香煙提取物對大鼠血管內(nèi)皮細胞的損害

朱濤李鋒1嚴飛劉正霍強

(新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院心臟外一科，新疆烏魯木齊830011)

摘要〔〕目的探究香煙提取物(CSE)對大鼠血管內(nèi)皮細胞(VEC)的影響。方法利用原代培養(yǎng)的方法獲得大鼠主動脈VEC(RVEC)，采用不同濃度的CSE處理RVEC，分別用MTT和流式細胞儀來檢測三組細胞的增殖和凋亡情況，并檢測細胞乳酸脫氫酶(LDH)釋放情況。同時，采用雙抗體夾心ELISA法檢測細胞分泌的腫瘤壞死因子(TNF)-α、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-1、MMP-2、MMP-3和MMP-10的情況。結(jié)果MTT實驗中，與0.05%組相比，0.5%濃度組的細胞生長顯著變慢(P<0.05)，且這種抑制作用呈現(xiàn)劑量依賴性。LDH釋放結(jié)果顯示，與0.05%組相比，20%濃度的CSE處理可導(dǎo)致細胞LDH釋放顯著升高(P<0.01)，且隨著CSE濃度的進一步升高，LDH釋放逐漸增多。經(jīng)過24 h后，CSE處理后的細胞凋亡逐漸增多，差異明顯(P<0.01)。而對于細胞分泌的TNF-α、MMP-1、MMP-2、MMP-3和MMP-10含量，CSE干預(yù)組均比對照組明顯增加(P<0.01)。結(jié)論CSE可以明顯抑制RVEC的生長，加劇其凋亡，并促進細胞分泌TNF-α、MMP-1、MMP-2、MMP-3和MMP-10的能力。

關(guān)鍵詞〔〕香煙提取物；血管內(nèi)皮細胞；細胞增殖；細胞凋亡；腫瘤壞死因子α

中圖分類號〔〕R73〔文獻標識碼〕A〔

通訊作者：霍強(1967-)，男，碩士生導(dǎo)師，副教授，主任醫(yī)師，主要從事心胸外科學(xué)研究。

1伊犁州友誼醫(yī)院心血管介入科

第一作者：朱濤(1979-)，男，碩士，主治醫(yī)師，主要從事心胸外科學(xué)研究。

血管壁異常主要指血管內(nèi)皮細胞(VEC)損傷，是造成急性冠脈事件的重要原因，也是糖尿病腎病等疾病發(fā)生的共同病理環(huán)節(jié)。香煙及其煙霧中含有上千種化合物和有毒物質(zhì)，都具有刺激性和潛在致癌性。吸煙是諸多血管缺血性疾病如動脈硬化閉塞、血栓閉塞性脈管炎等疾病的重要危險因素〔1～6〕，本研究通過檢測香煙提取物(CSE)對原代培養(yǎng)的大鼠主動脈VEC(RVEC)內(nèi)皮細胞的損傷，探討此類疾病的發(fā)生機制。

1材料與方法

1.1材料DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶、青、鏈霉素和磷酸鹽緩沖液(PBS)均購自HyClone公司；二甲基亞砜(DMSO)、四甲基偶氮唑鹽(MTT)、溴化丙啶(PI)購于Sigma公司；Rnase購于上海生工； ELISA試劑盒購自上海恒遠生物技術(shù)發(fā)展有限公司。

1.2方法

1.2.1大鼠RVEC懸液的制備無菌操作取出大鼠主動脈，立即在無菌D-Hank液洗凈血管外壁血液及分離脂肪組織等，并用注射器將血管內(nèi)血液沖洗干凈，剪成大約2 mm×2 mm的動脈片，然后貼入滅菌25 mm培養(yǎng)瓶中，置于37℃,5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)進行原代培養(yǎng)。

1.2.2CSE的制備使用國產(chǎn)某品牌香煙，參照Nakamura等〔7〕：將煙嘴與泵相連，通過泵的抽氣作用，使去掉過濾嘴的香煙燃燒，按每包煙通入1 000 ml Hank液制成懸液。懸液調(diào)至pH 7.4，經(jīng)孔徑0.2 μm微孔濾膜過濾除去細菌和大顆粒備用。

1.2.3MTT檢測將制備的大鼠RVEC以每孔5 000個細胞接種于96孔培養(yǎng)板培養(yǎng),將培養(yǎng)板移入CO2孵箱中,在37℃、5% CO2及飽和濕度條件下常規(guī)培養(yǎng)。細胞貼壁后通過換液分成對照組和不同濃度的CSE干預(yù)組，將各組細胞培養(yǎng)3 d后，每孔加入MTT溶液(5 g/L)20 μl,繼續(xù)培養(yǎng)4 h,終止培養(yǎng),小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液,每孔加入DMSO 150 μl,輕輕振蕩10 min,使結(jié)晶充分溶解,用酶聯(lián)免疫標記分析儀在490 nm波長處測定各孔的吸光度A值(A 490)。細胞增殖抑制率(%)=(對照孔OD值-試驗孔OD 值/對照孔OD值)×100%

1.2.4細胞凋亡檢測將大鼠RVEC分為對照組，5%、10%和15%CSE干預(yù)組，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，倒去培養(yǎng)基，胰酶消化細胞，離心去上清，PBS洗滌2次。加0.3 ml PBS重懸細胞，加入4 ml 70%乙醇(預(yù)冷)，4℃過夜固定，離心收集細胞，PBS洗滌2次，0.5 ml PBS重懸細胞，加入50 μg/ml RNase，37℃消化30 min，再加入50 μg/ml的PI，37℃避光染色30 min，流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

1.2.5細胞中細胞因子含量的檢測將大鼠RVEC分為對照組，5%、10%和15%CSE干預(yù)組，培養(yǎng)至單層貼壁融合后，將培養(yǎng)基更換為無血清培養(yǎng)基，37℃、5% CO2孵箱中過夜培養(yǎng)，收集上清，按照ELISA試劑盒說明書進行實驗，每組設(shè)3個復(fù)孔，用酶標儀在450 nm處讀取OD值。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法應(yīng)用SPSS13.0軟件行t檢驗。

2結(jié)果

2.1CSE對RVEC細胞增殖的影響MTT結(jié)果顯示，當(dāng)RVEC經(jīng)過不同濃度CSE處理后，與0.05%組相比，0.5%濃度組的細胞生長顯著變慢(P<0.05)，說明CSE可以抑制大鼠RVEC的增殖，并且這種抑制作用呈現(xiàn)劑量依賴性。乳酸脫氫酸(LDH)釋放結(jié)果顯示，與0.05%組相比，20%濃度的CSE處理可導(dǎo)致細胞LDH釋放顯著升高，且隨著CSE濃度的進一步升高，LDH釋放逐漸增多，提示20%或更高濃度的CSE破壞RVEC細胞膜的通透性。綜合上述結(jié)果，后續(xù)實驗選擇既有很好抑制效果，又不會破壞RVEC細胞膜通透性的5%、10%和15%濃度的CSE處理細胞。見表1。

2.2CSE對大鼠RVEC凋亡的影響流式細胞儀分析顯示，CSE作用大鼠RVEC 24 h后，與對照組相比，凋亡率顯著增加，并且隨著CSE作用濃度增加，凋亡率也隨之增加(P<0.05)，并且，早期凋亡和晚期凋亡與總體凋亡的趨勢相同。見表2。

CSE濃度早期凋亡率晚期凋亡率總凋亡率對照組5%10%15%P值7.237±2.14212.054±1.36319.872±2.38525.165±4.16<0.053.444±1.09714.656±2.08522.734±2.03531.325±4.525<0.0510.731±0.44226.750±0.74542.566±0.30656.335±0.713<0.05

2.3CSE對細胞中腫瘤壞死因子(TNF-α)含量的影響ELISA結(jié)果顯示，與對照組〔(10.227±1.903)pg/ml〕相比，CSE過夜處理細胞后，大鼠RVEC中的TNF-α含量明顯增加5%、10%、15%，CSE組TNF-α含量分別為(16.743±2.835)、(24.663±2.382)、(38.435±3.935)pg/ml，說明CSE可以促進大鼠RVEC分泌TNF-α，并且這種促進作用具有劑量依賴性(P<0.05)。

2.4CSE對細胞中基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)含量的影響 ELISA結(jié)果顯示，與對照組相比，CSE過夜處理細胞后，大鼠RVEC中的MMP含量明顯增加，說明CSE可以促進大鼠VEC分泌MMP，并且這種促進作用具有劑量依賴性(P<0.05)。見表3。

CSE濃度MMP-1MMP-2MMP-3MMP-10對照組87.832±7.392203.483±30.49112.934±1.38411.956±2.0455%146.342±14.825312.495±57.90217.493±2.95715.923±3.02310%201.492±22.935429.495±73.45228.394±3.20126.934±2.94815%291.934±45.924502.935±88.94240.394±3.94237.024±3.814P值<0.05<0.05<0.05<0.05

3討論

香煙及其煙霧中含有的有毒物質(zhì)對生物大分子如核酸、脂類和蛋白質(zhì)的損傷都很嚴重。RVEC在維持血管功能方面發(fā)揮著重要作用，許多心腦血管常見疾病的發(fā)生，本質(zhì)上都是血管內(nèi)皮受損所致的內(nèi)皮功能異常。其中，吸煙是重要的損傷因素之一。然而，對于吸煙造成血管內(nèi)皮損傷的機制卻并不清楚。有研究〔8〕表明，吸煙介導(dǎo)的過度氧化應(yīng)激可能是重要誘因。煙霧中的氧自由基和其他氧化劑的濃度較高，直接滅活內(nèi)皮源一氧化氮或者與一氧化氮結(jié)合形成具有強烈細胞毒性的過氧化氮，導(dǎo)致內(nèi)皮細胞一氧化氮活性降低；引起脂蛋白氧化，氧化型低密度脂蛋白逐漸聚集，從而啟動動脈粥樣硬化；增加血管緊張素轉(zhuǎn)換酶的活性，進一步增加炎癥細胞因子的表達、黏附和活化，對血管內(nèi)皮造成損害〔9〕。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)CSE可以抑制大鼠RVEC增殖，同時促進其凋亡。在細胞受到損害的過程中，TNF-α、MMP-1、MMP-2、MMP-3和MMP-10分泌增多，這些細胞因子分泌增多反過來又會進一步損傷RVEC，形成惡性循環(huán)，這些現(xiàn)象可能就是香煙煙霧中的氧自由基導(dǎo)致的一系列后果。本研究為保護內(nèi)皮細胞的臨床治療和藥物篩選提供了一定的理論依據(jù)。

4參考文獻

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6張同方,萬圣云,丁洋,等. Galectin-3對骨髓間充質(zhì)干細胞來源的內(nèi)皮細胞增殖的影響〔J〕. 中國普通外科雜志,2010;19(9):1005-9.

7Nakamura Y,Romberger DJ,Tate L,etal. Cigarette smoke inhibits lung fibroblast proliferation and chemotaxis〔J〕. Am J Respir Crit Care Med,1995;151(5):1497-503.

8Givi ME,Peck MJ,Boon L,etal. The role of dendritic cells in the pathogenesis of cigarette smoke-induced emphysema in mice〔J〕. Eur J Pharmacol,2013;721(3):259-66.

9Petrusca DN,Van Demark M,Gu Y,etal. Smoking exposure induces human lung endothelial cell adaptation to apoptotic stress〔J〕. Am J Respir Cell Mol Biol,2014;50(3):513-25.

〔2014-05-20修回〕

(編輯袁左鳴)