■李 杰 張劉運(yùn) 王立群

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，黑龍江哈爾濱 150030；2.黑龍江省華森畜牧科技有限責(zé)任公司，黑龍江哈爾濱 150030）

豆粕是飼料工業(yè)應(yīng)用量最大的蛋白質(zhì)飼料原料。但因其含有多種抗?fàn)I養(yǎng)因子（胰蛋白酶抑制因子、脲酶和植酸酶等）而降低了動(dòng)物對其營養(yǎng)物質(zhì)的消化、吸收和利用。豆粕經(jīng)過微生物發(fā)酵后可有效去除其中的多種抗?fàn)I養(yǎng)因子，將大分子蛋白物質(zhì)分解成動(dòng)物容易消化、吸收和利用的多肽和小肽，使消化能力弱的幼小動(dòng)物對植物蛋白質(zhì)的消化利用率得到大幅度提高。多肽是經(jīng)過蛋白酶水解處理后得到的由3～10個(gè)氨基酸組成的小分子肽，其分子量一般為1 000 Da。因多肽具有溶解度好、黏度低、吸收好和促進(jìn)微生物發(fā)酵等特點(diǎn)，而成為發(fā)酵豆粕飼料的重要指標(biāo)。此外，發(fā)酵豆粕含有多種益生菌及多種發(fā)酵有益代謝產(chǎn)物和生物活性物質(zhì)，具有調(diào)節(jié)動(dòng)物生理功能和增強(qiáng)動(dòng)物免疫力的作用。發(fā)酵豆粕是具有營養(yǎng)、調(diào)理動(dòng)物生理和免疫力雙重作用的優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)飼料。豆粕發(fā)酵過程是一個(gè)抗?fàn)I養(yǎng)因子消除、大分子蛋白質(zhì)降解成小分子肽、微生物源及代謝產(chǎn)物產(chǎn)生等一系列復(fù)雜的益生菌發(fā)酵過程，其產(chǎn)品是具有無（低）抗原、易吸收、生物安全，富含營養(yǎng)的優(yōu)質(zhì)發(fā)酵蛋白質(zhì)飼料。

一些試驗(yàn)表明，在規(guī)?；a(chǎn)中，37～45℃條件下，微生物生長旺盛，蛋白酶活性較高，當(dāng)溫度≥50℃，雖然菌種仍有生長，但蛋白酶活性較低，豆粕發(fā)酵速度較慢。在南方很容易達(dá)到以上豆粕發(fā)酵的溫度，而在北方年平均溫度較低，要達(dá)到這樣的發(fā)酵溫度，需要提供較多的熱能，這就導(dǎo)致豆粕發(fā)酵成本大幅度提高，發(fā)酵豆粕價(jià)格較高，不利于發(fā)酵豆粕飼料的推廣和應(yīng)用。北方是我國大豆的主要產(chǎn)區(qū)，非轉(zhuǎn)基因大豆資源豐富，所產(chǎn)豆粕質(zhì)優(yōu)價(jià)廉，利用地產(chǎn)大豆生產(chǎn)發(fā)酵豆粕具有資源優(yōu)勢。因此，研究北方地區(qū)溫度條件下豆粕發(fā)酵的技術(shù)和生產(chǎn)工藝對北方豆粕資源的利用和提高附加值具有重要意義和促進(jìn)作用。

1 豆粕發(fā)酵工藝參數(shù)

我國豆粕發(fā)酵生產(chǎn)的起步較晚，目前對豆粕發(fā)酵工藝參數(shù)缺乏系統(tǒng)的研究,而這些參數(shù)對于發(fā)酵豆粕質(zhì)量具有重要的影響作用。豆粕發(fā)酵受諸多因素的影響，比如水分、養(yǎng)分、pH值、溫度、發(fā)酵方式等。莫重文等(2007)試驗(yàn)結(jié)果表明，豆粕發(fā)酵菌種接種量為6%，發(fā)酵溫度為28℃，發(fā)酵時(shí)間為72 h，發(fā)酵豆粕中粗蛋白質(zhì)含量可達(dá)49.10%，比原料提高12.1%。戚薇等（2008）利用納豆芽孢桿菌和凝結(jié)芽孢桿菌發(fā)酵豆粕，結(jié)果表明，兩種菌（兩菌比例為1∶1）接種時(shí)間隔開，接種量為10%，初始含水量為40%，初始pH值自然，發(fā)酵溫度37℃，發(fā)酵時(shí)間縮短為48 h。發(fā)酵豆粕的蛋白質(zhì)水解度達(dá)到20.14%。王金斌等（2009）采用枯草芽孢桿菌和熱帶假絲酵母（接種比例為1∶1），發(fā)酵溫度為38℃，基質(zhì)初始含水量為52%，發(fā)酵時(shí)間為48 h。發(fā)酵豆粕粗蛋白質(zhì)含量由31.75%升至49.27%。馬文強(qiáng)等（2008）的試驗(yàn)結(jié)果表明，發(fā)酵豆粕中高分子量蛋白質(zhì)含量下降，低分子蛋白質(zhì)含量提高，粗蛋白質(zhì)、粗脂肪、磷和氨基酸的含量顯著高于發(fā)酵前，胰蛋白酶抑制因子等抗?fàn)I養(yǎng)因子含量顯著降低。吳勝華等（2008）采用2種芽孢桿菌、乳酸菌及酵母菌進(jìn)行豆粕固態(tài)發(fā)酵，料水比為1∶1.2，通氣量為60 g/ml，接種量為4%，發(fā)酵溫度為40℃。發(fā)酵豆粕中的小肽含量可達(dá)12.01%。以上研究結(jié)果表明，發(fā)酵溫度為28～38℃，接種量為4%～7.5%，料水比為1∶1.2，發(fā)酵時(shí)間為48～72 h，起始溫度越高發(fā)酵時(shí)間越短。

2 北方地區(qū)豆粕發(fā)酵技術(shù)及工藝參數(shù)

工廠化生產(chǎn)發(fā)酵豆粕通常采用堆式發(fā)酵，成本低，易于操作，但缺點(diǎn)是堆外側(cè)的豆粕與微生物接觸較少，發(fā)酵不完全。固態(tài)堆式發(fā)酵時(shí)豆粕堆的高度可達(dá)到1 m左右，發(fā)酵物料堆中因可溶性碳水化合物分解產(chǎn)生熱量，使發(fā)酵堆內(nèi)部溫度可升高達(dá)到50～60℃。雖然豆粕發(fā)酵過程能夠產(chǎn)生熱量，但如果環(huán)境溫度過低，豆粕堆式發(fā)酵的初期微生物活性較低，繁殖速度較慢，豆粕發(fā)酵升溫過程很緩慢，發(fā)酵時(shí)間較長，有時(shí)會(huì)導(dǎo)致異常發(fā)酵。在北方環(huán)境溫度條件下，尤其是在冬季豆粕發(fā)酵車間的溫度一般維持在10～16℃之間，如果不采取任何措施，在此溫度條件下，豆粕發(fā)酵的菌種活力較低，豆粕的發(fā)酵速度緩慢。楊玉芬等研究不同溫度對豆粕發(fā)酵的影響，結(jié)果表明，35℃條件下發(fā)酵豆粕的粗蛋白含量高于25℃。由此看出，堆式豆粕發(fā)酵的決定因素是起始溫度。起始溫度適宜，豆粕發(fā)酵溫度升高速度快，微生物繁殖快，發(fā)酵速度就快。

2.1 豆粕發(fā)酵菌種的篩選和培育

北方發(fā)酵豆粕的生產(chǎn)和研究都剛剛起步，在發(fā)酵菌種的培育和發(fā)酵工藝參數(shù)方面的研究報(bào)道較少。國內(nèi)豆粕發(fā)酵始于南方，發(fā)酵所用的菌種也來源于南方，發(fā)酵豆粕菌種對北方氣溫條件的適應(yīng)性較差，有必要篩選和培育適應(yīng)于北方氣溫條件的豆粕發(fā)酵菌種，提高發(fā)酵豆粕的生產(chǎn)效率。

東北農(nóng)業(yè)大學(xué)微生物教研室近年來一直從事豆粕發(fā)酵菌種的低溫馴化和菌種的培育研究。他們在市售的產(chǎn)品中分離和篩選了產(chǎn)酶高的豆粕發(fā)酵菌種進(jìn)行低溫馴化。并根據(jù)蛋白酶的高低篩選出5株芽孢桿菌優(yōu)良菌株進(jìn)行紫外誘變，以菌株蛋白酶活力、酸溶蛋白含量和游離氨基酸含量，以及胰蛋白酶抑制因子和植酸含量為指標(biāo)進(jìn)行復(fù)選，篩選出優(yōu)良菌株2枚——JY14和JY15。用這兩株菌進(jìn)行豆粕發(fā)酵試驗(yàn)，蛋白酶活性分別提高122.14%和170.69%，酸溶蛋白分別提高108.85%和151.95%，游離氨基酸含量分提高49.45%和50.07%，胰蛋白酶抑制因子分別降低38.18%和73.88%，植酸含量分別降低50.40%和80.29%。其中JY15無論是蛋白酶活性、酸溶蛋白含量還是抗?fàn)I養(yǎng)因子降低的程度都優(yōu)于JY14。

2.2 略低溫度菌種擴(kuò)繁培養(yǎng)基優(yōu)化

一般芽孢桿菌的培養(yǎng)都在37℃度條件下進(jìn)行，陳雷采用上述低溫馴化的芽孢桿菌菌株放置到30℃條件下進(jìn)行培養(yǎng)與擴(kuò)繁，與37℃條件下培養(yǎng)的菌種進(jìn)行比較，結(jié)果表明，在30℃培養(yǎng)的活菌數(shù)量和酶活性與37℃沒有顯著差異，表明以上經(jīng)過低溫馴化的菌種在略低溫度條件下具有較高的活力。同時(shí)采用以玉米、豆粕、小麥麩常規(guī)飼料為主的原料進(jìn)行菌種擴(kuò)繁，以降低菌種培養(yǎng)的成本。結(jié)果表明，在30℃條件下進(jìn)行菌種液體發(fā)酵，不同的培養(yǎng)基配方培養(yǎng)的活菌數(shù)量不同，其中由1.5%玉米、0.5%小麥麩、1.0%豆粕及少量礦物質(zhì)組成的配方其活菌數(shù)量可達(dá)到2.08×1010cfu/ml，與37℃對照組相比差異不顯著；蛋白酶和淀粉酶活性分別略高于37℃對照組。由此看出，經(jīng)過低溫馴化的芽孢桿菌在比正常溫度低7℃的條件下進(jìn)行液體發(fā)酵，其活菌數(shù)量和產(chǎn)酶活性均可達(dá)到與37℃條件下相同的水平。

2.3 北方溫度條件下豆粕發(fā)酵升溫技術(shù)

劉天蒙等在實(shí)驗(yàn)室條件下進(jìn)行溫度對豆粕發(fā)酵影響的試驗(yàn)，結(jié)果表明，不同的溫度條件下微生物所產(chǎn)蛋白酶的活性不同，在28℃條件下主要為堿性和中性蛋白酶，酶活力較低，酶活高峰出現(xiàn)在78 h，以后酶活力明顯下降；在30℃條件下，所產(chǎn)酶的活性明顯高于28℃，酶活高峰出現(xiàn)在66 h，32℃條件酶活性高峰出現(xiàn)在56 h，但酶活性較低，他們認(rèn)為30℃是米曲霉發(fā)酵豆粕的最佳發(fā)酵溫度。

在北方豆粕發(fā)酵車間溫度能夠超過20℃的月份為6～9月，其他月份（即使是冬季供暖條件下）車間溫度也就在10～20℃之間。解決低溫豆粕發(fā)酵困難的方法有兩種：一是在豆粕發(fā)酵時(shí)加熱水提高物料堆的溫度，但也僅在發(fā)酵堆內(nèi)部保持這個(gè)溫度，而在堆外側(cè)的豆粕很快變涼，與車間溫度相同；二是在豆粕發(fā)酵時(shí)添加升溫物質(zhì)，提高豆粕發(fā)酵溫度升高的速度，但堆外側(cè)豆粕溫度很快降低。解決發(fā)酵堆外側(cè)豆粕溫度降低的方法是在堆外面覆蓋透氣、保溫的覆蓋物。

在車間溫度15℃的條件下，陳雷等在發(fā)酵豆粕時(shí)加熱水使發(fā)酵豆粕的溫度達(dá)到24℃左右，并在豆粕發(fā)酵時(shí)不添加任何物質(zhì)（試驗(yàn)1組）、添加0.2%糖化酶（試驗(yàn)2組）和添加0.2%糖化酶+0.1%酵母菌（試驗(yàn)3組），與起始溫度30℃（對照組）進(jìn)行比較試驗(yàn)。結(jié)果表明，起始溫度對豆粕發(fā)酵過程的溫度有較大影響，30℃對照組溫度升高速度較快，發(fā)酵12 h達(dá)到38℃，而24℃發(fā)酵組僅達(dá)到28℃左右；發(fā)酵24 h對照組溫度達(dá)到51.4℃，開始翻堆，而3個(gè)試驗(yàn)組溫度僅達(dá)到27～32℃，其中試驗(yàn)3組的溫度高于試驗(yàn)2組，而試驗(yàn)2組高于試驗(yàn)1組。3個(gè)試驗(yàn)組在發(fā)酵的40 h溫度達(dá)到50℃，進(jìn)行翻堆，翻堆后的溫度一直維持在40～50℃之間。發(fā)酵時(shí)間為64 h。3個(gè)試驗(yàn)組豆粕發(fā)酵成熟時(shí)間比30℃晚12～16 h。衛(wèi)琳等進(jìn)行恒溫和變溫豆粕發(fā)酵試驗(yàn)，將溫度恒定在30℃，固態(tài)發(fā)酵豆粕則需要96 h，將溫度由30℃升高為45℃，發(fā)酵時(shí)間可縮短為72 h。朱曦等（2007）的試驗(yàn)結(jié)果表明，在平均溫度25℃條件下，48 h翻料1次，翻料溫度為60℃左右，發(fā)酵時(shí)間為72 h。由此可見，堆式發(fā)酵豆粕的產(chǎn)熱可提高微生物繁殖速度，縮短豆粕發(fā)酵時(shí)間。

卓林霞等用枯草芽孢桿菌在pH值6.6、接種量為3.8%、料水比為1∶1條件下發(fā)酵豆粕，蛋白酶活力比發(fā)酵前提高了2.55倍。陳雷等的試驗(yàn)結(jié)果表明，在發(fā)酵結(jié)束時(shí)，30℃對照組小肽含量從3.81%提高到9.3%，而試驗(yàn)1、2、3組分別達(dá)到8.72%、9.03%和9.14%，試驗(yàn)2組和試驗(yàn)3組小肽含量接近對照組。發(fā)酵后對照組脲酶活性和胰蛋白酶抑制因子比發(fā)酵前降低55.69%和32.46%，而試驗(yàn)1、2和3組脲酶活性分別降低61.57%、51.37%和77.25%，胰蛋白酶抑制因子比發(fā)酵前分別降低56.24%、47.95%和51.17%。3個(gè)試驗(yàn)組抗?fàn)I養(yǎng)因子含量降低的幅度均高于對照組，其中試驗(yàn)3組降低的幅度最大。由此看出，在24℃溫度條件下豆粕發(fā)酵時(shí)添加糖化酶+酵母菌可以提高豆粕發(fā)酵過程的溫度，使發(fā)酵豆粕小肽含量提高和抗?fàn)I養(yǎng)因子降低的程度與30℃對照組相比沒有顯著差異。這表明在24℃條件下豆粕發(fā)酵時(shí)，添加糖化酶使豆粕堆中的可溶性碳水化合物快速分解，釋放熱量，添加酵母菌加快這一過程，二者聯(lián)合使用比單獨(dú)添加糖化酶產(chǎn)熱量大。王衛(wèi)國等的試驗(yàn)結(jié)果也表明，在豆粕發(fā)酵時(shí)添加糖化酶可提高其發(fā)酵速度，縮短發(fā)酵時(shí)間。添加酵母菌還可以加快豆粕的發(fā)酵過程，分解豆粕蛋白，產(chǎn)生較多的菌體蛋白和生物活性物質(zhì)，有利于提高動(dòng)物的免疫力和抗病力。

2.4 北方溫度條件下豆粕發(fā)酵保溫技術(shù)

堆式發(fā)酵豆粕堆外側(cè)的溫度與環(huán)境溫度相同，或由于含水量大，低于環(huán)境溫度。為保持堆外側(cè)豆粕的溫度，可采用覆蓋物進(jìn)行保溫。但是由于豆粕發(fā)酵產(chǎn)熱及主要發(fā)酵菌種是需氧菌，選擇的覆蓋物即要保溫，又要透氣，而且又要防止雜菌污染。

陳雷采用市售的帆布苫布和薄層棉被進(jìn)行豆粕發(fā)酵保溫試驗(yàn)。車間溫度在12～15℃條件下，加熱水使發(fā)酵豆粕達(dá)到22.5～22.9℃，由于環(huán)境溫度低，發(fā)酵溫度升高比較緩慢，到44 h，才達(dá)到50℃以上。棉被組在發(fā)酵32 h后溫度首先到達(dá)30℃以上，分別高出對照組和苫布組4.6℃和2.4℃；隨著發(fā)酵的進(jìn)行，該組的溫度始終高于對照組和苫布組，比對照組和苫布組提前4 h，達(dá)到50℃。棉被組發(fā)酵豆粕的小肽含量略高于對照組，氨基酸總量比對照組高4.37%；脲酶活性比對照組低29.17%；苫布組以上指標(biāo)均優(yōu)于對照組，但略遜于棉被組。該試驗(yàn)結(jié)果表明，在環(huán)境溫度較低的季節(jié)，以堆式發(fā)酵豆粕時(shí)，在堆外覆蓋薄層棉被或苫布可保持豆粕發(fā)酵的溫度，但棉被的透氣性優(yōu)于苫布，使豆粕發(fā)酵得更完全，時(shí)間可縮短4 h。

3 結(jié)論

在北方地區(qū)低溫條件下進(jìn)行工廠化生產(chǎn)發(fā)酵豆粕，首先篩選和培育適合于北方溫度條件下的豆粕發(fā)酵菌種，并進(jìn)行相應(yīng)溫度條件下的菌種擴(kuò)繁；在北方溫度條件下[（22～24）℃]豆粕發(fā)酵時(shí)添加糖化酶+酵母菌及覆蓋薄層棉被可提高堆式發(fā)酵豆粕的溫度和速度，以及提高發(fā)酵豆粕的質(zhì)量。