·基礎(chǔ)研究·

LeftyA基因重組慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定

邱宇安陳文學(xué)靳文劍陳火國鐘寧余潔麗

作者單位:330029 江西省腫瘤醫(yī)院

【摘要】目的想構(gòu)建LeftyA基因的慢病毒表達(dá)載體，鑒定其在293T細(xì)胞中的表達(dá)。方法首先擴(kuò)增LeftyA基因序列，將其與慢病毒骨架載體連接后，鑒定慢病毒表達(dá)載體構(gòu)建成功。將重組慢病毒表達(dá)載體質(zhì)粒及包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，鑒定慢病毒轉(zhuǎn)染并包裝成功。結(jié)果LeftyA基因成功轉(zhuǎn)導(dǎo)至以GV287為骨架質(zhì)粒的慢病毒系統(tǒng)中，包裝后測定病毒滴度達(dá)2.0×108 TU/ml，免疫印記法檢測到LeftyA蛋白在293T細(xì)胞中的表達(dá)。結(jié)論成功構(gòu)建了攜帶人LeftyA基因的慢病毒表達(dá)系統(tǒng)。

【關(guān)鍵詞】LeftyA;慢病毒載體

基金項(xiàng)目：江西省青年科學(xué)基金資助項(xiàng)目(編號(hào)：20132BAB215018)

DOI：10.3969/j.issn.1001-5930.2015.12.001

中圖分類號(hào)：R73-36文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

收稿日期(2015-10-12修回日期 2015-10-21)

Construction and Indentification of LeftyA Recombinant Lentiviral Expression Vector

QIUYu'an,CHENWenxue,JINWenjian,etal.JiangxiCancerHospital,Nanchang,330029

Abstract【】ObjectiveTo construct LeftyA gene lentiviral vector system and determine its expression in 293Tcells.MethodsFull-length sequence of LeftyA was amplified by PCR,and was connected with lentiviral vector.Gene sequencing was used to identify that recombinant lentiviral vector was constructed successfully.The plasmids were transfected into 293Tcells.Indentification by fluorescent microscopy confirmed lentiviral transfection and packaging successfully.ResultsLeftyA were subcloned into GV287 as skeleton plasmid for a lentivirus packing system.The virus titer was 2.0×108 TU/ml in the supernatant liquid.The proteins of LeftyA were detected by western blot.ConclusionThe LeftyA gene recombinant lentiviral expression system is constructed successfully.

【Key words】LeftyA；Lentiviral vector

(ThePracticalJournalofCancer,2015,30:1755～1757)

我國是胃癌高發(fā)區(qū)，其發(fā)病率及死亡率均明顯高于世界平均水平[1]。本課題前期研究提示體外培養(yǎng)的胃癌細(xì)胞株LeftyA基因表達(dá)豐度低，LeftyA基因可能對(duì)胃癌的發(fā)生和發(fā)展起著抑制作用。因此，有必要進(jìn)一步研究LeftyA基因?qū)ξ赴┘?xì)胞功能的影響。我們構(gòu)建了LeftyA基因重組慢病毒載體，為進(jìn)一步的功能學(xué)研究打下基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1　主要試劑

限制性內(nèi)切酶(NEB公司)，In-FusionTMPCRCloningKit(clontech公司)，Taq polymerase (SinoBio公司)，dNTP(Takara 公司)，Plasmid抽提Kit(Promega 公司)，DMEM(GIBCO公司)，Lipofectamine2000(Invitrogen公司)。

1.2　主要儀器

PCR儀(Applied Biosysems公司)，穩(wěn)壓DNA電泳儀(BioRad公司)，凝膠成像儀(天能公司)，細(xì)菌搖床(華利達(dá)實(shí)驗(yàn)設(shè)備公司)，高速離心機(jī)(日立公司)，熒光顯微鏡(奧林巴斯)，Plus-20離心超濾裝置(Millipore公司)。

1.3　質(zhì)粒及細(xì)胞株

慢病毒系統(tǒng)包括骨架質(zhì)粒GV287(pUbi-MCS-3FLAG-SV40-EGFP AgeI /AgeI 酶切)，包裝質(zhì)粒pHelper1.0、pHelper2.0和包裝細(xì)胞293T均由上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司提供。

1.4　引物設(shè)計(jì)

使用Primer5軟件設(shè)計(jì)引物，LeftA引物：上游(P1)5'-GAGGATCCCCGGGTACCGGTCGCCACCATGTGGCCCCTGTGGCTCTG-3'，下游(P2)5'-TCCTTGTAGTCCATACCTGGCTGGAGCCTCCTTGGCAC-3'。引物含交換配對(duì)堿基、酶切位點(diǎn)，并含有目的基因5'端部分序列用于PCR釣取目的基因。PCR產(chǎn)物大小：1142 bp。

1.5　LeftyA慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建

1.5.1PCR擴(kuò)增目的基因(LeftyA)片段反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min共30個(gè)循環(huán)，72 ℃ 10 min。PCR結(jié)果見圖1。

1.5.2載體酶切GV287載體原件順序Ubi-MCS-3FLAG-SV40-EGFP，大小10.4 kb，酶切反應(yīng)溫度37 ℃，酶切反應(yīng)時(shí)間2 h。酶切結(jié)果見圖2。

1.5.3重組質(zhì)粒構(gòu)建PCR產(chǎn)物交換入線性化載體，用氯化鈣制備新鮮的大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，將交換后的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌，將已轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到AMP抗性(100 μg/ml)的LB瓊脂培養(yǎng)基上。于37 ℃培養(yǎng)16 h。長出的克隆進(jìn)行后續(xù)PCR鑒定。

1.6　LeftyA慢病毒表達(dá)載體的鑒定

引物 (P3)5'-CTGCTGCTACAGGTGTCGGT-3'， (FLAG-R-2)5'-CCTTATAGTCCTTATCATCGTC-3'一個(gè)位于目的基因中，一個(gè)位于載體上，用于菌落PCR鑒定轉(zhuǎn)化子。陽性轉(zhuǎn)化子PCR產(chǎn)物大?。?74 bp。陽性克隆測序,結(jié)果進(jìn)行同源比對(duì)分析。鑒定結(jié)果見圖3。

轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞:將3種質(zhì)粒載體(重組病毒質(zhì)粒及兩種輔助包裝原件載體質(zhì)粒)分別進(jìn)行高純度無內(nèi)毒素抽提，按Lipofectamine 2000試劑盒使用說明進(jìn)行操作，共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞內(nèi)熒光標(biāo)記基因(GFP)的表達(dá)情況，Westernblot檢測目的基因的表達(dá)。測定病毒滴度。鑒定結(jié)果見圖4、5。

2結(jié)果

2.1　PCR擴(kuò)增目的基因結(jié)果(圖1)

圖1　PCR擴(kuò)增目的基因(LeftyA)片段

2.2　載體酶切結(jié)果(圖2)

1為10kb Marker；2為載體酶切產(chǎn)物，3為未酶切載體。

2.3　陽性轉(zhuǎn)化子電泳結(jié)果(圖3)

1為陰性對(duì)照(ddH2O)；2為陰性對(duì)照(空載自連對(duì)照組)；3為陽性對(duì)照(GAPDH)；4為Marker；5~12為LEFTY 1~8號(hào)轉(zhuǎn)化子。

2.4　重組質(zhì)粒測序結(jié)果

將陽性克隆作為模板擴(kuò)增出目的基因進(jìn)行測序，將測序結(jié)果與目標(biāo)基因序列進(jìn)行同源性分析對(duì)比。結(jié)果顯示重組質(zhì)粒構(gòu)建成功，同源性100%。

2.5　重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞結(jié)果(圖4、5)

取培養(yǎng)生長狀態(tài)良好的293T細(xì)胞，質(zhì)粒轉(zhuǎn)染前一天將細(xì)胞分入24-well培養(yǎng)板培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染24 h后熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞內(nèi)熒光標(biāo)記基因(GFP)的表達(dá)情況，可見細(xì)胞內(nèi)有熒光蛋白表達(dá)，提示質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞成功。轉(zhuǎn)染36 h后收集細(xì)胞進(jìn)行Westernblot檢測?？梢杂^察到43 kD附近處有特征條帶，其大小和目的基因融合蛋白相吻合。

2.6　病毒滴度測定結(jié)果

轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后8 h更換為完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h后，收集富含慢病毒顆粒的細(xì)胞上清液，對(duì)其濃縮后得到高滴度的慢病毒濃縮液，在293T細(xì)胞中采用ELISA法+熒光法測定并標(biāo)定病毒滴度，計(jì)算出包裝的病毒滴度約為2×108TU/ml。

圖4　質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞(×100)

1為陽性對(duì)照(標(biāo)準(zhǔn)品SURVIVIN-3FLAG-GFP 分子大小

3討論

慢病毒載體是以人類免疫缺陷型病毒為基礎(chǔ)發(fā)展起來的基因治療載體，它對(duì)分裂細(xì)胞和非分裂細(xì)胞均具有感染能力，并可以較長期穩(wěn)定的表達(dá)目的基因，便于基因功能的研究。

Lefty蛋白是TGFβ大家族的配體,通過與Nodal以及Nodal的受體結(jié)合而抑制Nodal信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[2]。Nodal是早期胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)的關(guān)鍵信號(hào)分子，參與中胚層和內(nèi)胚層形成、前后體軸的位置確定和左-右體軸特化等關(guān)鍵事件[3]。Nodal還可以抑制人類胚胎干細(xì)胞的分化，維持人類胚胎干細(xì)胞多潛能干性[4]。

有報(bào)道指出，Nodal在多種惡性腫瘤(惡性黑色素瘤、乳腺癌、腦膠質(zhì)瘤等)中能高水平表達(dá)，且表達(dá)水平與腫瘤浸潤和轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)[5-7]。有關(guān)惡性黑色素瘤及乳腺癌的研究提示[8]：在轉(zhuǎn)移性腫瘤細(xì)胞中出現(xiàn)Nodal信號(hào)通路的抑制因子Lefty缺失，從而導(dǎo)致Nodal的過度表達(dá)；胚胎干細(xì)胞微環(huán)境(含Lefty)將明顯下調(diào)Nodal的表達(dá)，并抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。因此Nodal信號(hào)通路在胚胎發(fā)育和腫瘤轉(zhuǎn)移中的差異可能是：胚胎組織可以通過分泌Lefty等蛋白分子對(duì)發(fā)育過程進(jìn)行調(diào)控，而腫瘤中出現(xiàn)Lefty等缺失。這提示腫瘤浸潤和轉(zhuǎn)移的發(fā)生與腫瘤組織缺乏類似胚胎發(fā)育時(shí)精細(xì)有效的調(diào)控機(jī)制密切相關(guān)?；谏鲜龇治黾扒捌谘芯拷Y(jié)果，我們提出假設(shè)：胃癌細(xì)胞中Lefty等Nodal信號(hào)通路的抑制因子缺失，是導(dǎo)致Nodal信號(hào)失控的重要原因。

故我們成功進(jìn)行了LeftyA基因重組慢病毒的構(gòu)建與包裝，為下一步的功能學(xué)實(shí)驗(yàn)打下基礎(chǔ)。

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(編輯：吳小紅)