郝志強(qiáng)，曾繁榮，曹海燕，張?jiān)蒲?/p>

連云港市第一人民醫(yī)院1. 藥學(xué)部;2. 感染科;3. 檢驗(yàn)科，江蘇 連云港222002

Kupffer 細(xì)胞主要是指位于肝竇內(nèi)表面的吞噬細(xì)胞［1］，是全身單核-吞噬細(xì)胞系統(tǒng)的重要組成部分［2］，可影響肝細(xì)胞、星狀細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等肝內(nèi)主要組成細(xì)胞的生物學(xué)功能［3］。脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)是革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁中的一種重要成分［4］，作為一種強(qiáng)有力炎癥反應(yīng)誘導(dǎo)劑，能夠誘導(dǎo)Kupffer 細(xì)胞活化［5］，參與非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fattyliver disease，NAFLD)的發(fā)病。血脂康膠囊主要化學(xué)成分為紅曲［6］，具有治療脂肪肝的療效［7］，并能顯著降低患者血脂，改善肝功能，從而防止肝纖維化和肝硬化。本研究探討了血脂康膠囊對(duì)LPS 誘導(dǎo)大鼠肝臟Kupffer 細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子-κB(nuclear factor-κB，NFκB)活化的影響。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及主要試劑 血脂康膠囊購自北京北大維信生物科技有限公司。LPS 購自Sigma 公司。ELISA 試劑盒購自西塘生物技術(shù)有限公司。NF-κB p65 兔抗大鼠多克隆抗體購自英國(guó)Abcam 公司。二抗FITC 標(biāo)記的山羊抗兔多克隆抗體和山羊血清封閉工作液均購自北京中衫金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 SD 大鼠Kupffer 細(xì)胞分離、培養(yǎng):健康雄性SD 大鼠(清潔級(jí))，體質(zhì)量200 ～300 g，由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所提供。SD 大鼠肝臟Kupffer細(xì)胞的分離培養(yǎng)參照文獻(xiàn)［8］。將分離的Kupffer 細(xì)胞按1 ×105個(gè)/ml 接種于24 孔板，培養(yǎng)48 h 后，對(duì)照組:常規(guī)培養(yǎng)。LPS 組:給予終濃度為100 ng/ml 的LPS 培養(yǎng)8 h。血脂康膠囊組:血脂康膠囊用生理鹽水溶解，90 mg·kg-1·d-1，其余處理同LPS 組。

1.2.2 ELISA 法檢測(cè)細(xì)胞炎癥因子:ELISA 法測(cè)定收集的各組Kupffer 細(xì)胞上清腫瘤壞死因子-α(TNFα)、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)和白細(xì)胞介素-6(IL-6 )水平，按試劑盒說明書操作。具體參照文獻(xiàn)［9］，根據(jù)所設(shè)標(biāo)準(zhǔn)品稀釋梯度設(shè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出各樣本的濃度。1.2.3 HE 染色:HE 染色觀察對(duì)照組、LPS 組及血脂康膠囊組肝組織炎癥變化和脂肪變性程度。

1.2.4 Western blotting 檢測(cè)NF-κB p65 蛋白水平:收集Kupffer 細(xì)胞，提取不同組別Kupffer 細(xì)胞胞漿和胞核蛋白。BCA 法蛋白定量后，Western blotting 法參照文獻(xiàn)［9］，應(yīng)用ECL 發(fā)光液、化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)自動(dòng)曝光采集圖像。采用Image J 圖像分析軟件測(cè)定條帶灰度值，以目的條帶灰度值與β-actin 灰度值的比值反映各組胞漿IκBα、p-IκBα 及胞核NF-κB p65 蛋白表達(dá)情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 13.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料用±s 表示，采用配對(duì)t 檢驗(yàn)。P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 炎癥因子 LPS 組細(xì)胞上清TNF-α、IL-1β 和IL-6 表達(dá)高于對(duì)照組(P ＜0.05)。血脂康膠囊組細(xì)胞上清TNF-α、IL-1β 和IL-6 低于LPS 組(P ＜0.05)，但高于對(duì)照組(P ＜0.05，見表1)。

表1 血脂康膠囊對(duì)LPS 誘導(dǎo)Kupffer 細(xì)胞炎癥因子的影響(±s)Tab 1 The effect of Fat Kang Capsule on inflammatory factors in LPS induced Kupffer cells

表1 血脂康膠囊對(duì)LPS 誘導(dǎo)Kupffer 細(xì)胞炎癥因子的影響(±s)Tab 1 The effect of Fat Kang Capsule on inflammatory factors in LPS induced Kupffer cells

注:與對(duì)照組比較，＊P ＜0.05;與LPS 組比較，△P ＜0.05。

組別 例數(shù) TNF-α(ng/ml) IL-1β(ng/ml) IL-6(pg/ml)對(duì)照組15 1.23 ±0.38 0.45 ±0.15 48.27 ±10.05 LPS 組 15 51.48 ±11.55＊ 19.81 ±5.14＊ 295.72 ±45.41＊血脂康膠囊組 15 8.32 ±2.13＊△ 4.32 ±1.07＊△ 93.31 ±23.72＊△

2.2 肝臟病理變化 對(duì)照組:大鼠肝細(xì)胞偶見有散在小泡狀脂肪滴。LPS 組:視野內(nèi)1/3 以上的大鼠肝細(xì)胞出現(xiàn)脂肪變性，以肝腺泡3 帶為中心，其余的大部分肝細(xì)胞變性、腫脹，胞漿內(nèi)充滿小的空泡。血脂康膠囊組:大鼠肝細(xì)胞脂肪變性程度明顯減輕，脂滴數(shù)量減少(見圖1)。

圖1 各組大鼠肝組織HE 染色(200 × )A:對(duì)照組;B:LPS 組;C:血脂康膠囊組Fig 1 HE staining of liver tissue of rats in each group (200 × )A:control group;B:LPS group;C:Fat Kang Capsule group

2.3 血脂康膠囊對(duì)LPS 誘導(dǎo)Kupffer 細(xì)胞NF-κB水平表達(dá)影響 對(duì)照組胞漿蛋白IκBα 表達(dá)顯著高于LPS 組和血脂康膠囊組(P ＜0.05)，但LPS 組明顯低于血脂康膠囊組(P ＜0.05，見圖2)。LPS 組胞核NFκB p65 和p-IκBα 表達(dá)高于對(duì)照組和血脂康膠囊組(P ＜0.05)，但血脂康膠囊組表達(dá)低于LPS 組(P ＜0.05，見圖2)。

3 討論

圖2 血脂康膠囊對(duì)LPS 誘導(dǎo)Kupffer 細(xì)胞NF-κB 水平表達(dá)影響Fig 2 Effects of Fat Kang Capsule on the expression of NFκB in Kupffer cells induced by LPS

Kupffer 細(xì)胞的生物功能之一是具有清除細(xì)菌及毒素發(fā)揮抗感染作用［10］，另一方面是可通過釋放各種炎癥介質(zhì)放大炎癥反應(yīng)而造成組織損傷［11］。此外，Kupffer 細(xì)胞還可影響肝細(xì)胞、星狀細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等肝內(nèi)主要組成細(xì)胞的生物學(xué)功能［12］。因此，Kupffer 細(xì)胞在慢性炎性肝損傷過程中發(fā)揮重要作用。LPS 是革蘭陰性菌細(xì)胞膜的主要脂質(zhì)成分［13］，LPS 可激活肝內(nèi)Kupffer 細(xì)胞［14］，產(chǎn)生炎癥因子，并進(jìn)一步造成腸道黏膜及遠(yuǎn)隔器官損傷。在本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，LPS 組細(xì)胞上清TNF-α、IL-1β 和IL-6 表達(dá)高于對(duì)照組。血脂康膠囊組細(xì)胞上清TNF-α、IL-1β 和IL-6 低于LPS 組，但高于對(duì)照組。血脂康膠囊可減輕這些炎癥因子的合成。大鼠肝臟組織病理學(xué)觀察結(jié)果也顯示血脂康膠囊能夠有效地抑制LPS 誘導(dǎo)的大鼠肝臟的肝損傷。

NF-κB 是屬于Rel 家族的轉(zhuǎn)錄因子［15］，參與調(diào)節(jié)與機(jī)體免疫、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞分化有關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄［16］。Kupffer 細(xì)胞的NF-κB 等是介導(dǎo)內(nèi)毒素等多種致炎因子所致肝損害的重要分子通路［17-18］，而阻斷NF-κB 信號(hào)通路可抑制IL-1、TNF-α 等促炎因子介導(dǎo)的炎癥正反饋環(huán)，減輕炎癥程度。因此，以NF-κB 通路為潛在的治療位點(diǎn)，可能是解決失控性炎癥反應(yīng)的重要方向之一。本實(shí)驗(yàn)觀察到對(duì)照組胞漿蛋白IκBα 表達(dá)顯著高于LPS 組和血脂康膠囊組，但LPS 組明顯低于血脂康膠囊組。LPS 組胞核NF-κB p65 和p-IκBα 表達(dá)顯著高于對(duì)照組和血脂康膠囊組，但血脂康膠囊組表達(dá)顯著低于LPS 組，提示血脂康膠囊能夠抑制LPS 誘導(dǎo)的大鼠肝臟Kupffer 細(xì)胞NF-κB 活化。

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