■王佰魁 姚江濤 卞國(guó)順 毛予龍 俞國(guó)喬 李衛(wèi)芬

（1.浙江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院飼料科學(xué)研究所教育部動(dòng)物分子營(yíng)養(yǎng)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江杭州 310029；2.上海新農(nóng)飼料股份有限公司，上海 201613；3.浙江省畜牧技術(shù)推廣總站，浙江杭州 310020）

獸用抗生素的應(yīng)用推動(dòng)了畜牧業(yè)的迅速發(fā)展，正確使用抗生素不僅能夠促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)，提高動(dòng)物生產(chǎn)性能，同時(shí)作為藥物在畜禽疾病預(yù)防與治療、改善動(dòng)物畜產(chǎn)品品質(zhì)等方面發(fā)揮著積極的作用。但是，隨著抗生素的廣泛濫用，產(chǎn)生了諸多副作用：如細(xì)菌或病毒耐藥性、畜禽肉制品中藥物殘留、腸道菌群失衡引起的二次感染等[1]。因此，尋找安全高效、環(huán)境友好型生物飼料添加劑以替代抗生素已成為人們研究熱點(diǎn)。研究表明，枯草芽孢桿菌能夠分泌多種酶和抗菌物質(zhì)，在調(diào)節(jié)腸道免疫功能、改善腸道微生物結(jié)構(gòu)、促進(jìn)腸道營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收、抑制腸道致病菌生長(zhǎng)和提高動(dòng)物生產(chǎn)性能等方面具有明顯的積極作用，在畜禽養(yǎng)殖中是一種理想的生物飼料安全添加劑[2-3]。張紅兵等[4]研究發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌可有效替代抗生素改善肉雞生長(zhǎng)性能。本實(shí)驗(yàn)室前期研究表明，日糧中添加枯草芽孢桿菌B10制劑對(duì)肉雞的生長(zhǎng)性能的影響與抗生素相近，提示芽孢桿菌可作為抗生素替代品用于肉雞生產(chǎn)，本論文進(jìn)一步研究了其對(duì)嶺南黃肉雞免疫和抗氧化功能的影響，旨在初步探明枯草芽孢桿菌B10替代抗生素應(yīng)用于肉雞養(yǎng)殖的機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

枯草芽孢桿菌B10制劑：由浙江大學(xué)飼料科學(xué)研究所微生物與基因工程實(shí)驗(yàn)室制備，活菌數(shù)為1.0×108CFU/g。

抗生素：林可霉素購(gòu)自天津艾森生物工程有限公司。

試驗(yàn)動(dòng)物及飼糧：嶺南黃肉雞購(gòu)自嘉興星健禽業(yè)養(yǎng)殖有限公司，飼養(yǎng)試驗(yàn)于浙江一星實(shí)業(yè)股份有限公司養(yǎng)殖試驗(yàn)雞場(chǎng)進(jìn)行。試驗(yàn)基礎(chǔ)飼糧組成與營(yíng)養(yǎng)水平參照NRC（1994）[5]中營(yíng)養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)，由浙江一星實(shí)業(yè)股份有限公司生產(chǎn)加工成粉狀全價(jià)飼料，原料組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1，未添加任何抗生素。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平（風(fēng)干基礎(chǔ)）

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)選取18日齡健康且體重?zé)o顯著差異（P＞0.05）的健康嶺南黃肉雞300羽，隨機(jī)分為2個(gè)試驗(yàn)組，每個(gè)試驗(yàn)組5個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)30羽。在基礎(chǔ)飼糧的基礎(chǔ)上，對(duì)照組添加林可霉素4.4 mg/kg，B10組添加枯草芽孢桿菌B10制劑1 000 mg/kg，試驗(yàn)期為40 d，飼喂至57日齡結(jié)束。

1.3 飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)開(kāi)始前一周按常規(guī)消毒程序?qū)﹄u舍進(jìn)行消毒。試驗(yàn)雞群采用地面墊料平養(yǎng)，自然光照輔以人工照明，采取自由采食和飲水方式。按常規(guī)免疫程序?qū)υ囼?yàn)雞群進(jìn)行新城疫及法氏囊疫苗免疫接種。

1.4 測(cè)定指標(biāo)與方法

1.4.1 樣品采集與處理

飼養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)束后，禁食（不禁水）12 h后從每重復(fù)中隨機(jī)抽取3只體重相近的雞稱重。血清樣品采集：采用翅靜脈采血，用血液促凝試管采血后于37℃水浴中靜置，待析出血清后于4℃、3 000 r/min離心15 min，取其上清液分裝于1.5 ml Eppendorf管中，-20℃低溫冰箱中保存，以備血清生化指標(biāo)分析檢測(cè)用。肝臟組織制備：稱取一定質(zhì)量肝臟組織，加9倍質(zhì)量的生理鹽水做10倍稀釋，用勻漿器冰上勻漿，4℃、2 000 r/min離心15 min，取上清備用?？漳c粘膜制備：將空腸內(nèi)容物擠干凈，縱向剖開(kāi)后刮取內(nèi)層黏膜，稱取0.5 g黏膜樣品加9倍質(zhì)量的生理鹽水做10倍稀釋，用勻漿器冰上勻漿，4℃、2 000 r/min離心15 min，取上清備用。

1.4.2 肝臟和空腸黏膜免疫相關(guān)細(xì)胞因子測(cè)定

肝臟和空腸粘膜細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-6（IL-6）、白細(xì)胞介素-17（IL-17）、白細(xì)胞介素-12（IL-12）、白細(xì)胞介素-10（IL-10）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、干擾素-γ（IFN-γ）、干擾素-α（IFN-α）、分泌型免疫球蛋白A（sIgA）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TGF-β）、β-防御素（β-DF）水平均采用美國(guó)R＆D公司生產(chǎn)的酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。

1.4.3 肝臟抗氧化指標(biāo)

肝臟超氧化物歧化酶（SOD）活性、過(guò)氧化氫酶（CAT）活性、總抗氧化能力（T-AOC）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）活性、谷胱甘肽（GSH）及丙二醛（MDA）水平均采用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒進(jìn)行測(cè)定。

1.4.4 血清生化指標(biāo)

血清中總蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、乳酸脫氫酶（LDH）、堿性磷酸酶（AKP）、尿酸（UA）含量測(cè)定所用試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所，球蛋白（GLB）試劑盒購(gòu)于寧波慈城生化試劑廠。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件中獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析處理，試驗(yàn)數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，P＜0.05表示為差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 枯草芽孢桿菌B10對(duì)肉雞腸黏膜免疫功能的影響

表2 枯草芽孢桿菌B10對(duì)肉雞空腸黏膜免疫功能的影響

由表2可知，B10組肉雞空腸粘膜IL-6、IL-12、IFN-α、IL-10、TGF-β及sIgA水平顯著高于抗生素對(duì)照組，分別提高了163.39%、59.72%、121.46%、267.52%、211.74%及60.52%（P＜0.05）；兩組間TNF-α、IFN-γ、IL-17、β-D水平差異不顯著（P＞0.05）。

2.2 枯草芽孢桿菌B10對(duì)肉雞肝臟抗氧化功能的影響

表3 枯草芽孢桿菌B10對(duì)肉雞肝臟抗氧化功能的影響

由表3可知，與抗生素對(duì)照組相比，B10組肉雞肝臟SOD酶活性顯著降低了19.49%（P＜0.05），而T-AOC、GSH-Px、CAT活性及MDA水平雖有所降低，但差異卻均不顯著（P＞0.05），兩組間GSH水平無(wú)顯著影響（P＞0.05）。

2.3 枯草芽孢桿菌B10對(duì)肉雞肝臟細(xì)胞因子含量的影響(見(jiàn)表4)

表4 枯草芽孢桿菌B10對(duì)肉雞肝臟免疫相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)的影響

由表4可知，B10組肉雞肝臟IL-6、IL-17、TNF-α、TGF-β、IFN-α及IFN-γ水平與抗生素對(duì)照組相比差異不顯著（P＞0.05）。

2.4 枯草芽孢桿菌B10對(duì)肉雞血清生化指標(biāo)的影響

表5 枯草芽孢桿菌B10對(duì)肉雞血清生化指標(biāo)的影響

由表5可知，與抗生素組相比，B10組肉雞血清中AKP和LDH活性分別顯著提高了43.26%、21.04%（P＜0.05），而UA水平顯著降低了22.87%（P＜0.05）；兩組間TP、ALB和GLB含量有所提高，但差異均不顯著（P＞0.05）。

3 討論

3.1 枯草芽孢桿菌B10對(duì)黃肉雞免疫功能的影響

細(xì)胞因子是由免疫細(xì)胞和非免疫細(xì)胞分泌的一類具有免疫調(diào)節(jié)和效應(yīng)功能的小分子蛋白質(zhì)，在調(diào)節(jié)固有免疫和適應(yīng)性免疫過(guò)程中發(fā)揮著極其重要的作用。IL-17通過(guò)刺激免疫細(xì)胞或非免疫細(xì)胞誘導(dǎo)其分泌TNF、IL-6、β防御素等炎癥因子，進(jìn)而募集并激活DC、T細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等炎癥細(xì)胞，從而增強(qiáng)機(jī)體抗病原菌感染能力[6]；IL-6、IL-10等可誘導(dǎo)、促進(jìn)IgA的分泌；IL-12通過(guò)激活NK細(xì)胞和T細(xì)胞誘導(dǎo)其分泌大量的IFN-γ，IFN與TNF相互作用可增強(qiáng)TNF抗腫瘤效果[7]。分泌型免疫球蛋白（sIgA）作為腸粘膜表面的主要免疫球蛋白，在抑制病原微生物繁殖、中和毒素、保護(hù)腸道黏膜完整性等方面具有重要作用。據(jù)報(bào)道，若腸道內(nèi)sIgA水平顯著下降時(shí)將導(dǎo)致腸道菌群失衡，甚至致病菌易位而引發(fā)機(jī)體感染[8]。禽類β-防御素在抵御外來(lái)病原微生物及殺傷入侵病原菌中發(fā)揮重要作用。李衛(wèi)芬等[7]研究報(bào)道，枯草芽孢桿菌制劑能夠顯著提高肉雞盲腸和回腸黏膜中IL-2、IL-4、IL-10、IL-12、TNF-α和IFN-γ水平及回腸黏膜sIgA含量。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與抗生素對(duì)照組相比，飼糧中添加枯草芽孢桿菌B10顯著提高了肉雞空腸粘膜免疫相關(guān)細(xì)胞因子IL-6、IL-12、IFN-α、IL-10、TGF-β水平及sIgA含量，而對(duì)肝臟免疫相關(guān)細(xì)胞因子水平無(wú)顯著影響。說(shuō)明與抗生素對(duì)照組相比，枯草芽孢桿菌B10主要是通過(guò)增強(qiáng)肉雞腸道黏膜免疫功能來(lái)增強(qiáng)肉雞抗感染能力。

3.2 枯草芽孢桿菌B10對(duì)黃肉雞肝臟抗氧化功能的影響

T-AOC變化反映出機(jī)體的抗氧化水平、MAD含量變化可間接反映細(xì)胞氧化損傷程度，GSH-Px、GSH及CAT在清除自由基、抗氧化等方面發(fā)揮著重要作用。機(jī)體內(nèi)SOD是生物體內(nèi)重要的抗氧化酶，通過(guò)一系列催化反應(yīng)將有害的超氧自由基轉(zhuǎn)化為過(guò)氧化氫，產(chǎn)生的過(guò)氧化氫經(jīng)體內(nèi)過(guò)CAT催化降解為水。余東游等[9]研究報(bào)道，枯草芽孢桿菌可顯著提高肉雞肝臟T-AOC、GSH-Px、SOD及CAT活性，顯著降低MDA水平。本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，與抗生素對(duì)照組相比，枯草芽孢桿菌B10降低了肉雞肝臟SOD活性顯著，而對(duì)TAOC、GSH-Px活性、GSH及MDA含量無(wú)顯著影響，這說(shuō)明枯草芽孢桿菌B10可能會(huì)顯著改善肉雞的氧化應(yīng)激狀態(tài)，所以所需的抗氧化酶活性相對(duì)較低。

3.3 枯草芽孢桿菌B10對(duì)黃肉雞血清生化指標(biāo)的影響

堿性磷酸酶（AKP）主要來(lái)源于肝臟和骨骼，與腸道脂質(zhì)轉(zhuǎn)移及骨質(zhì)鈣化有關(guān)，是鈣、磷代謝的重要指標(biāo)。此外，AKP促進(jìn)腸道營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收的同時(shí)，還能抵御致病菌對(duì)腸道黏膜的損傷[10]。乳酸脫氫酶（LDH）是糖酵解途徑中重要的標(biāo)志酶，存在于機(jī)體各組織器官中，在無(wú)氧酵解過(guò)程中催化丙酮酸轉(zhuǎn)化為乳酸，產(chǎn)生ATP提供能量[11]。本研究發(fā)現(xiàn)，與抗生素對(duì)照組相比，枯草芽孢桿菌B10可顯著提高肉雞血清AKP和LDH活性，說(shuō)明飼糧中添加枯草芽孢桿菌B10有利于改善肝臟物質(zhì)和能量代謝，促進(jìn)機(jī)體鈣、磷吸收，這同前人研究報(bào)道相一致[12]。

血清中總蛋白（TP）、白蛋白（ALB）及球蛋白（GLB）水平是反映機(jī)體營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)代謝的重要指標(biāo)。血清中白蛋白是機(jī)體蛋白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)需求的主要來(lái)源，其濃度變化是反映動(dòng)物機(jī)體蛋白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)攝入和代謝利用的主要指標(biāo)之一[4]。血清中尿酸（UA）是禽類蛋白質(zhì)代謝的主要產(chǎn)物，其含量變化可間接反映禽類對(duì)蛋白質(zhì)、氨基酸等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的利用情況，其含量越低說(shuō)明含氮營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的利用率越高，體內(nèi)蛋白質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的合成代謝越強(qiáng)[13]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌B10可顯著降低血清UA含量，對(duì)TP、ALB和GLB含量無(wú)顯著影響，說(shuō)明飼糧中添加枯草芽孢桿菌B10在一定程度上有利于促進(jìn)肉雞機(jī)體對(duì)蛋白質(zhì)及氨基酸等含氮營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收和利用。

4 結(jié)論

飼糧中添加枯草芽孢桿菌B10可有效替代飼用抗生素，顯著增強(qiáng)肉雞腸黏膜免疫功能、改善肉雞抗氧化應(yīng)激狀態(tài)、促進(jìn)肉雞機(jī)體對(duì)含氮營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收和利用。