柴胡皂苷A對抑郁模型大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用

董海影張靜艷柏青楊王紹清張曉杰

(齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院病理學(xué)系，黑龍江齊齊哈爾161006)

摘要〔〕目的探討柴胡皂苷A對抑郁模型大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用及機(jī)制。方法60只SD雄性大鼠隨機(jī)分為正常對照組、模型組、西藥組、中藥組；采用慢性不可預(yù)見性應(yīng)激刺激結(jié)合孤養(yǎng)方式建立抑郁模型；利用敞箱實(shí)驗(yàn)與糖水偏愛度檢測大鼠行為學(xué)改變；采用電鏡觀察大鼠腦海馬區(qū)超微結(jié)構(gòu)變化；應(yīng)用免疫組化與RT-PCR檢測大鼠海馬區(qū)腦源性神經(jīng)生長因子(BDNF)蛋白及基因的表達(dá)水平。結(jié)果與正常對照組相比，模型組水平運(yùn)動(dòng)得分、垂直運(yùn)動(dòng)得分和糖水偏愛度明顯降低(P<0.01，P<0.001)，與模型組比較，西藥組和中藥組水平運(yùn)動(dòng)得分、垂直運(yùn)動(dòng)得分和糖水偏愛度均明顯升高(P<0.05，P<0.001)；與正常對照組相比，模型組大鼠海馬區(qū)BDNF mRNA與蛋白表達(dá)明顯下調(diào)(P<0.05)，與模型組相比，西藥組、中藥組海馬區(qū)BDNF mRNA與蛋白表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.05)。結(jié)論柴胡皂苷A抗抑郁癥的作用機(jī)制可能與其促進(jìn)海馬區(qū)BDNF蛋白與mRNA的活性和表達(dá)，進(jìn)而減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡有關(guān)。

關(guān)鍵詞〔〕柴胡皂苷A；抑郁癥；腦源性神經(jīng)生長因子；細(xì)胞凋亡

中圖分類號(hào)〔〕R749.4〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A〔

基金項(xiàng)目：黑龍江省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目(12521624)

通訊作者：張曉杰(1965-)，女，教授，碩士生導(dǎo)師，博士，主要從事神經(jīng)精神疾病的病理學(xué)研究。

第一作者：董海影(1982-)，女，講師，碩士，主要從事神經(jīng)精神疾病的病理學(xué)研究。

世界衛(wèi)生組織(WHO)最新統(tǒng)計(jì)抑郁癥全球患病率約11%，并預(yù)測2020年抑郁癥將成為全球第二位醫(yī)療疾患〔1〕。現(xiàn)有抗抑郁癥藥主要包括單胺氧化酶抑制劑〔2〕、三環(huán)類抗抑郁藥〔3〕和選擇性5-羥色胺(5-HT)和去甲腎上腺素(NE)再攝取抑制劑〔4〕。這些藥物的療效一般只有60%～70%，并且伴有許多副作用，臨床應(yīng)用受到一定的局限〔5〕。因此，積極尋找特效、低毒、易透過血腦屏障的抑郁癥治療藥物成為當(dāng)今我國乃至世界面臨的緊迫任務(wù)之一。柴胡是臨床上對抑郁癥治療應(yīng)用廣泛且療效較好的藥物之一，柴胡皂苷A是其主要有效成分。本研究探討柴胡皂苷A的抗抑郁癥作用。

1材料與儀器

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物4~5月齡清潔級(jí)SD雄性大鼠60只，體重200～220 g，由大連醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證編號(hào)：SCXK(遼)2008-0002。

1.2試劑與藥品AnnexinV-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒由美國BIPE公司提供；柴胡皂苷A由南京朗澤醫(yī)藥科技公司提供；鹽酸氟西汀由中美合資中化藥品工業(yè)有限公司提供；SP免疫組化染色試劑盒由武漢博士德生物工程科技公司提供。

1.3儀器Medima-chine流式單細(xì)胞制備儀(美國BD公司)，F(xiàn)ACS Calibur流式細(xì)胞儀(美國BD公司)，EM208S透射電子顯微鏡(荷蘭菲利浦公司)。

1.4方法

1.4.1動(dòng)物分組動(dòng)物購回后在安靜、溫暖(18℃～20℃)、通風(fēng)良好、無噪音和自然光照的環(huán)境中喂養(yǎng)1 w。通過敞箱實(shí)驗(yàn)將水平運(yùn)動(dòng)次數(shù)加垂直運(yùn)動(dòng)次數(shù)不足30次或超過120次的大鼠剔除，隨機(jī)分為正常對照組、模型組、西藥組和中藥組共4組，每組15只。

1.4.2造模方法模型組、西藥組和中藥組單籠飼養(yǎng)，同時(shí)進(jìn)行21 d的慢性輕度不可預(yù)見性應(yīng)激刺激：電擊足底(電流強(qiáng)度1 mA，電壓45 mV，持續(xù)時(shí)間10 s/次，共30次)、搖晃(1次/s,15 min)、冰水游泳(4℃,5 min)、熱應(yīng)激(45℃,5 min)、夾尾(3 min)、禁食(24 h)、禁水(24 h)、束縛(8 h)、晝夜顛倒、傾斜鼠籠與潮濕墊料(100 g墊料中加入200 ml水)。每天隨機(jī)安排1種刺激方式，每種刺激在實(shí)驗(yàn)過程中使用不超過3次。正常對照組大鼠不予任何刺激。

1.4.3給藥方法造模同時(shí)，中藥組按25 mg·kg-1·d-1灌胃給予柴胡皂苷，1次/d，連續(xù)21 d。西藥組按1.2 mg·kg-1·d-1灌胃給予氟西汀，每日1次，共21 d。

1.4.4抑郁模型大鼠行為學(xué)評價(jià)Open-field測定方法：實(shí)驗(yàn)裝置為高40 cm、底邊長80 cm、周壁涂黑、底板白色的無蓋方箱，底板用黑線劃成16 cm×16 cm的25個(gè)方格。每只動(dòng)物單獨(dú)進(jìn)行測定，每次測定時(shí)間為3 min，兩只動(dòng)物之間用體積分?jǐn)?shù)為10%的酒精清洗方箱周壁及底板。計(jì)分方法：將大鼠輕放于方箱底板中心，以大鼠穿越底面格數(shù)為水平活動(dòng)得分，大鼠3只腳以上均在同一格子內(nèi)為一格，穿越一格計(jì)1分，如大鼠沿線行走，以每10 cm為1分；以大鼠直立次數(shù)為垂直活動(dòng)得分，雙足離開底面為標(biāo)志。糖水偏愛度的測定：24 h的禁食禁水后，測定1 h動(dòng)物飲用1%蔗糖水和純水的量，然后應(yīng)用公式：1%蔗糖水消耗量/(1%蔗糖水消耗量+純水消耗量)×100%，計(jì)算出各組大鼠糖水偏愛度值。

1.4.5免疫組化法測定大鼠海馬區(qū)腦源性神經(jīng)生長因子(BDNF)的蛋白表達(dá)大鼠灌注固定，斷頭取腦，分離海馬，固定，包埋，切片，加抗體，顯色，復(fù)染，脫水，封片，光鏡下觀察并用Motic Med 6.0數(shù)碼醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)計(jì)算積分光密度。

1.4.6RT-PCR檢測BDNF mRNA分離海馬，提取RNA，檢測RNA純度及完整性。使用Sequence Detection software version 1.2.3軟件分析各標(biāo)本的的循環(huán)閾值(Cycle threshold，Ct值)。采用ΔCt法計(jì)算實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以2-ΔCt為 mRNA 的相對濃度，實(shí)驗(yàn)組與對照組 mRNA 相對濃度的比值為實(shí)驗(yàn)組mRNA表達(dá)相對于對照組的倍數(shù)。BDNF引物正義鏈：5′-CCCTTCTACACTTTACCTCTTG-3′，反義鏈：5′-GTTTCACCCTTTCCACTCCTA-3′。

1.4.7大鼠海馬神經(jīng)元形態(tài)超微結(jié)構(gòu)的觀察大鼠斷頭取腦，以0.1 mol/L的PBS沖洗，10%鋨酸4℃冰箱后固定2 h，丙酮梯度脫水后丙酮+包埋劑(1∶1)浸透2 h，環(huán)氧樹脂包埋3 h，聚合37℃，12 h；45℃，22 h；60℃，16 h使之聚合硬化，切片，染色，觀察。

1.4.8大鼠海馬神經(jīng)元凋亡的檢測大鼠腦海馬組織剪碎，制成細(xì)胞懸液，經(jīng)0.7 μm，200目規(guī)格的濾網(wǎng)過濾到離心管中，離心，去上清。加入緩沖液重新懸浮細(xì)胞，調(diào)細(xì)胞濃度約1×106個(gè)/ml，用冰凍的PBS沖洗1次，離心，去上清。加入10 μl的AnnexinV-FITC和5 μl的Propidium Iodide，輕輕搖勻，室溫避光孵育15 min。加入400 μl上樣緩沖液液后，立即上流式細(xì)胞儀測定。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS13.0軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2結(jié)果

2.1各組大鼠行為學(xué)評價(jià)結(jié)果見表1~表3。與正常對照組相比，模型組水平運(yùn)動(dòng)得分、垂直運(yùn)動(dòng)得分和糖水偏愛度明顯降低(P<0.01,P<0.001),與模型組比較，西藥組和中藥組上述指標(biāo)明顯升高(P<0.05;P<0.001)。

2.2柴胡皂苷A對大鼠海馬區(qū)BDNF蛋白與mRNA表達(dá)的影響見表4，圖1。與正常對照組比較，模型組大鼠海馬區(qū)BDNF mRNA及蛋白表達(dá)明顯下調(diào)(P<0.05)，與模型組比較，西藥組、中藥組海馬區(qū)BDNF mRNA及與蛋白表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.05)。

表1　各組大鼠Open-Field實(shí)驗(yàn)水平運(yùn)動(dòng)

與正常對照組比較：1)P<0.05，2)P<0.01，3)P<0.001；與模型組比較：4)P<0.05,5)P<0.01，6)P<0.001，下表同

表2　各組大鼠Open-Field實(shí)驗(yàn)垂直運(yùn)動(dòng)

表3　各組大鼠糖水偏愛度實(shí)驗(yàn)數(shù)值比較 ± s,%， n=6)

與正常對照組比較：1)P<0.01，2)P<0.001；與模型組比較：3)P<0.01

表4　各組大鼠海馬區(qū)BDNF表達(dá)比較

與模型組比較：1)P<0.05；與西藥組比較：2)P<0.05

正常對照組

模型組

西藥組

中藥組

2.3柴胡皂苷A對大鼠海馬超微結(jié)構(gòu)的影響電鏡下正常對照組神經(jīng)元胞核卵圓形，核膜清晰，核染色質(zhì)均勻，細(xì)胞器豐富；模型組神經(jīng)元胞體變小，胞核呈現(xiàn)皺縮改變，核膜凹凸不整，模糊不清，核染色質(zhì)增多，塊狀向邊緣聚集，胞質(zhì)內(nèi)線粒體腫脹，空泡樣，可見大量脂褐素；西藥組神經(jīng)元核仁明顯，細(xì)胞器豐富，游離核蛋白體非常豐富，偶見脂褐素；中藥組神經(jīng)元胞體基本正常，核內(nèi)異染色質(zhì)減少，核周間隙基本正常，高爾基體，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)正常。見圖2。

正常對照組(×40 000)

模型組(×20 000)

西藥組(×25 000)

中藥組(×25 000)

3討論

近年來抑郁癥病因?qū)W研究最具突破性的進(jìn)展之一是“抑郁癥海馬神經(jīng)元再生障礙假說”的提出〔6〕，該假說認(rèn)為抑郁癥的發(fā)生與神經(jīng)系統(tǒng)可塑性失調(diào)密切相關(guān)，具體表現(xiàn)為神經(jīng)損傷與神經(jīng)發(fā)生障礙。海馬是腦內(nèi)重要邊緣系統(tǒng)結(jié)構(gòu)之一，對應(yīng)激反應(yīng)非常敏感且易損傷，參與應(yīng)激的神經(jīng)內(nèi)分泌反應(yīng)和情緒調(diào)節(jié)。神經(jīng)病理學(xué)研究顯示，抑郁癥的病因與海馬區(qū)域神經(jīng)細(xì)胞的萎縮和壞死有關(guān)〔7〕，從而證實(shí)抑郁癥的發(fā)病與海馬結(jié)構(gòu)關(guān)系密切。BDNF是神經(jīng)營養(yǎng)因子家庭中的重要成員之一，廣泛分布于哺乳類動(dòng)物的中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)，尤以海馬、皮層、杏仁核含量最高〔8〕，為公認(rèn)的神經(jīng)可塑性的分子標(biāo)記物。BDNF對多種類型的神經(jīng)元具有分化、增殖、營養(yǎng)、成熟的作用，尤其與多巴胺、膽堿能、5-HT神經(jīng)元的可塑性密切相關(guān)〔9〕。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)應(yīng)激和糖皮質(zhì)激素導(dǎo)致慢性應(yīng)激抑郁癥時(shí)海馬BDNF表達(dá)下調(diào)，而BDNF對突觸有支持作用〔10〕。國內(nèi)外一些研究發(fā)現(xiàn)〔11〕，抑郁癥患者血清BDNF水平較正常對照者低，且與抑郁程度、病程呈負(fù)相關(guān)，經(jīng)抗抑郁治療后血清BDNF水平上升，并且抑郁癥患者血清BDNF水平與病程及嚴(yán)重程度呈負(fù)相關(guān)。

中藥在治療情志性疾病方面有自己獨(dú)特的理論體系，也積累了不少臨床上有效的方藥。中醫(yī)認(rèn)為，抑郁癥是由于情志不暢、氣機(jī)郁滯所引起的一類病癥。凡具有外感邪氣而內(nèi)著血脈或情致佛郁而內(nèi)著臟腑，以致氣機(jī)阻滯，進(jìn)而誘發(fā)痰結(jié)、血瘀、火郁等癥者，多屬“郁癥”的范疇。本研究選取了針對抑郁癥發(fā)病的關(guān)鍵病機(jī)“肝郁氣滯”，選用了具有“疏肝解郁”作用的要藥柴胡，提取出它的主要有效成分柴胡皂苷進(jìn)行抗抑郁作用的研究。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，柴胡皂苷可能通過調(diào)控BDNF，從而拮抗抑郁癥模型大鼠海馬神經(jīng)元凋亡，這可能是柴胡皂苷治療抑郁癥的機(jī)制之一，但其抗抑郁癥的具體機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)4

1Kendler KS，Gardner CO.Dependent stressful life events and prior depressive episodes in the prediction of major depression：the problem of causal inference in psychiatric epidemiology〔J〕.Arch Gen Psychiatry，2010；67(11)：1120-37.

2Adli M，Pilhatsch M，Bauer M，etal.Safety of high-intensity treatment with the irreversible monoamine oxidase inhibitor tranylcypromine in patients with treatment-resistant depression〔J〕.Pharmacopsychiatry，2008；41(6):252-7.

3Van Reedt Dortland AK，Giltay EJ，van Veen T，etal.Metabolic syndrome abnormalities are associated with severity of anxiety and depression and with tricyclic antidepressant use〔J〕.Acta Psychiatr Scand，2010；122(1):30-9.

4Andre K，Kampman O，Set?l?-Soikkeli E，etal.Temperament profiles，5-HT2A genotype，and response to treatment with SSRIs in major depression〔J〕.J Neural Transm，2010；117(12):1431-4.

5Sanford M，Boyle M，McCleary L，etal.A pilot study of adjunctive family psychoeducation in adolescent major depression：feasibility and treatment effect〔J〕.J Am Acad Child Adolesc Psychiatry，2006；45(4):386-95.

6Thomas RM，Peterson DA.A neurogenic theory of depression gains momentum〔J〕.Mol Interv，2003；3(8):441-4.

7McEwen BS.Plasticity of the hippocampus：adaptation to chronic stress and allostatic load〔J〕.Ann NY Acad Sci，2001；933(3):265-77.

8You J，Yuan Y，Zhang Z，etal.A preliminary association study between brain-derived neurotrophic factor (BDNF) haplotype and late-onset depression in mainland Chinese〔J〕.J Affect Disord，2010；120(1-3):165-9.

9Cheeran B，Talelli P，Mori F，etal.A common polymorphism in the brain-derived neurotrophic factor gene (BDNF) modulates human cortical plasticity and the response to rTMS〔J〕.J Physiol，2008；586(Pt 23):5717-25.

10Gómez-Casati ME，Murtie JC，Rio C，etal.Nonneuronal cells regulate synapse formation in the vestibular sensory epithelium via erbB-dependent BDNF expression〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA，2010；107(39):17005-10.

11Neumeister A.Tryptophandepletion,serotonin and depression:where do we stand〔J〕.Psyhopharmacol Bulletin，2003；37(4):99-115.

〔2013-09-15修回〕

(編輯趙慧玲/曹夢園)