·生物治療·

肝細(xì)胞癌循環(huán)腫瘤細(xì)胞與腫瘤轉(zhuǎn)移和預(yù)后關(guān)系的研究

王真1,2，徐增輝1，鄭羅凝3，王穎1，孫保木4，金華君1，錢其軍1,2,3(1.東方肝膽外科醫(yī)院病毒基因治療實驗室，上海 200438；2.東方肝膽外科醫(yī)院生物治療科，上海 200438；3.浙江理工大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，杭州 310018；4.東方肝膽外科醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合科，上海 200438)

[摘要]目的研究肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)患者外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulating tumor cell, CTC)與腫瘤轉(zhuǎn)移和預(yù)后的關(guān)系。方法選取35例肝細(xì)胞癌患者，應(yīng)用密度梯度離心法聯(lián)合免疫磁珠陰性富集法富集CTC，然后利用染色體熒光原位雜交和細(xì)胞免疫熒光技術(shù)進(jìn)行CTC鑒定并計數(shù)，同時記錄臨床相關(guān)特征，對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。結(jié)果所有患者均檢出CTC，陽性率為100%，CTC個數(shù)均值為(4.1±2.5)個。對患者進(jìn)行分組，Ⅰ組的CTC個數(shù)<5，Ⅱ組的CTC數(shù)量≥5。Ⅰ組、Ⅱ組的CTC數(shù)量差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.001)，患者的性別、年齡與腫瘤轉(zhuǎn)移無關(guān)(P=0.581、0.531)，CTC的數(shù)量與轉(zhuǎn)移及預(yù)后有關(guān)(P=0.024、0.01)，Ⅰ組、Ⅱ組的轉(zhuǎn)移和預(yù)后差異有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論HCC患者外周血CTC的數(shù)量與腫瘤轉(zhuǎn)移及預(yù)后有關(guān)，CTC的數(shù)量≥5時，可能腫瘤更具轉(zhuǎn)移傾向，預(yù)后更差，患者生存期更短。

[關(guān)鍵詞]肝細(xì)胞癌；循環(huán)腫瘤細(xì)胞；轉(zhuǎn)移；預(yù)后

[基金項目]國家自然科學(xué)基金(No.81301307)；國家傳染病防治重大專項(No.2013ZX10002-010-007)；上海細(xì)胞治療工程技術(shù)研究中心科研基金(No.12DZ2251600)；上海市衛(wèi)生局科研基金(No.20114179)

[作者簡介]王真，碩士研究生.研究方向：腫瘤免疫治療及循環(huán)腫瘤細(xì)胞的研究.Tel：15821381861;E-mail：wangzhenyangguang@163.com

[通訊作者]錢其軍，教授，博士生導(dǎo)師.研究方向：腫瘤基因-病毒治療和免疫治療、循環(huán)腫瘤細(xì)胞研究.E-mail：qianqj@sino-gene.cn

[中圖分類號]R73,R4[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

DOI[]10.3969/j.issn.1006-0111.2015.02.018

[收稿日期]2014-11-01[修回日期]2015-01-29

Study on the relationship of circulating tumor cells and metastasis and prognosis of hepatocellular carcinoma

WANG Zhen1,2, XU Zenghui1, ZHENG Luoning3, WANG Ying1,SUN Baomu4, JIN Huajun1, QIAN Qijun1,2,3(1.Laboratory of Gene and Viral Therapy,Eastern Hepatobiliary Surgery Hospital, Shanghai 200438, China;2. Department of Biotherapy, Eastern Hepatobiliary Surgery Hospital, Shanghai 200438, China; 3.College of Life Sciences, Zhejiang Sci-Tech University, Hangzhou 310018, China;4.Department of Integration of Traditional Chinese and Western medicine, Eastern Hepatobiliary Surgery Hospital,Shanghai 200438, China)

Abstract[]ObjectiveTo study the relationship between circulating tumor cells(CTCs) in peripheral blood of the patients with hepatocellular carcinoma (HCC) and its metastasis and prognosis. Methods35 patients with hepatocellular carcinoma were collected as the research objects.CTCs density were enriched through gradient centrifugation and negative-immunomagnetic methods, then the cells were detected by chromosome fluorescence in situ hybridization combined with immunofluorescence tests to identify CTCs. The clinical characters were recorded and the data were statistically analyzed. ResultsAll the patients were detected CTC positive. The number of CTC was (4.1±2.5).The patients were divided into 2 groups.Group Ⅰ included patients whose CTCs were <5,and others were included in group Ⅱ.The difference between number of group I and group Ⅱ had significant significance(P=0.001);Metastasis had nothing to do with patients′ sex and age(P=0.581，0.531); The number of CTCs was related to metastasis and prognosis(P=0.024，0.01),and there was significant statistic significance between group I and group Ⅱ.ConclusionThe number of CTCs was related to tumor metastasis.The tumor may be more prone to occur metastasis and may had worse prognosis,and the patients may had shorter life time when the number of CTCs was≥5.

[Key words]hepatocellular carcinoma; circulating tumor cell; metastasis; prognosis

目前，對肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)的檢查手段和治療方法不斷增多，但由于出現(xiàn)癌癥的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，HCC的病死率仍較高[1]。HCC轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)最重要的機(jī)制之一就是出現(xiàn)循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulating tumor cell，CTC)。CTC隨血液循環(huán)到全身各處，在適宜的地方就會定居、增殖、生長，形成轉(zhuǎn)移瘤[2]。近年來，對CTC的研究越來越多，在前列腺癌[3]、結(jié)直腸癌[4]、乳腺癌[5]、肺癌[6]、卵巢癌[7]等一系列實體瘤患者的外周血中都發(fā)現(xiàn)了CTC的存在，CTC正逐漸成為腫瘤患者預(yù)后和實時監(jiān)測治療反應(yīng)的獨立預(yù)測因素。對于HCC患者，CTC具有同樣的意義。但是，目前關(guān)于HCC的CTC研究還比較少。HCC患者中CTC的數(shù)量與腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移及預(yù)后究竟存在怎樣的關(guān)系，尤其是在亞洲人群中HCC與CTC的關(guān)系如何，尚缺乏相關(guān)的臨床研究。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1HCC患者收集2013年6月至2014年1月東方肝膽外科醫(yī)院生物治療科收治的35位肝細(xì)胞癌患者。所有患者均經(jīng)術(shù)后病理或細(xì)針穿刺活檢診斷為肝細(xì)胞癌；其淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況經(jīng)術(shù)后病理或影像學(xué)聯(lián)合臨床癥狀、甲胎蛋白確診。所有患者腫瘤分期不等，但近1個月內(nèi)均未接受過相關(guān)抗腫瘤治療。所有患者均已取得知情同意并簽署知情同意書。

1.1.2主要試劑和器材細(xì)胞密度梯度分離介質(zhì)60 ml、抗CD45免疫磁珠3 ml、2%多聚甲醛 4 ml、8號染色體探針(CEP-8) 200 μl、AlexaFluor 594標(biāo)記的抗CD45抗體20 μl、Alexa Fluor 488標(biāo)記的抗人細(xì)胞角蛋白18(CK18)抗體20 μl、DAPI熒光保存液120 μl(均賽特生物醫(yī)藥科技有限公司)。Triton X-100(上海博光生物科技有限公司)、TDL-40C型低速臺式大容量離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)、XMTA-6000型數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱(上海葉拓儀器儀表有限公司)、GL-802B型微型臺式真空泵(海門市其林貝爾儀器制造有限公司)、EDTA抗凝真空采血管(美國BD公司)、S500-24型ThermoBrite 原位雜交儀(美國 Westwood公司)、熒光顯微鏡(上海舜宇科技有限公司)。

1.2實驗方法CTC的富集和鑒定分別借鑒文獻(xiàn)[8-10]，富集利用密度梯度離心和免疫磁珠負(fù)篩法；CTC的鑒定利用FISH和IF法。具體操作稍有改動，簡略描述如下：采集患者外周血7.5 ml于EDTA抗凝采血管中，以800×g離心7 min，去除大部分血漿，然后利用密度梯度離心法，使用細(xì)胞分離介質(zhì)以450×g離心8 min，去除紅細(xì)胞，再用150 μl的抗CD45免疫磁珠去除大部分白細(xì)胞，陰性富集CTC，最后用100 μl的2%多聚甲醛過夜固定CTC于載玻片上。第2天，先用10 μl的CEP-8探針進(jìn)行DNA FISH雜交，然后用1 μl的抗CK18和1 μl的抗CD45免疫熒光抗體孵育，最后5 μl的DAPI染色，熒光顯微鏡下觀察、計數(shù)。

1.3CTC的判斷標(biāo)準(zhǔn)HCC的CTC為上皮來源的細(xì)胞，不表達(dá)CD45，且常有染色體異常，其CEP-8可為二倍體、三倍體，甚至多倍體；雖然CTC為上皮來源的細(xì)胞，但在其進(jìn)入外周血的過程中可能已經(jīng)發(fā)生了上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)，故其可以表達(dá)CK18，也可以不表達(dá)CD18；DAPI則是細(xì)胞核的標(biāo)志，故CTC的判斷標(biāo)準(zhǔn)為：CD45-/CD18+/二倍體/單個DAPI或CD45-/CD18-/二倍體/單個DAPI或CD45-/CD18+/三倍體/單個DAPI或CD45-/CD18-/三倍體/單個DAPI或CD45-/CD18+/多倍體/單個DAPI或CD45-/CD18-/多倍體/單個DAPI。例如，圖1為1個二倍體CTC，圖2為1個多倍體CTC。

2結(jié)果

2.1患者基本資料本實驗共納入原發(fā)性HCC患者35例，基本資料見表1。所有患者均已簽署知情同意書。35例患者多為中老年，年齡(51.8±10.7)歲，且多為中晚期腫瘤患者?；颊叩男詣e和年齡與腫瘤有無遠(yuǎn)處和(或)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)(P=0.581、0.531，α=0.05)。同時，由于腫瘤的 TNM分期需要考慮腫瘤的轉(zhuǎn)移情況，故腫瘤的分期與腫瘤的轉(zhuǎn)移有關(guān)(P=0.039，α=0.05)。

圖1　1個二倍體CTC(×30) A.細(xì)胞的CD45陰性表達(dá)圖；B.CEP-8情況圖，為三倍體； C.DAPI染色圖

圖2　1個多倍體CTC(×30) A.細(xì)胞的CD45陰性表達(dá)圖；B.CEP-8情況圖，為多倍體；C.DAPI染色圖

表1　患者基本資料

2.2患者CTC檢測結(jié)果35例患者的CTC數(shù)量檢測結(jié)果為(4.1±2.5)個，筆者據(jù)此將所有患者分為兩組(圖3)：Ⅰ組為CTC數(shù)量<5個的患者，共23例，CTC個數(shù)介于0～4個不等，為(2.7±1.3)個，平均約3個；Ⅱ組為CTC數(shù)量≥5個的患者，共12例，CTC個數(shù)介于5～10個不等，為(6.8±1.8)個，平均約7個。兩組間的CTC數(shù)量差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.001，α=0.05)。

Ⅰ組的年齡介于27～64歲之間，為(50.8±11.09)歲，平均51歲，Ⅱ組的年齡介于39～72歲之間，為(53.8±10.19)歲，平均54歲，兩組的年齡無明顯差異(P=0.446，α=0.05)。

圖3　基于CTC數(shù)量的患者分組情況 ( ***P<0.001，與Ⅰ組比較)

2.3循環(huán)腫瘤細(xì)胞的數(shù)量與腫瘤有無淋巴結(jié)和(或)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的關(guān)系患者入組時已有淋巴結(jié)和(或)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者共17例(48.6%)，Ⅰ組8例，Ⅱ組9例，CTC數(shù)量介于0～10個不等，為(4.8±2.8)個；無淋巴結(jié)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者有18例(51.4%)，Ⅰ組15例，Ⅱ組3例，CTC數(shù)量介于1～10個，為(3.6±2.0)個。兩組患者的CTC數(shù)量差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.024，α=0.05)，可以認(rèn)為HCC患者外周血CTC的數(shù)量與腫瘤有無遠(yuǎn)處和(或)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，HCC患者外周血CTC的數(shù)量≥5個時，可能腫瘤更容易發(fā)生淋巴節(jié)和(或)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移(圖4)。

圖4　兩組患者腫瘤有無轉(zhuǎn)移情況比較 ( *P<0.05，與Ⅰ組比較)

2.4循環(huán)腫瘤細(xì)胞的數(shù)量與患者預(yù)后的關(guān)系中晚期肝癌患者的預(yù)后較差，平均生存期可能僅3～6個月，筆者在試驗開始6個月后統(tǒng)計35例入組患者的生存情況，死亡20例，Ⅰ組10例(43.5%)，Ⅱ組10例(83.3%)，CTC的數(shù)量介于1～10個，為(5.1±2.5)個，平均約5個；存活15例，Ⅰ組13例(56.5%)，Ⅱ組2例(16.7%)，CTC的數(shù)量介于0～7個，為(2.9±1.8)個，平均約3個。兩組患者CTC的數(shù)量差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.01，α=0.05)，可以認(rèn)為CTC的數(shù)量與腫瘤預(yù)后有一定關(guān)系，當(dāng)HCC患者外周血CTC的數(shù)量≥5個時，可能腫瘤預(yù)后更差，患者生存期更短，病死率更高(圖5)。

圖5　兩組患者預(yù)后比較 ( **P<0.01，與Ⅰ組比較)

3討論

目前，雖然HCC的診斷和治療方法不斷提高，但預(yù)后仍較差，病死率居高不下，其主要原因就是晚期腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。HCC復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的機(jī)制尚不明確，CTC的出現(xiàn)被認(rèn)為是其中一個重要因素。早在1869年就有人提出了CTC的概念[11]，即腫瘤從原發(fā)部位脫落進(jìn)入外周血并隨之循環(huán)的腫瘤細(xì)胞，廣義上的CTC還包括進(jìn)入淋巴系統(tǒng)循環(huán)的腫瘤細(xì)胞[2]。對于上皮來源腫瘤的CTC，毋庸置疑的具有上皮性表型。但是，近年來越來越多的研究報道發(fā)現(xiàn)，CTC會發(fā)生EMT，即上皮細(xì)胞為更好的存活并利于發(fā)生轉(zhuǎn)移和侵襲，通過特定程序轉(zhuǎn)化為具有間質(zhì)表型細(xì)胞的生物學(xué)過程，CTC經(jīng)過EMT，丟失部分上皮性表型，獲得了部分間質(zhì)性表型[12,13]。

以往對于CTC的檢測多通過單一的腫瘤表面特異性分子鑒定，比如上皮細(xì)胞黏附分子(epithelial cell adhesion molecule,EpCAM)、細(xì)胞角蛋白(cytokeratin,CK)，由于腫瘤本身特異性分子標(biāo)志物較難確定以及上述EMT過程的存在，導(dǎo)致單一鑒定腫瘤表面分子標(biāo)記的方法容易造成許多CTC被漏檢。

國內(nèi)外對于HCC的CTC研究還比較少見，較為成熟的CTC研究方法如CellSearchTM也僅適用于乳腺癌等，并不適用于肝癌。曹宇勃等[14]檢索了常用的包括Pubmed在內(nèi)的9大數(shù)據(jù)庫，檢索其自建庫至2013年8月1日期間所有關(guān)于HCC的CTC研究，并對其進(jìn)行薈萃(Meta)分析，最后僅納入12項研究，這個數(shù)量相對于關(guān)于乳腺癌、結(jié)直腸癌等的CTC研究而言是極少的，其中關(guān)于中國人的研究僅4項，且所用的都是qRT-PCR方法；另外，此薈萃分析雖然得出了CTC與患者預(yù)后相關(guān)的結(jié)論，但未指出與HCC預(yù)后相關(guān)的具體CTC數(shù)量閾值。本研究為更多地富集到HCC患者的CTC細(xì)胞，采用陰性免疫磁珠和密度梯度離心聯(lián)合的方法來富集CTC，從而避免了陽性富集CTC方法中由于腫瘤表面標(biāo)記物表達(dá)較高的異質(zhì)性，而導(dǎo)致的CTC抓捕效果欠佳。同時，本研究采用了染色體熒光原位雜交和腫瘤表面分子標(biāo)記免疫熒光的雙重方法來精確鑒定CTC細(xì)胞。

值得注意的是，檢測到的CTC均不表達(dá)CK18，考慮其原因可能為CTC發(fā)生EMT。Sun等[15]應(yīng)用CellSearchTM檢測肝癌患者CTC的數(shù)量發(fā)現(xiàn)，有66.7%的患者術(shù)前CTC陽性，51%的患者術(shù)前的CTC數(shù)量≥2個，而且，這部分患者術(shù)后復(fù)發(fā)時間比CTC數(shù)量<2個的患者要早。本研究得出的肝癌患者CTC陽性率為100%，且影響腫瘤轉(zhuǎn)移和預(yù)后的CTC數(shù)量分界值為5，均高于Sun等的研究結(jié)果。兩項研究的主要區(qū)別在于Sun等采用的是CellSearch方法，基于上皮腫瘤細(xì)胞表面標(biāo)記物EpCAM進(jìn)行免疫磁珠捕獲，然后再用表面標(biāo)記物CK進(jìn)行鑒定。如前所述，可能由于腫瘤表面標(biāo)記物表達(dá)的高異質(zhì)性以及EMT轉(zhuǎn)化等過程的原因，以及后期單一的免疫熒光鑒定方法的缺陷，導(dǎo)致針對HCC患者的CTC分析結(jié)果與本研究有一定的差異；另外，本研究納入患者多為中晚期，而Sun等研究的納入患者則多為早期患者。因而，本研究得出的HCC患者的CTC陽性率以及與轉(zhuǎn)移、預(yù)后相關(guān)的CTC數(shù)量會與Sun等的研究有一定差異。

CTC的檢測具有重要的臨床意義。它有助于腫瘤的早期診斷、輔助診斷和預(yù)后評估，有助于快速評估手術(shù)、化療、放療、免疫治療等治療方案的療效和監(jiān)測腫瘤的復(fù)發(fā)，還有助于尋找新的基因突變、治療靶點，研發(fā)新的治療藥物。尤其對于腫瘤的免疫治療，由于影像學(xué)變化出現(xiàn)得晚，難以及早判斷治療是否有效，而CTC這一指標(biāo)則能通過數(shù)量的變化反映治療效果。檢測CTC的數(shù)量有望成為免疫治療療效的評估標(biāo)準(zhǔn)之一。目前關(guān)于CTC的臨床應(yīng)用價值的研究(如前列腺癌、結(jié)直腸癌、乳腺癌、肺癌等)越來越多，CTC正在成為腫瘤患者預(yù)后及對治療反應(yīng)的獨立預(yù)測因素。本實驗為研究肝癌患者CTC提供了一種可借鑒的方法，也初步揭示了肝癌患者CTC與腫瘤的轉(zhuǎn)移及預(yù)后的一些相互關(guān)系。今后仍需要更多的基礎(chǔ)研究和臨床數(shù)據(jù)的積累，以闡明CTC在肝癌轉(zhuǎn)移中的機(jī)制，以期建立基于CTC的肝癌早期診斷和預(yù)后指標(biāo)。

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[本文編輯]李睿旻