■王秋菊 王爽云 王秋云 馬鳳學(xué) 沈 丹 楊玉梅 龔 高 唐小彪

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動物科技學(xué)院，黑龍江大慶 163319；2.遼寧省阜新市育才中學(xué)，遼寧阜新 123000）

（參考文獻15篇，刊略，需者可函索）

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗菌株

2014～2015年度，黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動物科技學(xué)院微生態(tài)實驗室已知具有產(chǎn)生谷氨酸功能性的芽孢桿菌，優(yōu)選其中5株芽孢桿菌為試驗菌進行耐受穩(wěn)定性研究。

1.1.2 培養(yǎng)基

營養(yǎng)肉湯LB培養(yǎng)液：根據(jù)說明書，按計量稱取培養(yǎng)基，用蒸餾水加至500 ml。121℃高壓滅菌20 min。

營養(yǎng)瓊脂平板/斜面：根據(jù)說明書，按計量稱取培養(yǎng)基和定量的瓊脂，用蒸餾水加至500 ml。121℃高壓滅菌20 min。

1.1.3 原種液的培養(yǎng)

①復(fù)蘇：將芽孢桿菌斜面的菌全部溶于5 ml LB培養(yǎng)液中，37℃振蕩培養(yǎng)24 h。

②原種液培養(yǎng)：將復(fù)蘇的芽孢桿菌菌液，按4%(v/v)的接種量接至各自新鮮LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩180 r/min培養(yǎng)48 h。備用。

茶葉：茶葉樣品于2017年10月21日采摘于漳州科技職業(yè)學(xué)院相同區(qū)域?qū)嵱?xùn)茶園，采摘量均為1 000 g，具體信息見表1。

1.1.4 活性菌液的制備

將篩選出芽孢桿菌原種液，按4%(v/v)的接種量，將200μl原種液分別接入5 ml新鮮LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)24 h，使其菌液濃度達到108cfu/ml，為第1代培養(yǎng)液；取200μl第1代培養(yǎng)液接入5 ml新鮮LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)24 h，為第2代培養(yǎng)液；以此類推，制備各芽孢桿菌第20代培養(yǎng)液。

1.2 試驗方法

1.2.1 芽孢桿菌耐酸性的測定

將芽孢桿菌1代和20代發(fā)酵液200μl，按4%(v/v)的接種量，接入5 ml pH值分別為1.5、2.5、3.5、4.5、6.0的新鮮LB培養(yǎng)液中，37℃振蕩培養(yǎng)24 h，分別無菌取出培養(yǎng)菌液進行10倍比稀釋，取10-4稀釋梯度的稀釋菌液100μl，于LB平板上，進行涂布，37℃培養(yǎng)24 h，菌落計數(shù)。以pH值為6.0培養(yǎng)液的菌落數(shù)作為對照，計算存活率。每個稀釋梯度作3個重復(fù)，取平均數(shù)。

1.2.2 芽孢桿菌耐鹽性的測定

將芽孢桿菌1代和20代發(fā)酵液200μl，按4%(v/v)的接種量，接入5 ml膽鹽濃度分別為0%、0.1%、0.2%、0.3%的新鮮LB培養(yǎng)液中，37℃振蕩培養(yǎng)24 h，分別無菌取出培養(yǎng)菌液進行10倍比稀釋，取10-4稀釋梯度的稀釋菌液100μl，于LB平板上，進行涂布，37℃培養(yǎng)24 h，菌落計數(shù)。以0%膽鹽的培養(yǎng)液的菌落數(shù)作為對照，計算存活率。每個稀釋梯度作3個重復(fù)，取平均數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 芽孢桿菌耐酸性的測定

經(jīng)耐酸性試驗，5株第1代芽孢桿菌對pH值不同的生長環(huán)境表現(xiàn)出不同程度的耐受性。其中，J2在pH=4.5的環(huán)境下存活率高達131.01%，在其余pH值環(huán)境下存活率則在39%～47%之間；C34在pH=4.5的環(huán)境下存活率為62.50%，I3在pH=4.5的環(huán)境下存活率為63.01%，在其余pH值環(huán)境下存活率較低；有兩株菌存活率均較低，這兩株菌是J3和C5，其存活率在5%～28%之間。結(jié)果見表1。

表1 第1代芽孢桿菌耐酸性試驗結(jié)果

經(jīng)耐酸性檢驗，第20代芽孢桿菌對不同pH值生長環(huán)境表現(xiàn)出不同程度的耐受性。各株菌在pH=4.5環(huán)境下存活率均較高，分別為149.47%、103.33%、131.93%、122.63%和219.56%；其中J2在pH=1.5和pH=2.5的環(huán)境下存活率較高，分別為54.73%和54.34%，在pH=3.5和pH=4.5的環(huán)境下，與其他菌株相比存活率居中，略高于其余菌株。結(jié)果見表2。

表2 第20代芽孢桿菌耐酸性試驗結(jié)果

2.2 芽孢桿菌耐膽鹽性的測定

第1代芽孢桿菌在不同膽鹽濃度的耐受結(jié)果見表3。在膽鹽濃度為0.1%時各株菌的存活率變化率很大，從最低45.26%最高的112.37%之間。當(dāng)膽鹽濃度為0.2%時，基本各菌株的存活率均有所下降，平均為73.93%；在膽鹽濃度0.3%時，存活率明顯下降，平均為52.33%。其中J2的存活率均達到了90%以上，在膽鹽濃度0.3%時存活率高達91.51%，最為穩(wěn)定。

表3 第1代芽孢桿菌耐膽鹽試驗結(jié)果

不同濃度膽鹽中第20代芽孢桿菌各菌株耐受結(jié)果見表4。5株菌株在不同濃度膽鹽中也有不同程度的存活率，其中J2菌株在各濃度條件下都表現(xiàn)出較高的存活率，分別為98.73%、94.52%、92.25%，較為穩(wěn)定，其他各菌株的耐受能力隨膽鹽濃度的升高而降低。

表4 第20代芽孢桿菌耐膽鹽試驗結(jié)果

3 討論

隨著畜牧業(yè)的發(fā)展和抗生素的廣泛應(yīng)用，抗生素的缺點逐漸暴露出來，如導(dǎo)致動物體內(nèi)菌群失調(diào)、產(chǎn)生抗藥性和畜產(chǎn)品適口性差等，尤其是食物鏈的藥物殘留問題引起了普遍關(guān)注。根據(jù)2012年美國《科學(xué)》雜志報道，中國年產(chǎn)抗生素達21萬噸，2013年德國科學(xué)家發(fā)表了一份共同聲明，其中提到限制抗生素在獸醫(yī)獸藥中的使用，在這種背景下尋找安全綠色的抗生素替代品成為當(dāng)前研究的熱點。而益生菌是目前被廣泛運用于飼料工業(yè)中用來替代抗生素的一類物品。芽孢桿菌作為微生態(tài)制劑的一種重要來源細(xì)菌，在維護動物腸道健康、促進微生態(tài)平衡方面起著重要的作用，相對于其他益生菌而言，芽孢桿菌使用上具有更大的應(yīng)用優(yōu)勢，成為目前研究的熱點。芽孢桿菌的芽孢能夠在體內(nèi)迅速萌發(fā)增殖，從而起到改善腸道菌群、促進免疫、抗菌防病及相關(guān)的代謝酶活性等生理作用。而芽孢桿菌能在動物體內(nèi)充分發(fā)揮益生作用的前提是可以有活性的、大量的通過家畜胃腸道并在動物體內(nèi)大量增殖，而在家畜胃腸道中的胃酸和膽鹽構(gòu)成了一道天然的屏障，只有耐受穩(wěn)定性高的芽孢桿菌才能承受這樣的環(huán)境，才能發(fā)揮作用。所以，本實驗就是測定所分離的芽孢桿菌是否具有較高的耐受穩(wěn)定性。

飼料被動物采食后首先進入的是胃中，這是芽孢桿菌進入動物體內(nèi)的第一道屏障。動物的胃中存在大量的酸性消化液，用來消化攝入的食物，在進食后胃液pH值一般為2.0～3.0。胃中的酸會水解細(xì)菌從而對其產(chǎn)生破壞作用，使其無法發(fā)揮作用或者生存。而芽孢桿菌必須通過胃中的高酸性胃液才能到達腸道發(fā)揮益生作用，因此必須具有良好的耐酸能力。本實驗研究了5株芽孢桿菌在pH值為1.5～4.5的酸性溶液中的耐受性。

小腸是益生菌起作用的主要場所，在益生菌進入小腸后，動物腸道中含有一定濃度的膽鹽，其含量是不斷變化的，小腸內(nèi)的膽鹽的高滲透壓環(huán)境不利于其存活，這是芽孢桿菌在動物胃腸道存活和增殖的另一屏障，動物腸道內(nèi)的膽鹽濃度在一般情況下為0.03%～0.30%，十二指腸中的膽汁酸鹽對芽孢桿菌具有抑作用，芽孢桿菌要在腸道中存活、增殖就必須耐受0.3%膽鹽環(huán)境，菌體只有具備較高的耐膽鹽性，才能保證足夠的活菌數(shù)，繼而發(fā)揮其益生作用。本實驗研究了5株芽孢桿菌在濃度為0.10%～0.30%的膽鹽中的耐受性。

動物微生態(tài)制劑因其安全無毒副作用、效果好、無藥殘、很少產(chǎn)生耐藥性、不污染環(huán)境而被廣泛運用，而以芽孢桿菌為出發(fā)菌種的微生態(tài)制劑添加在動物飼料中飼喂后，能拮抗病原微生物，維持腸道的菌群平衡，增強機體免疫力，提高動物生產(chǎn)性能。芽孢桿菌微生態(tài)制劑在許多家畜飼料中均有應(yīng)用，王海周在芽孢桿菌對蛋雞益生作用研究中提出，芽孢桿菌能在一定程度上促進蛋雞的生長，提高飼料轉(zhuǎn)化率。李麗紅的研究結(jié)果表明，芽孢桿菌能改善蛋雞的生產(chǎn)性能，提高經(jīng)濟效益。利明在研究結(jié)果中表明，芽孢桿菌能提高肉仔雞飼料能量表觀代謝率及蛋白表觀消化率，在一定程度上提高飼料利用率，降低排放，減少環(huán)境污染。而芽孢桿菌是否能產(chǎn)生這些有益作用的前提是其耐受穩(wěn)定性的高低，所以，具有高生存力的芽孢桿菌才能更好地發(fā)揮其作用。

4 結(jié)論

經(jīng)耐酸性試驗，芽孢桿菌對不同pH值和膽鹽濃度生產(chǎn)環(huán)境表現(xiàn)出不同程度的耐受性。其中，芽孢桿菌J2表現(xiàn)出最好的耐受性。第1代芽孢桿菌J2在pH=1.5的環(huán)境下存活率可達46.43%，第20代芽孢桿菌J2在pH=1.5的環(huán)境下存活率較高，為54.73%。在膽鹽濃度0.3%時，第1代芽孢桿菌J2存活率高達91.51%，最為穩(wěn)定。第20代芽孢桿菌在膽鹽0.3%濃度下，存活率高達92.25%，較為穩(wěn)定。故J2可作為芽孢桿菌制劑后備菌深入研究。