三七皂苷R1對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用

董曉華張成龍吳志剛沈麗霞張丹參1孟憲勇2

(河北北方學(xué)院藥理教研室，河北張家口075000)

摘要〔〕目的研究三七皂苷R1對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷后學(xué)習(xí)記憶障礙的影響。方法SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、三七皂苷R1 1.4 mg/kg組 (R1A組)和三七皂苷R1 7.0 mg/kg組(R1B組)。大鼠腹腔注射三七皂苷R1，連續(xù)給藥14 d，實(shí)驗(yàn)第4天制作右側(cè)大腦中動(dòng)脈栓塞(MCAO)模型，缺血后2 h再灌。再灌后不同時(shí)間點(diǎn)采用Longa法對(duì)大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能行為缺陷評(píng)分，采用2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色法記錄大鼠腦梗死體積，Morris水迷宮法觀察大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力，電生理學(xué)方法記錄中樞突觸傳遞長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)(LTP)現(xiàn)象。結(jié)果三七皂苷R1(1.4，7.0 mg/kg)可減少大鼠腦梗死體積，改善大鼠空間學(xué)習(xí)記憶障礙，增強(qiáng)大鼠海馬齒狀回高頻刺激(HFS)誘導(dǎo)的LTP現(xiàn)象。結(jié)論三七皂苷R1對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用。

關(guān)鍵詞〔〕三七皂苷R1；腦缺血再灌注；學(xué)習(xí)記憶；長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)

中圖分類號(hào)〔〕R964〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A〔

基金項(xiàng)目：河北省教育廳重點(diǎn)課題(ZD2014065)；張家口市科技局資助課題(0291098D)；河北北方學(xué)院自然科學(xué)研究計(jì)劃項(xiàng)目(2009033)

通訊作者：孟憲勇(1976-)，男，副主任醫(yī)師，碩士，碩士生導(dǎo)師，主要從事生物工程與神經(jīng)干細(xì)胞研究。

1河北科技大學(xué)2河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院骨外科

第一作者：董曉華(1976-)，女，副教授，博士，主要從事神經(jīng)藥理學(xué)研究。

三七具有活血化淤、消腫止痛、抗衰老、抗腫瘤等作用，廣泛用于中藥方劑〔1〕。三七主要單體成分為三七皂苷R1、人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1，目前人們對(duì)人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1研究較多，證明它們具有改善學(xué)習(xí)記憶、抗氧化、抗應(yīng)激、抗衰老、抗組織缺血等作用。然而對(duì)三七皂苷R1的藥理作用研究報(bào)道較少，作為三七獨(dú)有的活性成分是否與其他主要活性成分一樣具有改善學(xué)習(xí)記憶等腦保護(hù)作用，有待進(jìn)一步深入研究。本實(shí)驗(yàn)觀察三七皂苷R1對(duì)腦缺血再灌注大鼠腦梗死體積、空間學(xué)習(xí)記憶障礙、海馬齒狀回(DG)高頻刺激(HFS)誘導(dǎo)的長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)(LTP) 現(xiàn)象的影響。

1材料與方法

1.1動(dòng)物、主要試劑及儀器健康雄性SD大鼠，體重180~200 g，購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物繁育廠。三七皂苷R1，南京澤朗醫(yī)藥技術(shù)有限公司。VC-11記憶示波器SEN-7203三道電子刺激器(日本Nihon Konden)，SS-202J刺激隔離器(日本Nihon Konden)，江灣Ⅰ型-C腦立體定位儀，LTP生物信號(hào)采集處理系統(tǒng)2003，Morris水迷宮(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所)。

1.2分組及給藥SD大鼠隨機(jī)分成4組，每組8只，假手術(shù)組，模型組，三七皂苷R1 1.4 mg/kg組(R1A組)，三七皂苷R1 7.0 mg/kg組(R1B組)。從實(shí)驗(yàn)第1天起動(dòng)物每天腹腔注射不同劑量三七皂苷R1，連續(xù)給藥14 d，模型組和假手術(shù)組注射等體積的生理鹽水。實(shí)驗(yàn)第4天給藥后，參照相關(guān)文獻(xiàn)，腔內(nèi)線栓法制備右側(cè)大腦中動(dòng)脈栓塞(MCAO)模型，缺血后2 h再灌，假手術(shù)組不插入栓子，其余操作相同。

1.3腦缺血再灌注大鼠模型制備〔2〕10%水合氯醛(300 mg/kg，腹腔注射)麻醉動(dòng)物后，仰臥位固定于手術(shù)臺(tái)上，分離右側(cè)頸總、頸外和頸內(nèi)動(dòng)脈，結(jié)扎頸外動(dòng)脈遠(yuǎn)心端，動(dòng)脈夾夾閉頸總動(dòng)脈近心端，在頸外動(dòng)脈靠近頸內(nèi)、外分叉約5 mm處剪一小切口，拉直頸內(nèi)和頸外動(dòng)脈成一條直線，插入栓線至大腦中動(dòng)脈主干的起始部，固定栓線，松開頸總動(dòng)脈。2 h后提拉栓線退至頸外動(dòng)脈，實(shí)現(xiàn)大腦中動(dòng)脈再灌注。

1.4神經(jīng)功能行為缺陷評(píng)分大鼠缺血再灌注后12、24、48和72 h按Longa法5分制評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行神經(jīng)功能行為缺陷評(píng)分，術(shù)后評(píng)1～3分者為手術(shù)成功標(biāo)志。0分：未觀察到神經(jīng)功能缺陷癥狀；1分：不能完全伸展手術(shù)對(duì)側(cè)前肢(輕度局灶性神經(jīng)功能缺陷)；2分：向手術(shù)對(duì)側(cè)轉(zhuǎn)圈(中度局灶性神經(jīng)功能缺陷)；3分：行走時(shí)向手術(shù)對(duì)側(cè)傾倒(重度神經(jīng)功能缺陷)；4分：不能自行行走，意識(shí)昏迷。

1.5腦梗死體積測(cè)定造模后24 h，處死大鼠，快速斷頭取腦，切除嗅腦、小腦和低位腦干后，取冠狀面從前向后連續(xù)等距離切取5個(gè)腦片，將腦片放于2%TTC染液37℃孵育30 min，4%多聚甲醛避光固定24 h。正常腦組織呈紅色，梗死組織呈白色，將白色組織仔細(xì)分離并稱重，按以下公式計(jì)算腦梗死體積：腦梗死體積百分比=缺血部分重量/全腦重量×100%。

1.6Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)于第10~14天進(jìn)行，包括第10~13天訓(xùn)練實(shí)驗(yàn)和第14天測(cè)試實(shí)驗(yàn)。訓(xùn)練實(shí)驗(yàn)中，每天訓(xùn)練4次，間隔3 min，每次訓(xùn)練120 s〔3〕，訓(xùn)練時(shí)大鼠從4個(gè)不同象限面朝池壁放置，記錄動(dòng)物找到站臺(tái)的時(shí)間(逃避潛伏期)。如果動(dòng)物在120 s未能找到站臺(tái)，將其放置在站臺(tái)上20 s。訓(xùn)練實(shí)驗(yàn)后24 h移走站臺(tái)，進(jìn)行測(cè)試實(shí)驗(yàn)，測(cè)試時(shí)間是120 s，記錄大鼠在目標(biāo)象限(訓(xùn)練時(shí)站臺(tái)所在的象限)停留的時(shí)間和穿過站臺(tái)的次數(shù)〔4〕。

1.7電生理學(xué)實(shí)驗(yàn)給藥14 d后1 h行電生理學(xué)實(shí)驗(yàn)。20%氨基甲酸乙酯(1.5 g/kg，腹腔注射)麻醉大鼠，固定于立體定位儀上。參照Pellegrino大鼠腦立體定位圖譜，埋植雙極刺激電極于內(nèi)嗅區(qū)前穿通纖維(PP)，記錄電極于DG顆粒細(xì)胞層。誘發(fā)電位，HFS參數(shù)，數(shù)據(jù)分析處理等方法見文獻(xiàn)〔2〕。如果群峰電位(PS)幅度較自身對(duì)照值增加30%以上且持續(xù)時(shí)間超過30 min，則表明LTP現(xiàn)象已形成。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS13.0軟件進(jìn)行單因素方差分析及t檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1神經(jīng)功能行為缺陷評(píng)分術(shù)后12、24、48、72 h各組大鼠Longa評(píng)分結(jié)果見表1。各組組內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)比較，均在24 h時(shí)Longa評(píng)分最高，然后逐漸下降；同一時(shí)間不同組間比較，模型組4個(gè)時(shí)間點(diǎn)Longa評(píng)分均高于假手術(shù)組(P<0.01)；三七皂苷R1組4個(gè)時(shí)間點(diǎn)Longa評(píng)分均低于模型組(P<0.05或P<0.01)。

表1　三七皂苷R1對(duì)腦缺血再灌注大鼠神經(jīng)功能行為

與假手術(shù)組比較：1)P<0.01 ；與模型組比較：2)P<0.05，3)P<0.01

2.2腦梗死體積測(cè)定大鼠腦缺血再灌注24 h腦梗死體積見圖1。假手術(shù)組未見梗死灶，模型組和三七皂苷R1各組均出現(xiàn)梗死灶，梗死區(qū)主要位于右側(cè)大腦頂葉皮質(zhì)和紋狀體外側(cè)白質(zhì)區(qū)；模型組腦梗死體積(41%)高于假手術(shù)組(0%，P<0.01)；R1A組(22%)與R1B組(8%)與模型組比較，腦梗死體積減小(P<0.05；P<0.01)。

2.3Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)隨著訓(xùn)練天數(shù)的增加，各實(shí)驗(yàn)組潛伏期均不斷縮短；第1天各組間潛伏期相比無(wú)差異(P>0.05)；模型組與假手術(shù)組相比，訓(xùn)練第2天開始，潛伏期延長(zhǎng)(P<0.05;P<0.01)；三七皂苷R1組與模型組相比，從第2天開始，潛伏期明顯縮短，(P<0.05；P<0.01)。在第5天的測(cè)試實(shí)驗(yàn)中，模型組大鼠目標(biāo)象限搜尋時(shí)間百分率和穿過平臺(tái)次數(shù)減少(P<0.01)，而三七皂苷R1組顯著增加(P<0.05或P<0.01)。見表2。

A：假手術(shù)組；B：模型組；C：R1A組；D：R1B組 圖1　三七皂苷R1對(duì)腦缺血再灌注大鼠腦梗死 體積的影響

2.4電生理學(xué)實(shí)驗(yàn)各組在給予HFS后，PS幅值在觀察的60 min內(nèi)均明顯增加，并形成LTP現(xiàn)象，但每組HFS后PS幅值增長(zhǎng)的幅度不同；與假手術(shù)組相比，模型組在HFS后60 min內(nèi)各時(shí)間點(diǎn)PS幅值減少(P<0.01)；三七皂苷R1組較模型組PS幅值在高頻刺激后的每個(gè)時(shí)間點(diǎn)都明顯升高。HFS后60 min內(nèi)的平均PS幅值顯示，模型組較假手術(shù)組降低(P<0.01)；三七皂苷R1組較模型組平均PS幅值升高(P<0.05；P<0.01)。見表3。

表2　三七皂苷R1對(duì)腦缺血再灌注大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力的影響 ± s， n=8)

與假手術(shù)組比較：1)P<0.01，2)P<0.01；與模型組比較：3)P<0.05，4)P<0.01

表3　三七皂苷R1對(duì)腦缺血再灌注大鼠海馬HFS刺激后不同時(shí)間點(diǎn)PS幅值的影響 ± s， n=8，%)

與假手術(shù)組比較：1)P<0.01；與模型組比較：2)P<0.05，3)P<0.01

3討論

腦缺血再灌注損傷的病理生理機(jī)制極為復(fù)雜，主要與自由基過度形成、興奮性氨基酸毒性作用、細(xì)胞內(nèi)鈣超載、炎性反應(yīng)等有關(guān)，同時(shí)伴有神經(jīng)功能受損、學(xué)習(xí)記憶障礙和腦梗死灶形成等。祖國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)藥在治療缺血性腦血管病方面有較大潛力，越來(lái)越多的植物藥在腦缺血再灌注損傷中得到研究和應(yīng)用，尤其是中藥單體的生物活性研究，易于闡明確切藥理作用和機(jī)制，同時(shí)通過對(duì)多種單體的構(gòu)效關(guān)系研究也易于發(fā)現(xiàn)活性較強(qiáng)化合物。本研究選擇三七皂苷 R1進(jìn)行藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)，能夠促進(jìn)三七新生物活性的發(fā)現(xiàn)和藥用價(jià)值的評(píng)定。已有研究證實(shí)三七皂苷R1具有抑制血栓形成，抗氧化、改善微循環(huán)等作用，也有體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)三七皂苷R1對(duì)過氧化氫所致的大鼠海馬神經(jīng)元損傷具有保護(hù)作用〔5〕，但對(duì)于學(xué)習(xí)記憶的影響未見報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明三七皂苷R1對(duì)腦缺血再灌注損傷具有神經(jīng)保護(hù)作用，且可改善缺血再灌注大鼠空間學(xué)習(xí)記憶障礙。海馬是學(xué)習(xí)記憶過程中起關(guān)鍵作用的中樞結(jié)構(gòu)，LTP是海馬突觸可塑性的重要形式，是學(xué)習(xí)記憶的神經(jīng)細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)〔6〕。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)三七皂苷R1(1.4，7.0 mg/kg)對(duì)腦缺血再灌注大鼠海馬齒狀回HFS誘導(dǎo)的LTP有增強(qiáng)作用，即從細(xì)胞水平證實(shí)三七皂苷R1對(duì)腦缺血再灌注損傷引起的學(xué)習(xí)記憶障礙有改善作用。

參考文獻(xiàn)4

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〔2013-06-08修回〕

(編輯趙慧玲/曹夢(mèng)園)