■梁玉樹 易錫斌 何開蓉 何蕓蕓 張麗萍 李良春

（1.西南科技大學材料與化學工程學院，四川綿陽 621000；2.新希望六和股份有限公司，山東青島 266555；3.四川新希望畜牧科技有限公司，四川成都 610017；4.四川理工學院材料與化學工程系，四川自貢 643000）

維生素是生物體維持生命活動所必需的一類有機化合物，在生物體生長、代謝和發(fā)育過程中發(fā)揮著重要作用。水溶性維生素主要包括硫胺素（VB1）、核黃素（VB2）、煙酸（VB3）、吡哆醇（VB6）、生物素（VB7）、鈷胺素（VB12）等。隨著人們?nèi)找嬖鲩L的畜禽消費需求、畜牧業(yè)的迅速發(fā)展，畜禽養(yǎng)殖逐漸規(guī)?；?、集約化、專業(yè)化，畜禽的營養(yǎng)和健康越來越受到重視。維生素作為維持動物機體健康的重要營養(yǎng)元素，在畜禽飼料中是不可或缺的。飼料中的各種維生素的量必須達到動物體的需要量，才能保證動物維持體內(nèi)營養(yǎng)平衡，達到健康生長，因此加強飼料中維生素含量檢測是確保飼料產(chǎn)品品質(zhì)的基本途徑，開發(fā)準確、便捷的測定方法將成為一項重要的研究課題。維生素檢測方法有光度法、微生物法、酶標法等。隨著科技的發(fā)展，儀器分析法相繼建立，國家標準建立了各種水溶性維生素檢測方法-高效液相色譜法，樣品前處理繁瑣耗時，針對飼料中的含量低于20 mg/kg水溶性維生素無法檢測，并且干擾較大，無法準確定性和定量。

近年采用高效液相色譜同時測定水溶性維生素的文獻較多，E.E.Abano等評述了1980～2014年采用高效液相色譜同時測定水溶性維生素的部分文獻，Kamman等采用高效液相色譜同時測定維生素B1和維生素B2。Gatti等采用液相色譜熒光檢測器檢測了牛奶和藥片中的VB6、VB2。Heudi等采用反相高效液相色譜分離預混飼料中的水溶性維生素并用紫外檢測器檢測其含量。Lebiedzinska等采用反相液相色譜電化學庫倫檢測器及紫外檢測器檢測了動植物食品中的 VB1、VB6、VB12。Vidovic等采用高效液相色譜測定了多種維生素糖漿中的水溶性維生素及防腐劑含量。Ciulu等采用反相高效液相色譜法測定了蜂蜜、干果蔬菜中的水溶性維生素。Andreas E.Karatapanis等研究了水溶性維生素在單柱高效液相色譜中的分離狀況，Israel Olusegun Otemuyiwa等采用高效液相色譜法測定同時測定食品中水溶性維生素。Baifen Huang等報道了采用超高壓液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜同時測定了強化嬰兒食品中4種水溶性維生素。莫彩娜等報道了采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定配合飼料中維生素B1和維生素B2的方法。梁波報道了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定功能飲料中VB1、VB3、VB6、VB12以及VC含量的方法。然而，針對低含量、成分復雜、干擾較多的配合飼料樣品中6種水溶性維生素含量的同時檢測未見研究報道。本研究建立了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）同時檢測6種水溶性維生素的檢測方法，應(yīng)用于配合飼料及預混料中6種水溶性維生素的定性定量檢測，將提高維生素的檢測效率和準確性，在高效、低成本檢測飼料中維生素含量方面具有重要意義。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

Agilent 1260-6460液相色譜—三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀配電噴霧離子源[ESI（美國安捷倫公司）]，AB-135型電子分析天平（梅特勒托利多上海有限公司）；LD5-2B離心機（北京京立離心機有限公司）；KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；旋渦混勻器MS3（德國IKA）。

乙睛、甲醇(色譜純，默克公司)；甲酸、乙酸銨、氨水(分析純，天津科密歐化學試劑有限公司)；氫氧化鈉、氯化鈉(分析純，上海國藥集團)；硫胺素、核黃素、煙酸、吡哆醇、生物素、鈷胺素(含量99.5%，sigma公司)。

魚料、肉雞料、仔豬料、蛋雞料、乳豬料和種豬料樣品由四川新希望畜牧科技有限公司提供。

標準物質(zhì)儲備溶液：準確稱取適量的硫胺素、核黃素、煙酸、吡哆醇、生物素、鈷胺素標準品，用0.02 mol乙酸銨(pH=4.0)配制質(zhì)量濃度為1 000.0 mg/l標準溶液。

標準物質(zhì)工作中間液：準確分別移取適量標準溶液，配制成質(zhì)量 VB1、VB3濃度為 1 mg/l，VB2、VB7、VB12濃度為 10 mg/l，VB6為 0.5 mg/l的混合標準工作中間液。

標準物質(zhì)工作液：吸取一定體積的標準物質(zhì)工作中間液，配成濃度以VB6計，濃度分別為1、2、5、10、20 μg/l標準物質(zhì)工作液。

0.02 mol/l乙酸銨溶液（pH=4.0）：稱取1.54 g乙酸銨于1 L容量瓶中，加適量超純水超聲溶解，定容至刻度。用乙酸調(diào)節(jié)pH值為4.0，用0.45 μm水相濾膜，過濾備用。

1.2 樣品處理

稱取飼料樣品0.5～2 g于100 ml容量瓶中，加入20 ml 0.02 mol/l乙酸銨溶液，超聲提取20 min，冷卻定容，離心，用0.22 μm水相濾膜，過濾上機。

1.3 色譜與質(zhì)譜條件

1.3.1 色譜條件

色譜柱：Capcell PAK ADME(2.1 mmI.D×150 mm，3 μm)；流動相A：含0.1%甲酸甲醇溶液；流動相B：0.02 mol/l乙酸銨溶液，采用梯度洗脫程序，流速為0.3 ml/min；梯度條件為：100%B；0～12 min，100%～10%B；12～14 min，10%B；14.01 min，100%B。

1.3.2 質(zhì)譜條件

試驗采用甲醇溶解6種水溶性維生素分別對其進行母離子、子離子全掃描，得到離子流圖譜如圖1。

圖1 6種水溶性維生素全掃描的離子流

ESI正離子掃描模式：多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）參數(shù)：干燥氣溫度325℃，干燥氣流速9 L/min，霧化氣壓力45 psi，鞘氣溫度300℃，流速11 L/min，毛細管電壓3 500 V，噴嘴電壓500 V,其他質(zhì)譜優(yōu)化條件如表1所示。

表1 MRM監(jiān)測模式下6種水溶性維生素的儀器優(yōu)化條件

2 結(jié)果與討論

2.1 提取溶劑的選擇

比較水、0.02 mol/l甲酸銨（pH=4.0）、0.02 mol/l乙酸銨（pH=4.0）、20%甲醇水溶液幾種提取劑分別對樣品提取的效果。上機檢測均能得到很好的分離，但日間重現(xiàn)性有顯著差異，其中用0.02 mol/l甲酸銨（pH=4.0）、0.02 mol/l乙酸銨（pH=4.0）重現(xiàn)性好，如圖2。然而，用0.02 mol/l乙酸銨水溶液的作為流動相時，其各組分響應(yīng)值達到最優(yōu)，故選擇用0.02 mol/l乙酸銨（pH=4.0）作為樣品提取液。

2.2 樣品提取時間的選擇

稱取樣品，加入0.02 mol/l乙酸銨（pH=4.0），超聲提取0～30 min，以每5 min為時間間隔點，比較得出超聲時間以20 min為宜。

圖2 幾種提取溶劑穩(wěn)定性比較

2.3 色譜柱與流動相的選擇

由于水溶性維生素有較強的極性，分別用C18-MGⅡ(pH 2～10)3 μm 2.0 mmI.D.×150 mm 柱、C18-MGⅢ(pH 2～10)3 μm 2.0 mmI.D.×150 mm柱、ADME(pH 2～10）3 μm 2.1 mmI.D.×150 mm柱、Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18 2.1×50 mm柱、Waters ACQUITY UPLC HSS T3 1.8 μm 3.0×50 mm柱和Waters ACQUITY UPLC BEH 1.7 μm 2.1×50 mm柱，比較其分離效果，得出ADME(pH 2～10）3 μm 2.1 mmI.D.×150 mm柱對水溶性維生素有很好的保留。

2.4 線性范圍、定量限、加標回收率及相對標準偏差

2.4.1 線性范圍

配制與待測樣品相同基質(zhì)的混合標準系列工作液，使其濃度為分別1、2、5、10、20 μg/l，以選定的定量離子峰面積對質(zhì)量濃度做標準曲線，6種水溶性維生素在仔豬料、育肥豬料、肉仔雞料、蛋雞料、肉鴨料基質(zhì)中的線性方程及相關(guān)系數(shù)如圖3所示。結(jié)果顯示，在不同基質(zhì)中，6種水溶性維生素在1～20 μg/l范圍內(nèi)的線性相關(guān)系數(shù)（r2）為0.996～0.999，表明線性相關(guān)性良好。

圖3 6種水溶性維生素標準曲線及相關(guān)系數(shù)

2.4.2 檢出限和定量限

采用空白樣品中添加目標化合物的方法按1.2節(jié)樣品提取與凈化進行處理后上機分析，以VB6計，濃度為1 μg/l得出的SNR如圖4所示。以3倍信噪比確定檢出限，以10倍信噪比確定定量下限，通過計算得出6種水溶性維生素的檢出限和定量限如表2所示。

圖4 信號噪音

2.4.3 加標回收率

在溶劑空白中分別加入不同濃度的目標維生素標準品，按照1.2節(jié)中樣品前處理方法進行處理，上機檢測其濃度，計算加標回收率，加標量、回收率及相對偏差如表2所示（n=6）。

2.5 實際樣品的測定

表2 加標回收率、相對偏差、檢出限及定量限

應(yīng)用上述方法對魚料、肉雞料、仔豬料、蛋雞料、乳豬料和種豬料樣品進行檢測，幾種飼料樣品中均能檢測出 VB1、VB2、VB3、VB6、VB7、VB12，其中 VB1的含量為3 731～8 939 μg/kg，VB2含量為8 860～14 880 μg/kg，VB3的含量為 6 744～14 720 μg/kg，VB6的含量為2 293～7 136 μg/kg，VB7含量為 356～457 μg/kg，VB12含量為339～485 μg/kg。證明該方法切實可行。本方法能夠滿足配合飼料同時檢測6中水溶性維生素的需求。

3 結(jié)論

本文建立了應(yīng)用UPLC-MS/MS同時檢測魚料、肉雞料、仔豬料、蛋雞料、乳豬料和種豬料中6種水溶性維生素的分析方法。研究表明，6種水溶性維生素加標回收率為83.5%～106.4%，相對標準偏差(n=6)為3.5%～9.1%，各水溶性維生素的檢出限為0.05～1.97 μg/kg，定量下限為0.16～6.50 μg/kg。方法快捷、操作簡單、節(jié)能環(huán)保、結(jié)果準確，符合相關(guān)法律法規(guī)的要求，滿足日常檢測需要。