SK-7041對血管緊張素Ⅱ致大鼠心肌細胞肥大的干預作用

SK-7041對血管緊張素Ⅱ致大鼠心肌細胞肥大的干預作用

陸瑩肖剛1任鵬蔣桂華王新春

(哈爾濱醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院急診科，黑龍江哈爾濱150086)

摘要〔〕目的探討SK-7041在血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)致心肌細胞肥大過程中的抑制作用。方法常規(guī)方法培養(yǎng)大鼠原代心肌細胞，分為3組：對照組、肥大組、SK-7041組。利用AngⅡ刺激心肌細胞造成肥大模型，并給予SK-7041進行干預。反轉錄聚合酶鏈反應觀察β-肌球蛋白重鏈(β-MHC)mRNA表達；相差顯微鏡和電鏡觀察心肌細胞的表面積和超微結構變化；免疫組織化學法檢測c-fos蛋白的表達。結果大鼠原代心肌細胞在AngⅡ作用下表面積增加，超微結構發(fā)生改變；β-MHC mRNA和c-fos蛋白表達增加(P<0.05)。給予SK-7041干預后，上述變化顯著緩解(P<0.05)。結論SK-7041可抑制AngⅡ刺激引起的心肌細胞肥大，為臨床上治療心肌肥厚提供一條新的思路。

關鍵詞〔〕SK-7041；血管緊張素Ⅱ；心肌細胞；肥大

中圖分類號〔〕R542.2〔文獻標識碼〕A〔

基金項目：黑龍江省教育廳科學技術研究項目(12511303)

通訊作者：肖剛(1971-)，男，副主任醫(yī)師，碩士，主要從事心肌病發(fā)病機制的研究。

1解放軍第二一一醫(yī)院醫(yī)務處

第一作者：陸瑩(1971-)，女，副主任醫(yī)師，博士，主要從事心肌病發(fā)病機制的研究。

臨床上多種心血管疾病都伴有心肌肥大，如冠心病、高血壓性心臟病、風濕性心臟病等等，但是對于心肌肥大的原因尚未完全明確。近年來研究表明，在心肌細胞肥大的信號傳導通路中，組蛋白脫乙?；?HDACs)發(fā)揮著重要作用〔1〕，其中Ⅰ類HDACs對于心肌肥大有一定的促進作用〔2，3〕，因此對于其抑制劑的研究逐漸受到學者們的重視〔4〕。3-(4-取代苯基)-N-羥基-2-丙烯酰胺(SK-7041)作為新型Ⅰ類HDACs抑制劑，主要作用于Ⅰ類HDACs 中的HDAC1、HDAC2，目前僅被用于腫瘤性疾病的研究〔5〕，其在心血管疾病方面的作用尚未被研究。因此，本課題組以血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)刺激心肌細胞造成肥大，給予SK-7041進行干預，以觀察SK-7041對于心肌細胞肥大的抑制作用。

1材料與方法

1.1材料出生后1～3 d清潔級Wistar乳鼠，由哈爾濱醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院實驗動物中心提供，使用許可證號：SYXK(黑)20020017。SK-7041(In2Gen/SK，Sigma公司)。DAB 顯色試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)。DMEM(美國Hyclone公司)。RT-PCR試劑盒(TakaRa公司)。RT-PCR引物由北京奧科公司合成。免疫組化SABC試劑盒(博士德公司)。兔抗大鼠c-fos多克隆抗體(Santa CruzBiotechnology Inc.USA)。

1.2心肌細胞培養(yǎng)和分組取出心臟后，剪成4～5塊，0.25% 胰酶反復消化、吸取上清，2 000 r/min離心10 min。加入含10% 胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)液，將細胞重懸并計數(shù)。按細胞數(shù)106/ml或107/ml將細胞接種于培養(yǎng)板或培養(yǎng)瓶中。心肌細胞分為對照組、肥大組和SK-7041組。96 h后換無血清培養(yǎng)液，同時SK-7041組加入SK-7041，繼續(xù)培養(yǎng)1 h后肥大組和SK-7041組加入AngⅡ，使SK-7041終濃度為10-6mol/L，AngⅡ終濃度為2×10-7mol/L。37℃、5%CO2培養(yǎng)。加入AngⅡ后12 h和24 h進行以下檢測。

1.3相差顯微鏡觀察心肌細胞面積變化加入AngⅡ后12 h和24 h于相差顯微鏡下觀察細胞形態(tài)，各組均隨機選取10個視野，每個視野隨機選取10個心肌細胞，在1 600倍下應用Motic Images1.3軟件測量心肌細胞面積，計算平均值。

1.4電鏡觀察細胞形態(tài)變化胰酶消化細胞，用PBS液洗2次，2.5 %戊二醛固定，常規(guī)方法脫水、包埋、制作超薄切片、染色，在透射電鏡下觀察。

1.5反轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)檢測β-肌球蛋白重鏈(β-MHC)mRNA表達按照試劑盒說明書進行操作。β-MHC基因引物序列：上游：5'-ACC AAG CAG CCA CGC CAG TA-3'；下游：5'-TGC TTT GCC TTT GCC CTT GT-3'；擴增片段長度為596 bp。β-actin基因引物序列：上游：5'-TTG TAA CCA ACT GGG ACG ATA TGG-3'；下游：5'-GAT CTT GAT CTT CAT GGT GCT AGG-3'；擴增片段長度為764 bp。以β-actin為內參照，結果以β-MHC/β-actin比值表示。各組樣本數(shù)為10例。

1.6免疫組化法檢測c-fos蛋白表達冷丙酮固定各組心肌細胞20 min，置于0.3% H2O2中30 min抑制內源性過氧化物酶。加入一抗4℃過夜。加入二抗，室溫下2 h。DAB顯色。蘇木素復染。乙醇脫水，二甲苯脫乙醇，封片。鏡下觀察，c-fos以細胞質黃染為陽性。采用鏡下隨機選取10個視野，分別計算c-fos表達陽性心肌細胞的百分數(shù)。

2結果

2.1SK-7041對心肌細胞表面積的影響在1 600倍鏡下，對照組、SK-7041組心肌細胞面積在12、24 h點均低于肥大組(P<0.05)；但SK-7041組心肌細胞面積仍高于對照組(P<0.05)。見表1。

2.2電鏡結果對照組可見心肌細胞內細胞核偏于一側，呈梭形；細胞內肌絲排列整齊，粗面內質網(wǎng)、游離核蛋白體豐富。肥大組可見心肌細胞體積較大，肌絲排列紊亂，線粒體內膜髓鞘樣變；高爾基體、內質網(wǎng)及扁平囊崩解。SK-7041組可見肥大的心肌細胞胞質內含有大量的溶酶體，質膜下粗面內質網(wǎng)擴張尤為明顯，細胞表面有質膜葉片伸出，細胞核膜下有輕度染色質的邊集。

2.3SK-7041對心肌細胞β-MHC mRNA表達的影響對照組、SK-7041組心肌細胞β-MHC mRNA表達在12、24 h點均低于肥大組(P<0.05)；但SK-7041組仍高于對照組(P<0.05)。見表2。

表1　各組心肌細胞面積比較

與對照組比較：1)P<0.05；與肥大組比較：2)P<0.05；下表同

表2　各組心肌細胞β-MHC mRNA表達比較

2.4SK-7041對心肌細胞c-fos蛋白表達的影響對照組、SK-7041組心肌細胞c-fos蛋白表達在12、24 h點均低于肥大組(P<0.05)；但SK-7041組仍高于對照組(P<0.05)，見表3。

表3　各組心肌細胞c-fos蛋白陽性表達比較

3討論

近年來，分子遺傳學、單細胞和器官生理學的進展使得對涉及心肌肥大的各信號通路的研究日新月異，大量以基因工程技術處理過的動物模型使人們能夠在分子水平上探索各個不同的信號途徑及其交匯聯(lián)系，并發(fā)現(xiàn)了許多在心肌肥大和心功能衰竭過程中起重要作用的信號通路。心肌細胞肥大是臨床多種心血管疾病所伴有的一種病理性改變，探討其發(fā)生的病理生理機制，對于治療有重要意義。AngⅡ、去甲腎上腺素等多種化學刺激亦可造成心肌細胞肥大，同時伴有c-fos、c-jun、c-myc等原癌基因表達迅速加強，并促使蛋白質合成增加，誘導心肌肥大。本文表明，在AngⅡ誘導的體外心肌細胞肥大模型中，心肌細胞表面積、c-fos蛋白和β-MHC基因的表達均增加，并出現(xiàn)了超微結構的改變；給予SK-7041后減少了肥大心肌細胞的表面積，同時也降低了這一過程中的β-MHC mRNA和c-fos蛋白表達，從而證實了SK-7041對心肌細胞肥大的抑制作用。這一結果與其抑制特異性抑制Ⅰ類HDACs的作用相關。

目前認為，心肌細胞核心組蛋白的乙?；?去乙?；c基因調控密切相關，催化組蛋白乙?；拿甘墙M蛋白乙?；D移酶(HATs)，而催化組蛋白去乙?；拿甘荋DACs，二者作用相反。HDACs可通過移去組蛋白H3、H4賴氨酸殘基上的乙?；箮д姾傻馁嚢彼釟埢┞?，后者與DNA之間的相互作用可限制核小體在DNA之間的移動，進而阻礙了作為基本轉錄單位的蛋白質復合物進入啟動子結合位點。由此可見，HDACs通過對組蛋白去乙酰化，可使DNA結構更加緊密，從而抑制某些基因的轉錄。HDACs分為三類，其中Ⅰ類HDACs中的HDAC1、2被認為可促進心肌細胞肥大，而Ⅱ類HDACs可抑制心肌細胞肥大〔6~8〕。

SK-7041作為一種新型的Ⅰ類HDACs抑制劑，與其他非特異性HDACs抑制劑(如TSA、丙戊酸)相比，可特異性抑制Ⅰ類HDACs 中的HDAC1/2復合物。目前主要被應用于研究腫瘤性疾病〔9〕，尚未見于心肌細胞肥大的研究。本實驗結果證實了推測：SK-7041可有效抑制心肌細胞肥大，進一步說明HDAC1/2對于心肌肥大的促進作用，同時希望能夠為心肌肥大的發(fā)病機制研究提供一條新的思路。

參考文獻4

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9Lane AA，Chabner BA.Histone deacetylase inhibitors in cancer therapy〔J〕.J Clin Oncol，2009；27(32)：5459-68.

〔2013-09-09修回〕

(編輯趙慧玲/曹夢園)