 μg/ml, bactetiostatic rate 90.33%).ConclusionAllicin has anti-microbial activity on Campylobacter jejuniin vitro.

[Key words]allicin; ciprofloxacin; erythromycin; MIC; bacteriostatic rate

大蒜素是由大蒜的鱗莖中提取的一種有機(jī)硫化物，為大蒜的主要生物活性成分，化學(xué)名為二烯丙基三硫化物(diallyltrisulfide, DATS)。大蒜素具有降血壓、降血脂、抗心律失常、抑菌等多種藥理作用，因其具有很強(qiáng)的抗菌作用，也被稱為天然廣譜抗生素[1]。2012年國(guó)外報(bào)道，大蒜素對(duì)引起人類腹痛、腹瀉和發(fā)熱的彎曲桿菌有抑制作用。美國(guó)每年有240萬(wàn)人發(fā)生腹痛、腹瀉和發(fā)熱等病。大蒜素能夠破壞空腸彎曲桿菌生物膜和減少細(xì)胞內(nèi)三磷酸腺苷的數(shù)量，抑制細(xì)胞代謝，進(jìn)而殺滅彎曲桿菌[3]。本實(shí)驗(yàn)采用自行提取的大蒜素，研究其對(duì)空腸彎曲桿菌的抑菌作用，通過(guò)比較大蒜素、環(huán)丙沙星、紅霉素對(duì)空腸彎曲桿菌的抑菌效用，探討大蒜素的抑菌作用及強(qiáng)度。

1材料

1.1儀器CP225D微量電子天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)；UV-3200S紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海美譜達(dá)儀器有限公司)； LC-10ATVP高效液相色譜儀(日本島津公司)；TDL-5B離心機(jī)(上海菲恰爾分析儀器有限公司)；TN-100C(Ⅱ)托盤扭力天平(上海良平儀器儀表有限公司)；RE-52旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)；SH2-D(Ⅲ)循環(huán)水式真空泵(鞏義布予華儀器有限公司)；BC-J80S 二氧化碳培養(yǎng)箱(上海博訊實(shí)業(yè)公司)；XFS-280CB 手提式壓力滅菌器(浙江新豐醫(yī)療器械有限公司)；HR40-IIA2生物安全柜(青島海爾特種電器公司)；CN0025A CampyGen微需氧產(chǎn)氣袋(OXOID，英國(guó))；厭氧罐(日本三菱瓦斯化學(xué)株式會(huì)社)；Transferpette微量移液器(德國(guó))。

1.2試藥大蒜素對(duì)照品(含量為88.4%，中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：100384-201102)；大蒜素粗提取液(解放軍208醫(yī)院藥劑科實(shí)驗(yàn)室自制，濃度為14.62mg/ml)；鹽酸環(huán)丙沙星(含量為99.30%，武漢勝天宇生物科技有限公司，批號(hào)：130601)；紅霉素(含量為92.50%，武漢勝天宇生物科技有限公司，批號(hào)：201304006)；環(huán)丙沙星藥敏紙片(OXOID，英國(guó))；紅霉素藥敏紙片(OXOID，英國(guó))；馬尿酸鈉(北京路橋技術(shù)有限責(zé)任公司，批號(hào)：130105)；茚三酮(北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司，批號(hào)：130104)；甲醇為色譜純；其他試劑均為分析純。

1.3菌株和培養(yǎng)基MH藥敏培養(yǎng)皿(批號(hào)：131031)，哥倫比亞血瓊脂平皿(批號(hào)：131106)，腦心浸液瓊脂(批號(hào)：130125)，布氏肉湯(批號(hào)：130312)均購(gòu)自北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司。空腸彎曲桿菌(ATCC33291，上海信然實(shí)業(yè)有限公司)。

2方法

2.1菌株處理

2.1.1菌株的復(fù)蘇按菌株復(fù)蘇說(shuō)明精密吸取菌株復(fù)溶培養(yǎng)基1ml于凍干菌株內(nèi)，輕輕振蕩，使凍干菌體溶解呈懸浮狀，用接種環(huán)挑取菌液直接劃線于哥倫比亞血瓊脂平皿，于42 ℃微需氧 (5%氧氣、10%二氧化碳和85%氮?dú)?[2]條件下培養(yǎng)48 h，得到復(fù)蘇的菌種[3]。

2.1.2菌株的培養(yǎng)用接種環(huán)挑取復(fù)蘇得到的單個(gè)菌落直接劃線于哥倫比亞血瓊脂平皿，于42 ℃微需氧條件下48 h傳代一次。

2.1.3菌株的保存[3,4]用接種環(huán)刮取哥倫比亞血瓊脂平皿表面的單個(gè)菌落，溶于含30%甘油的腦心浸液肉湯中，將菌濃度調(diào)到6個(gè)麥?zhǔn)蠞舛龋瑢⒅坪玫哪X心浸液甘油菌懸液分裝于無(wú)菌離心管中，-70 ℃冷凍保存。

2.2菌株的鑒定[4]根據(jù)空腸彎曲桿菌菌落的生長(zhǎng)特征、革蘭染色特征、過(guò)氧化氫酶實(shí)驗(yàn)、氧化酶實(shí)驗(yàn)、動(dòng)力實(shí)驗(yàn)、馬尿酸水解實(shí)驗(yàn)、尿素酶實(shí)驗(yàn)、25 ℃生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)和42 ℃生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，進(jìn)行判定。

2.3藥敏實(shí)驗(yàn)

2.3.1K-B 法大蒜素藥敏紙片的制備：用打孔器將濾紙制成6 mm的圓片，高壓滅菌后于無(wú)菌操作下，將濾紙片放入潔凈平皿內(nèi)，每4層濾紙片滴加濃度分別為1 000、2 000和3 000μg/ml的大蒜素藥液20 μl，分別得到每片含大蒜素5、10和15 μg的藥敏紙片。陰性對(duì)照紙片滴加20 μl生理鹽水，將上述藥敏紙片于無(wú)菌安全柜中晾干，備用。

實(shí)驗(yàn)菌的接種與藥敏紙片的貼放：用接種環(huán)挑取形態(tài)相似的單個(gè)菌落于滅菌生理鹽水中，校正濃度至0.5麥?zhǔn)媳葷針?biāo)準(zhǔn)的菌懸液(約含空腸彎曲桿菌1×108CFU/ml)。用無(wú)菌棉試子蘸取菌懸液，涂布于MH藥敏培養(yǎng)皿表面，每個(gè)平皿貼放6片藥敏紙片，分別為：環(huán)丙沙星(每片含環(huán)丙沙星5 μg)、紅霉素(每片含紅霉素15 μg)、大蒜素(每片分別含大蒜素5、10、15 μg)、生理鹽水為空白對(duì)照，其中空白對(duì)照貼于平皿中心。于42 ℃微需氧環(huán)境下培養(yǎng)18～24 h，觀察結(jié)果。用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌環(huán)的直徑，記錄結(jié)果，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。判定標(biāo)準(zhǔn)：按照美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(CLSI)標(biāo)準(zhǔn)[5]。

2.3.2肉湯稀釋法試藥儲(chǔ)備液的制備：分別精密稱取環(huán)丙沙星51.56mg、紅霉素55.35 mg于10ml容量瓶中，加無(wú)菌注射用水溶解并稀釋至刻度，搖勻，均制備成濃度為5 120 μg/ml的藥物儲(chǔ)液。精密量取大蒜素粗提取液3.50 ml(約相當(dāng)于大蒜素51.20 mg)于10 ml容量瓶中，加1%吐溫-80溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成濃度為5 120 μg/ml的大蒜素儲(chǔ)液，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

菌懸液的制備[6]：按“2.3.1”項(xiàng)下實(shí)驗(yàn)菌液制備濃度為0.5麥?zhǔn)媳葷針?biāo)準(zhǔn)的菌懸液(約含空腸彎曲桿菌1×108CFU/ml)，使用時(shí)用布氏肉湯將上述菌懸液進(jìn)行1:1 000稀釋后備用(約含空腸彎曲桿菌1×105CFU/ml)。

最低抑菌濃度(MIC)的測(cè)定：①測(cè)定方法的選擇：采用分光光度法，分別取空白布氏肉湯及空腸彎曲桿菌樣品于200～800 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，結(jié)果空腸彎曲桿菌樣品在(600±1) nm波長(zhǎng)處有最大吸收，空白布氏肉湯無(wú)干擾，故選擇600 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。②單藥MIC的測(cè)定：取無(wú)菌試管39支，隨機(jī)分成3組，即環(huán)丙沙星組、紅霉素組、大蒜素組，每組13支，將每組試管標(biāo)記為1～13號(hào)。每組1號(hào)試管中分別精密加入布氏肉湯5.23、5.33、5.76 ml，每組2～13號(hào)試管分別精密加入布氏肉湯3 ml，環(huán)丙沙星組1號(hào)試管中加入環(huán)丙沙星儲(chǔ)備液0.77 ml、紅霉素組1號(hào)試管中精密加入紅霉素儲(chǔ)備液0.67 ml，大蒜素組1號(hào)試管中精密加入大蒜素儲(chǔ)備液0.24 ml。將每組1號(hào)試管中藥物與布氏肉湯混勻，然后分別從每組1號(hào)試管中精密吸取3 ml至每組2號(hào)試管，混勻后從每組2號(hào)試管中再精密吸取3 ml至每組3號(hào)試管，如此連續(xù)倍比稀釋至每組11號(hào)試管，并從11號(hào)試管中精密吸取3 ml棄去，每組12號(hào)試管(3 ml布氏肉湯+3 ml菌液)作為空白生長(zhǎng)對(duì)照，13號(hào)試管以滅菌布氏肉湯作為對(duì)照。然后每組1～12號(hào)試管中加入上述制備好的菌懸液3 ml，搖勻。環(huán)丙沙星組1～11號(hào)試管中環(huán)丙沙星藥物濃度見(jiàn)表3；紅霉素組1～11號(hào)試管中紅霉素藥物濃度見(jiàn)表4；大蒜素組1～11號(hào)試管中大蒜素藥物濃度見(jiàn)表2。從每組1～12號(hào)試管中精密吸取3 ml，于600 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。剩余液體再于42 ℃微需氧條件下培養(yǎng)24 h，肉眼觀察細(xì)菌生長(zhǎng)情況并測(cè)定吸光度，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

A1:實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)前的吸光度；A2：實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)24 h后的吸光度；A1′：空白對(duì)照組培養(yǎng)前的吸光度；A2′：空白對(duì)照組培養(yǎng)24 h后的吸光度。

3結(jié)果與分析

3.1菌株的鑒定[4]肉眼觀察哥倫比亞血瓊脂平皿長(zhǎng)出的菌落形態(tài)為不溶血，扁平，濕潤(rùn)，有光澤，水滴樣，半透明。革蘭染色鏡檢為G-菌，形態(tài)大小為[(0.3～0.4 μm)×(1.5～3 μm)]，呈S形、螺旋狀。氧化酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果：空腸彎曲桿菌與試劑接觸10 s內(nèi)呈深紫色。過(guò)氧化氫酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果：空腸彎曲桿菌與試劑接觸后0.5 min內(nèi)產(chǎn)生氣泡。馬尿酸水解實(shí)驗(yàn)結(jié)果：呈紫色。42 ℃生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果：空腸彎曲桿菌生長(zhǎng)。動(dòng)力實(shí)驗(yàn)結(jié)果：穿刺線模糊，側(cè)光可觀察穿刺線周圍有生長(zhǎng)痕跡；均為陽(yáng)性。尿素酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果：試劑不變色。25 ℃生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果：空腸彎曲桿菌不生長(zhǎng)；均為陰性。結(jié)果鑒定符合空腸彎曲桿菌性質(zhì)。

3.2K-B法K-B 法是以抑菌圈的直徑表示抑菌作用的大小。結(jié)果顯示，3種藥物對(duì)空腸彎曲桿菌均有抑菌作用，其中大蒜素(含量1、2、3)與環(huán)丙沙星和紅霉素相比，均具有更為明顯的抑菌作用(P<0.05),結(jié)果見(jiàn)表1。

3.3肉湯稀釋法大蒜素、環(huán)丙沙星、紅霉素對(duì)空腸彎曲桿菌的MIC實(shí)驗(yàn)及抑菌率，結(jié)果見(jiàn)表2。

本實(shí)驗(yàn)以抑菌率≥90%的最小藥物濃度為MIC，結(jié)果顯示，大蒜素、環(huán)丙沙星、紅霉素的MIC分別為12.80、20.48和35.84 μg/ml，率分別為90.40%、90.21%和90.33%。

其對(duì)應(yīng)抑菌

*P<0.05，與紅霉素、環(huán)丙沙星比較

表2　3種藥物的MIC及抑菌率

4討論

大蒜素具有多種藥理作用，現(xiàn)國(guó)內(nèi)外已多有報(bào)道。近年來(lái)國(guó)外已有大蒜素對(duì)空腸彎曲桿菌抑菌作用的研究。截至筆者投稿，國(guó)內(nèi)尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道大蒜素對(duì)空腸彎曲桿菌的抑菌作用。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)將大蒜素粗提取物與環(huán)丙沙星、紅霉素對(duì)空腸彎曲桿菌的抑菌作用進(jìn)行比較，從而研究大蒜素的抑菌作用。

本實(shí)驗(yàn)采用哥倫比亞血瓊脂平皿為固體培養(yǎng)基培養(yǎng)空腸彎曲桿菌，菌株生長(zhǎng)情況良好。以布氏肉湯為液體培養(yǎng)基進(jìn)行肉湯稀釋法實(shí)驗(yàn)，本法簡(jiǎn)單易行，可為微生物實(shí)驗(yàn)室研究提供基礎(chǔ)。

采用K-B法和肉湯稀釋法比較大蒜素、環(huán)丙沙星、紅霉素對(duì)空腸彎曲桿菌的抑菌作用。上述兩種方法結(jié)果均顯示大蒜素抑菌作用強(qiáng)于環(huán)丙沙星和紅霉素。大蒜素的抗菌活性主要在于其能夠與含有巰基的酶相互作用，不可逆地抑制巰基蛋白酶的活性[7]。根據(jù)大蒜素的抗菌活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，將大蒜素制成劑型，用于治療空腸彎曲桿菌的感染，可為臨床提供一種新的抗菌藥物。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)論大蒜素抑菌效果優(yōu)于紅霉素和環(huán)丙沙星，與國(guó)外報(bào)道有差異[2]。大蒜素粗提取物的含量測(cè)定參照《中華人民共和國(guó)藥典(一部)》2010年版[8]，含二烯丙基三硫化物不含二烯丙基一硫和二硫化物，而國(guó)外資料沒(méi)有明確提出其成分，所用菌株是否存在差異。另外，我國(guó)自古以來(lái)常以大蒜作為調(diào)料和食品(如甜蒜)，能否產(chǎn)生細(xì)菌抗藥性，值得進(jìn)一步研究。

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[本文編輯]李睿旻