溫度、二硫蘇糖醇、基因定點(diǎn)突變對(duì)溶菌酶和肽基脯氨酰順?lè)串悩?gòu)酶蛋白交聯(lián)反應(yīng)的影響

徐燕邵世濱董立1閆曉華1高音2

(山東醫(yī)學(xué)高等專(zhuān)科學(xué)校生物化學(xué)教研室，山東臨沂276002)

摘要〔〕目的研究二硫鍵對(duì)溶菌酶和肽基脯氨酰順?lè)串悩?gòu)酶(PPI)蛋白交聯(lián)聚集作用的影響。方法以人總RNA為模板設(shè)計(jì)引物進(jìn)行人類(lèi)PPI基因的克隆，以獲取的正常型表達(dá)載體為模板，利用PCR定點(diǎn)突變的方法破壞掉PPI 基因中形成二硫鍵的兩個(gè)半胱氨酸殘基(Cys)，將其構(gòu)建到pTrcHisC-hppI原核表達(dá)系統(tǒng)，經(jīng)異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)獲得正常型和突變型PPI蛋白，與溶菌酶在不同溫度、還原劑二硫蘇糖醇(DTT)存在條件下進(jìn)行蛋白聚集反應(yīng)，十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)和Western印跡法分析和鑒定交聯(lián)情況。結(jié)果溶菌酶和PPI在臨界變性溫度時(shí)有明顯的二聚體和多聚體條帶；反應(yīng)體系中加入DTT后，幾乎觀察不到交聯(lián)條帶，兩者的異源蛋白交聯(lián)反應(yīng)出現(xiàn)同樣的現(xiàn)象；將突變型PPI置于與正常型PPI完全相同的反應(yīng)條件下，均沒(méi)有任何蛋白聚集現(xiàn)象。結(jié)論二硫鍵是蛋白質(zhì)交聯(lián)和多聚化發(fā)生的前提，破壞二硫鍵將導(dǎo)致蛋白結(jié)構(gòu)和交聯(lián)作用的喪失。

關(guān)鍵詞〔〕二硫蘇糖(DTT)；二硫鍵；定點(diǎn)突變；肽基脯氨酰順?lè)串悩?gòu)酶(PPI)交聯(lián)

中圖分類(lèi)號(hào)〔〕R39〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A〔

基金項(xiàng)目：山東省高等學(xué)?？萍加?jì)劃項(xiàng)目(J13LK18)

1山東醫(yī)學(xué)高等專(zhuān)科學(xué)校檢驗(yàn)系2首都師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院

第一作者：徐燕(1979-)，女，碩士，講師，主要從事蛋白質(zhì)工程研究。

人類(lèi)肽基脯氨酰順?lè)串悩?gòu)酶(hPPI)是可以催化脯氨酸殘基發(fā)生構(gòu)象折疊反應(yīng)的酶，參與多種疾病的發(fā)生，特別是病毒性疾病的感染過(guò)程〔1～3〕。本實(shí)驗(yàn)利用還原劑二硫蘇糖醇(DTT)處理PPI活性蛋白，破壞其二硫鍵觀察對(duì)其蛋白聚集作用的影響。同時(shí)，利用PCR定點(diǎn)突變技術(shù)，突變PPI中的兩個(gè)半胱氨酸殘基為絲氨酸，從而改變蛋白的一級(jí)結(jié)構(gòu)，檢測(cè)對(duì)PPI蛋白高級(jí)結(jié)構(gòu)以及聚合交聯(lián)作用的影響。

1材料與方法

1.1正常型與突變型PPI蛋白的制備PPI取自實(shí)驗(yàn)室保存的293T細(xì)胞系，于液氮復(fù)蘇后于培養(yǎng)箱培養(yǎng)，用含10%的胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基在5%的CO2條件下進(jìn)行培養(yǎng)。24 h后收集細(xì)胞用Trizol法進(jìn)行總RNA的提取。利用前面提取的人總RNA為模板設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PPI基因的克隆。序列信息如下：正向引物CTGCAGATGGTCAACCCCACCGTGTTCT和反向引物GAATTCTGACTGTGGACAACTCGAATAA。然后以cDNA為模板和克隆引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增PPI基因的編碼區(qū)序列。克隆獲得PPI基因經(jīng)測(cè)序正確無(wú)誤后，將其構(gòu)建到pTrcHisC-hPPI原核表達(dá)系統(tǒng)的多克隆位點(diǎn)區(qū)域，從而構(gòu)建含6個(gè)組氨酸的融合蛋白。載體構(gòu)建成功后，利用終濃度為1 mmol/L的異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)(北京鼎國(guó)生物科技有限公司)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)以獲取大量的目的蛋白，表達(dá)后的產(chǎn)物少量提取后用12%的十二烷基磺酸鈉-丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)進(jìn)行鑒定。鑒定正確后，再進(jìn)行大量蛋白的提取和純化。利用Talon金屬親和層析樹(shù)脂純化柱純化目的蛋白，將純化后的蛋白利用BCA法(大連寶生物)進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定，用于交聯(lián)反應(yīng)。通過(guò)分析PPI的編碼區(qū)序列發(fā)現(xiàn)該基因一共含有兩個(gè)半胱氨酸(Cys)分別位于52和62位。利用定點(diǎn)突變的方法將這兩個(gè)氨基酸突變?yōu)榻z氨酸從而破壞其二硫鍵形成的可能性。以獲取的正常型的表達(dá)載體為模板，設(shè)計(jì)定點(diǎn)引物正向引物mu為GTTCCTCCTTTCACAGAATTATTCCAGGGTTTATGTCCCAGGGTG和反向引物mu為CACCCTGGGACATAAACCCTGGAATAATTCTGTGAAAGGAGGAAC進(jìn)行PCR擴(kuò)增，從而實(shí)現(xiàn)PCR產(chǎn)物的突變。測(cè)序正確后如同正常型載體表達(dá)和純化過(guò)程進(jìn)行突變型PPI蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)和純化，用于下一步的交聯(lián)反應(yīng)。

1.2蛋白質(zhì)的體外交聯(lián)反應(yīng)

1.2.1溫度對(duì)溶菌酶(Lysozyme)和PPI交聯(lián)的影響將純化的PPI凍干濃縮后，與溶菌酶在4個(gè)反應(yīng)體系中培養(yǎng)40 min，SDS-PAGE分析交聯(lián)情況。見(jiàn)表1。

表1溶菌酶和hPPI的熱變性交聯(lián)反應(yīng)(mmol/L)

Tris-clGSHGSSG溶菌酶PPI溫度(℃)130210.2075230210.20.575330210.20.544302100.575

1.2.2變性劑DTT和定點(diǎn)突變對(duì)溶菌酶和兩種PPI蛋白交聯(lián)的影響在與上相同的緩沖體系中，熱變性交聯(lián)溫度下，SDS-PAGE分析DTT和點(diǎn)突變對(duì)同源和異源蛋白交聯(lián)的影響。

1.3Western印跡鑒定將電泳樣品轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜，與兔抗人PPI一抗4℃孵育過(guò)夜。經(jīng)緩沖液TBST洗滌后，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔PPI抗體，37℃孵育60 min，增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光法(ECL)鑒定交聯(lián)結(jié)果。

2結(jié)果

2.1溫度影響蛋白質(zhì)交聯(lián)溶菌酶和PPI在4℃沒(méi)有任何交聯(lián)，而在熱變性的75℃有明顯的二聚體和多聚體條帶。PPI的分子量為24 kD，故溶菌酶的三聚體與兩者的異源二聚體分子量相差不大。為排除上述干擾，進(jìn)行Western 印跡鑒定表明，第3條帶為異源二聚體交聯(lián)。見(jiàn)圖1。

蛋白marker分子量分別14.4、20、26、33、45、66.2、94 kD 圖1　溫度對(duì)蛋白質(zhì)交聯(lián)影響的SDS-PAGE和 Western印跡分析

2.2變性劑DTT影響蛋白質(zhì)交聯(lián)75℃變性條件下進(jìn)行交聯(lián)實(shí)驗(yàn)，溶菌酶蛋白可以形成同源二聚體和多聚體(第2條帶)；但是當(dāng)添加DTT變性劑的條件下，幾乎檢測(cè)不到二聚體和多聚體的存在，同源蛋白的聚合作用消失(第3條帶)。同樣，對(duì)于PPI蛋白，75℃變性條件下可以檢測(cè)到二聚體和多聚體的同源聚合作用(第6條帶)，但是在DTT存在的情況下，PPI蛋白出現(xiàn)類(lèi)似于溶菌酶的結(jié)果，同源蛋白不發(fā)生聚合作用(第7條帶)。兩者的異源蛋白交聯(lián)反應(yīng)出現(xiàn)同樣的結(jié)果(第4、5條帶)。Western印跡分析同樣支持上述結(jié)果。這說(shuō)明DTT可以破壞二硫鍵的形成，從而阻止同源和異源蛋白的聚合作用，即便在適宜交聯(lián)的溫度下，也不能形成聚合復(fù)合物。見(jiàn)圖2。

2.3定點(diǎn)突變破壞蛋白質(zhì)交聯(lián)正常型的PPI蛋白在臨界變性溫度75℃的交聯(lián)作用下發(fā)生聚合作用，形成二聚體和多聚體(第2條帶)。而突變型PPI蛋白在臨界變性溫度75℃的交聯(lián)作用下不發(fā)生同源聚合作用，SDS-PAGE與Western印跡均未檢測(cè)到蛋白的聚合作用(第3條帶)。同樣兩種檢測(cè)方法表明，溶菌酶與突變型PPI的混合液僅出現(xiàn)了溶菌酶聚合反應(yīng)，未出現(xiàn)異源蛋白交聯(lián)(第3條帶)。這說(shuō)明，在交聯(lián)反應(yīng)的過(guò)程中，二硫鍵起到至關(guān)重要的作用，一旦不可逆地破壞二硫鍵的存在，將導(dǎo)致同源和異源蛋白聚合作用的消失。見(jiàn)圖3。

蛋白marker分子量分別14.4、20、26、33、45、66.2、94 kD。交聯(lián)溫度為75℃ 圖2　變性劑對(duì)蛋白交聯(lián)聚合作用的SDS-PAGE和 Western印跡分析

marker為14.4、20、26、33、45、66.2和94 kD。交聯(lián)溫度為75℃ 圖3　兩種PPI蛋白與溶菌酶交聯(lián)反應(yīng)的 SDS-PAGE和Western印跡分析

3討論

蛋白質(zhì)易受外界因素影響而發(fā)生構(gòu)象變化，物理化學(xué)性質(zhì)發(fā)生異常變化，最終導(dǎo)致蛋白活性喪失。而蛋白的構(gòu)象則主要源于蛋白一級(jí)結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)進(jìn)行折疊、聚合等過(guò)程，形成有活性的高級(jí)結(jié)構(gòu)。而在這個(gè)過(guò)程中，分子鍵起到關(guān)鍵的作用，特別是二硫鍵。二硫鍵是最為常見(jiàn)的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)修飾，對(duì)穩(wěn)定蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)，調(diào)節(jié)蛋白活性有著非常重要的作用。利用PCR技術(shù)對(duì)人免疫缺陷病毒I型(HIV-1)囊膜蛋白(Env)七肽重復(fù)區(qū)HRI和HR2之間linker進(jìn)行定點(diǎn)突變破壞二硫鍵的形成，將導(dǎo)致該蛋白活性的改變，不能正確識(shí)別和定位〔4〕。通過(guò)比較被拆分不同數(shù)目二硫鍵的人轉(zhuǎn)鐵蛋白和正常蛋白的活性，檢測(cè)二硫鍵對(duì)它們結(jié)合金屬離子和與轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的結(jié)合能力，結(jié)果表明隨二硫鍵被拆分?jǐn)?shù)目的增加，其與受體結(jié)合能力比結(jié)構(gòu)金屬離子能力的喪失快〔5〕。在研究朊病毒蛋白分子的活性中發(fā)現(xiàn)，重組正常人朊病毒蛋白經(jīng)沉淀實(shí)驗(yàn)顯示經(jīng)過(guò)二硫鍵硫醇基團(tuán)的氧化還原之后其蛋白聚集性顯著增加，而二硫鍵破壞的突變體蛋白則沒(méi)有明顯變化〔6〕。風(fēng)疹病毒(RV)包膜糖蛋白E1外功能區(qū)的10個(gè)二硫鍵對(duì)RV的細(xì)胞融合活性都有重要影響，任何一個(gè)二硫鍵的去除均導(dǎo)致E1的細(xì)胞融合活性喪失〔7〕?？梢?jiàn)，二硫鍵對(duì)蛋白活性的發(fā)揮起到至關(guān)重要的作用。同時(shí)，二硫鍵很容易被還原而斷裂，但是斷裂后在適當(dāng)?shù)臈l件下又可以氧化反應(yīng)重新形成二硫鍵，因此二硫鍵形成是一個(gè)動(dòng)態(tài)過(guò)程。

根據(jù)以往研究〔8〕，溶菌酶和PPI的熱變性交聯(lián)溫度均在75℃左右。此次研究發(fā)現(xiàn)，溫度同樣影響異源蛋白質(zhì)交聯(lián)。DTT是一種很強(qiáng)的還原劑，其還原性很大程度上是由于其氧化狀態(tài)六元環(huán)(含二硫鍵)的構(gòu)象穩(wěn)定性。DTT常被用于蛋白質(zhì)中二硫鍵的還原，可用于阻止蛋白質(zhì)中的半胱氨酸之間所形成的蛋白質(zhì)分子內(nèi)或分子間二硫鍵，能夠保護(hù)正常晶體蛋白所含的半胱氨酸等成分不受氧化修飾，減少其變性可能性。二硫鍵在維持蛋白穩(wěn)定性和蛋白聚合過(guò)程中發(fā)揮重要作用。本實(shí)驗(yàn)針對(duì)PPI蛋白進(jìn)行定點(diǎn)突變，將PPI蛋白中存在的兩個(gè)半胱氨酸全部進(jìn)行突變?yōu)榻z氨酸，從而阻斷PPI蛋白二硫鍵的形成，試驗(yàn)體外研究二硫鍵對(duì)PPI蛋白聚合作用的影響。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)，變性劑DTT通過(guò)破壞二硫鍵可以導(dǎo)致同源和異源蛋白的聚合作用，即便是在變性條件下進(jìn)行交聯(lián)，依然檢測(cè)不到聚合復(fù)合物，說(shuō)明DTT對(duì)二硫鍵的破壞是不可逆作用，同時(shí)也表明了化學(xué)變性劑對(duì)蛋白交聯(lián)聚合的影響。另一方面，通過(guò)定點(diǎn)突變半胱氨酸，破壞PPI蛋白的一級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)而破壞其二硫鍵，導(dǎo)致同源蛋白和異源蛋白都不發(fā)生聚合作用。同時(shí)，在異源交聯(lián)反應(yīng)實(shí)驗(yàn)中，檢測(cè)到PPI和溶菌酶發(fā)生異源聚合作用，說(shuō)明聚合反應(yīng)是蛋白的一個(gè)非特異性特征，只要條件適當(dāng)，異源蛋白同樣會(huì)發(fā)生聚合作用。這些實(shí)驗(yàn)再次驗(yàn)證了前期本課題組所提出的提出了蛋白質(zhì)交聯(lián)機(jī)制的三步假說(shuō)〔9〕：第一步蛋白質(zhì)構(gòu)象包括二級(jí)結(jié)構(gòu)改變；第二步形成分子間二硫鍵；第三步形成分子間異肽鍵。DTT破壞二硫鍵的形成，從而阻斷了交聯(lián)反應(yīng)的第二步導(dǎo)致聚合作用抑制。而蛋白一級(jí)結(jié)構(gòu)的改變，特別是半胱氨酸的改變，將直接導(dǎo)致二硫鍵形成受阻，從而改變蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)以及后續(xù)的交聯(lián)作用?？梢?jiàn)，二硫鍵是蛋白質(zhì)交聯(lián)和多聚化發(fā)生的前提，破壞二硫鍵將導(dǎo)致蛋白結(jié)構(gòu)和交聯(lián)作用的喪失。因此，可以利用二硫鍵的對(duì)交聯(lián)作用的影響應(yīng)用于臨床。

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〔2013-12-27修回〕

(編輯苑云杰)