趙學(xué)濤，楊從容，任曉亮，李　明，解曉元，巨紅妹

(1.河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院輸血科，河北 石家莊 050011；

2.河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院放療科，河北 石家莊 050011)

·論著·

懸浮紅細(xì)胞對CD4+CD25+Treg細(xì)胞分化的影響

趙學(xué)濤1，楊從容2，任曉亮1，李明1，解曉元1，巨紅妹1

(1.河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院輸血科，河北 石家莊 050011；

2.河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院放療科，河北 石家莊 050011)

[摘要]目的體外觀察懸浮紅細(xì)胞對異體T淋巴細(xì)胞向CD4+CD25+Treg細(xì)胞分化的影響。方法采用Ficoll密度梯度離心法和免疫磁珠法從人外周血中分離純化出CD3+T淋巴細(xì)胞，給予CD3/CD28抗體刺激，并分別與異體非去白懸浮紅細(xì)胞或去白懸浮紅細(xì)胞混合培養(yǎng)72 h。采用流式細(xì)胞儀檢測各組培養(yǎng)體系中CD4+CD25+Treg細(xì)胞的比例。采用實時熒光定量PCR檢測各組Foxp3 mRNA的表達(dá)情況。采用酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)法檢測各組細(xì)胞上清中促炎細(xì)胞因子[白細(xì)胞介素2(interleukin-2,IL-2)和干擾素γ(interferon-γ,IFN-γ)]和抗炎細(xì)胞因子[白細(xì)胞介素10(interleukin-10,IL-10)和轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor beta，TGF-β)]的水平。結(jié)果與陰性對照組(細(xì)胞培養(yǎng)液組)比較，非去白懸浮紅細(xì)胞和去白懸浮紅細(xì)胞組CD4+CD25+Treg細(xì)胞比例明顯增加，功能基因Foxp3 mRNA表達(dá)也明顯增高；IL-2和IFN-γ促炎細(xì)胞因子分泌減少，IL-10和TGF-β抗炎細(xì)胞因子分泌增多(P<0.01)。而與去白懸浮紅細(xì)胞比較，非去白懸浮紅細(xì)胞作用更加明顯(P<0.05)。結(jié)論懸浮紅細(xì)胞可能通過調(diào)節(jié)促炎/抗炎細(xì)胞因子平衡誘導(dǎo)異體T淋巴細(xì)胞向CD4+CD25+Treg分化，而懸浮紅細(xì)胞內(nèi)殘留的白細(xì)胞可能在其中起了關(guān)鍵作用。

[關(guān)鍵詞]紅細(xì)胞輸注；T淋巴細(xì)胞；輔助誘導(dǎo)

doi:10.3969/j.issn.1007-3205.2015.06.016

臨床研究證實，同種異體血輸注(allogenic blood transfusion，ABT)可以誘導(dǎo)受血者產(chǎn)生免疫抑制，并由此增加術(shù)后感染率和惡性腫瘤的復(fù)發(fā)率[1-2]。目前這種輸血相關(guān)免疫抑制的確切機(jī)制仍不清楚。CD4+CD25+T細(xì)胞是最近才被人們認(rèn)識的一類免疫調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cells,Treg)，高表達(dá)CD25、CD4和Foxp3，通過多種途徑參與機(jī)體的免疫無能和免疫抑制。異體成分血輸注引起的免疫抑制是否與CD4+CD25+Treg有關(guān)目前國內(nèi)外尚未見報道。為此本研究通過體外實驗探討懸浮紅細(xì)胞對異體T淋巴細(xì)胞向CD4+CD25+Treg分化的影響及其可能機(jī)制。報告如下。

1資料與方法

1.1材料和試劑RPMI 1640培養(yǎng)基和胎牛血清購自Gibco公司；人淋巴細(xì)胞分離液購自Axis Shield公司；CD3+T細(xì)胞磁珠分選試劑盒購自Miltenyi Biotec公司；抗CD3單克隆抗體、抗CD28單克隆抗體購自Becton Dickinson公司；異硫氰酸熒光素 (fluorescein isothiocyanate,FITC)標(biāo)記的抗CD4單克隆抗體以及熒光素(phycoerythrin，PE)標(biāo)記的抗CD25單克隆抗體均購自eBioscience公司；Western blotting試劑盒購于碧云天公司；ELISA檢測試劑盒購自深圳晶美生物工程有限公司。

1.2血液樣品外周全血取自健康自愿獻(xiàn)血者，去白懸浮紅細(xì)胞和非去白懸浮紅細(xì)胞由河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院輸血科提供。

1.3實驗方法

1.3.1外周血單個核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)的分離取無菌肝素鈉抗凝全血，用生理鹽水將其等倍稀釋，稀釋后的血標(biāo)本緩慢加入人淋巴細(xì)胞分離液液面上，比例為1∶1，4 ℃，2 000r/min離心15 min，輕輕吸取第二層環(huán)狀乳白色單個核細(xì)胞層，以PBS液洗滌2次，所得白色細(xì)胞沉淀即為PBMC，計數(shù)細(xì)胞備用。

1.3.2磁珠分離純化T淋巴細(xì)胞取1×107個PBMC，用PBS調(diào)整細(xì)胞溶液體積至50 μL；加入CD3抗體磁珠溶液10 μL，混勻，4 ℃孵育20 min；加入150 μL PBS洗滌細(xì)胞，4 ℃，3 000 r/min離心10 min；收集細(xì)胞重懸并調(diào)整細(xì)胞懸液體積至500 μL；將分選柱固定于磁柱上，用500 μL PBS預(yù)濕分選柱；將結(jié)合磁珠的細(xì)胞懸液加入分選柱內(nèi)，洗滌3次，每次1 000 μL PBS；將分選柱從磁柱分開，加入1 000 μL PBS，收集流出液，4 ℃，3 000 r/min離心10 min，所得沉淀物即為富集的T淋巴細(xì)胞，以含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液重懸，計數(shù)備用。

1.3.3混合培養(yǎng) 取上述T淋巴細(xì)胞懸液加入到含有CD3抗體(2 mg/L)和CD28抗體(5 mg/L)包被的96孔板中(1×105個細(xì)胞/100 μL /孔)，然后分3組，分別于上述T細(xì)胞懸液中加入細(xì)胞培養(yǎng)液100 μL /孔(陰性對照組)、非去白懸浮紅細(xì)胞2×105個細(xì)胞/100 μL /孔(非去白懸浮紅細(xì)胞組)和去白懸浮紅細(xì)胞2×105個細(xì)胞/100 μL /孔(去白懸浮紅細(xì)胞組)，每組終體積200 μL，設(shè)3個復(fù)孔。于37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h。

1.3.4CD4+CD25+T細(xì)胞比例檢測混合培養(yǎng)72 h后，收集各組細(xì)胞，調(diào)整每管細(xì)胞數(shù)為2×105個，分別加入抗CD4+-FITC熒光抗體、抗CD25+-PE熒光抗體及相應(yīng)同型對照，冰上孵育30 min，加入2%胎牛血清-PBS液洗滌去除未結(jié)合抗體，1 300 r/min離心6 min，洗2次，將細(xì)胞重懸至200 μL，應(yīng)用EPics-XL Ⅱ型流式細(xì)胞儀檢測。

1.3.5淋巴細(xì)胞Foxp3 mRNA表達(dá)檢測混合培養(yǎng)72 h后，收集各組細(xì)胞，采用Trizol法提取細(xì)胞總mRNA，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和實時熒光定量PCR反應(yīng)，引物由上海生工生物有限公司合成。使用QuantityOne軟件進(jìn)行定量分析，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)作為內(nèi)參，計算Foxp3的相對表達(dá)量。

1.3.6細(xì)胞因子檢測混合培養(yǎng)72 h后，收集各組細(xì)胞上清，采用ELISA法檢測細(xì)胞因子白細(xì)胞介素2(interleukin-2,IL-2)、干擾素γ(interferon-γ,IFN-γ)、白細(xì)胞介素10(interleukin-10,IL-10)、轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor beta，TGF-β)的表達(dá)水平。操作按照ELISA試劑盒說明書進(jìn)行。

2結(jié)果

2.1懸浮紅細(xì)胞對CD4+CD25+細(xì)胞比例和異體T淋巴細(xì)胞Foxp3 mRNA表達(dá)的影響與陰性對照組比較，非去白懸浮紅細(xì)胞和去白懸浮紅細(xì)胞組CD4+CD25+Treg 細(xì)胞比例和異體T淋巴細(xì)胞Foxp3 mRNA表達(dá)均明顯增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；非去白懸浮紅細(xì)胞較去白懸浮紅細(xì)胞組CD4+CD25+Treg細(xì)胞比例和異體T淋巴細(xì)胞Foxp3 mRNA表達(dá)更高(P<0.05)。見表1。

2.2懸浮紅細(xì)胞對細(xì)胞因子的影響與陰性對照組相比，非去白懸浮紅細(xì)胞和去白懸浮紅細(xì)胞組上清中促炎細(xì)胞因子IL-2和IFN-γ含量明顯減少(P<0.05)，而抗炎細(xì)胞因子IL-10和TGF-β含量明顯增多(P<0.05)。非去白懸浮紅細(xì)胞與去白懸浮紅細(xì)胞組比較作用更加明顯(P<0.05)。見表2。

表1　3組CD4+CD25+Treg細(xì)胞比例及Foxp3 mRNA表達(dá)比較　Table 1　CD4+CD25+Treg cells rate and Foxp3 mRNA expression in three groups　

*P<0.01與陰性對照組比較#P<0.05與非去白懸浮紅細(xì)胞組比較(q檢驗)

表2　3組細(xì)胞因子含量比較　Table 2　Expression of IL-2,IFN-γ,IL-10 and TGF-β in three groups　

*P<0.01與陰性對照組比較#P<0.05與非去白懸浮紅細(xì)胞組比較(q檢驗)

3討論

同種異體輸血發(fā)揮臨床治療作用的同時，也會并發(fā)免疫相關(guān)的不良反應(yīng)，如惡性腫瘤復(fù)發(fā)率增加、術(shù)后感染率上升、慢性病毒感染急性發(fā)作等，這些輸血引起的一系列涉及免疫調(diào)節(jié)的反應(yīng)稱為輸血相關(guān)性免疫調(diào)節(jié)(transfusion-associated immunomodulation,TRIM)[3]。大量動物實驗證實血液制劑中的白細(xì)胞與由白細(xì)胞和血小板分泌并隨著儲存時間延長而蓄積的可溶性生物反應(yīng)介質(zhì)是引起TRIM的主要機(jī)制[4-5]。眾多臨床資料也顯示輸注去白細(xì)胞的血液制劑可降低術(shù)后感染率和腫瘤復(fù)發(fā)率[6-7]。目前血液制劑中白細(xì)胞及其他生物活性分子是通過何種途徑引起TRIM的機(jī)制仍不明確。

CD4+CD25+T細(xì)胞是是一類具有免疫調(diào)節(jié)功能的Treg，此細(xì)胞群高表達(dá)CD25+、CD4+和Foxp3，F(xiàn)oxp3是Treg分化和發(fā)揮功能的關(guān)鍵分子，被認(rèn)為是Treg的特異性標(biāo)記[8]。盡管Treg在T淋巴細(xì)胞中所占比例不大，但在調(diào)節(jié)體內(nèi)免疫反應(yīng)、維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定和自身免疫耐受中起重要作用[9-10]。Treg具有免疫抑制性，可以非特異性的抑制CD4+和CD8+T細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、B細(xì)胞以及其他免疫細(xì)胞的功能，進(jìn)而降低機(jī)體對腫瘤和病原體的免疫應(yīng)答。那么異體血輸注引起的TRIM是否與Treg有關(guān)呢？本研究結(jié)果顯示2組懸浮紅細(xì)胞分別與CD3/CD28抗體刺激的T細(xì)胞混合培養(yǎng)后，均會增加培養(yǎng)體系中CD4+CD25+Treg細(xì)胞的比例，同時也會增加Foxp3 mRNA的表達(dá)水平；而與去白懸浮紅細(xì)胞組相比，非去白懸浮紅細(xì)胞的作用更加明顯。提示懸浮紅細(xì)胞可促進(jìn)異體T淋巴細(xì)胞向CD4+CD25+Treg細(xì)胞分化，并且促進(jìn)其功能增強(qiáng)，而這種作用可能主要依賴于懸浮紅細(xì)胞內(nèi)殘留的白細(xì)胞。

此外，T細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子在免疫調(diào)節(jié)中也起著重要作用。IL-2和IFN-γ主要由Th1細(xì)胞分泌，是促炎因子，可以促進(jìn)免疫反應(yīng)的發(fā)生；IL-10和TGF-β則主要由Th2和Treg細(xì)胞分泌，是抗炎因子，主要在免疫耐受和免疫抑制中起作用[11]。兩類細(xì)胞因子互相平衡共同調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，否則就會導(dǎo)致免疫功能的紊亂。研究證實Treg可抑制細(xì)胞因子IL-2的表達(dá)，從而阻斷免疫排斥反應(yīng)的發(fā)生[12]；而IL-10和TGF-β可誘導(dǎo)CD4+CD25+Treg的生成[13]。本研究結(jié)果顯示，與陰性對照組相比，懸浮紅細(xì)胞組培養(yǎng)體系中IL-10和TGF-β細(xì)胞因子含量增多，IL-2和IFN-γ含量減少，從而誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞高表達(dá)Foxp3并向CD4+CD25+Treg分化；而與去白懸浮紅細(xì)胞組相比，非去白懸浮紅細(xì)胞組的這種作用更加明顯。提示懸浮紅細(xì)胞可能通過調(diào)節(jié)促炎/抗炎細(xì)胞因子平衡誘導(dǎo)異體T淋巴細(xì)胞向CD4+CD25+Treg分化，從而參與異體血輸注引起的TRIM，而懸浮紅細(xì)胞內(nèi)殘留的白細(xì)胞在其中起了關(guān)鍵作用。但同時也提示除白細(xì)胞外，懸浮紅細(xì)胞中還存在其他成分誘導(dǎo)CD4+CD25+Treg的分化，只是因其作用較小，在體內(nèi)可能不足以引起廣泛的免疫抑制，這種猜測還需要進(jìn)一步的實驗數(shù)據(jù)和臨床證據(jù)來證實。

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(本文編輯：趙麗潔)

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《河北醫(yī)科大學(xué)學(xué)報》編輯部

[收稿日期]2015-03-15；[修回日期]2015-04-22

[基金項目]河北省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究重點課題計劃(20100442)

[作者簡介]趙學(xué)濤(1977-)，男，河北阜城人，河北醫(yī)科大學(xué)第

[中圖分類號]R735.7

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

[文章編號]1007-3205(2015)06-0682-04

Effect of red blood suspension on CD4+CD25+Treg differentiation
ZHAO Xue-tao1,YANG Cong-rong2,REN Xiao-liang1,

LI Ming1,XIE Xiao-yuan1,JU Hong-mei1

(1.Department of Blood Transfusion,the Fourth Hospital of Hebei Medical University,Shijiazhuang

050011,China;2.Department of Radiation Oncology,the Fourth Hospital of Hebei Medical

University,Shijiazhuang 050011,China)

[Abstract]ObjectiveTo explore the effect of red blood suspension on differentiation of CD4+CD25+Treg derived from allogene T lymphocytes in vitro and its underlying mechanism.MethodsCD3+T lymphocytes from human peripheral blood were isolated and purified by Ficoll density gradient centrifugation combined with adherence MACS selection.Purified human T cells were stimulated with anti-CD3/anti-CD28 and then exposed to allogene leukocyte-containing red blood suspension or leukocyte-depleted red blood suspension for 72 h.The ratios of CD4+CD25+Tregs from different co-culture systems were detected by flow cytometry.The expression of Foxp3 mRNA was determined by real-time qPCR.The levels of pro-inflammatory cytokines such as interleukin-2(IL-2) and interferon-γ(IFN-γ) and anti-inflammatory cytokines like,interleukin-10(IL-10) and transforming growth factor beta(TGF-β) in the culture supernatant were determined by enzyme-linked immunoabsorbent assay (ELISA).ResultsCompared with those of negative group (culture media),CD4+CD25+Tregs cells rate and Foxp3 mRNT expression in leukocyte-containing group and leukocyte-depleted group increased.At the same time,the cytokine of pro-inflammatory cytokines,IL-2 and IFN-γ,significantly decreased,and the anti-inflammatory cytokines,TGF-β and IL-10 increased significantly (P<0.01).The results of leukocyte-containing group were more prominent(P<0.05).ConclusionRed blood suspension could promote differentiation of T lymphocytes to CD4+CD25+Treg by regulating balance of pro-inflammatory/anti-inflammatory cytokines.The regulation,to a large extent,depends on the remaining white blood cells in red blood suspension.

[Key words]erythrocytes；T-lymphocytes；cytokines

四醫(yī)院主管技師，醫(yī)學(xué)博士，從事輸血與腫瘤免疫研究。