網(wǎng)絡(luò)出版時間：2014-12-4 13:45網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/doi/10.3969/j.issn.1001-1978.2015.01.012.html

RNAi介導(dǎo)大鼠腺苷A1和A2A受體基因沉默對乙醛誘導(dǎo)的肝星狀細(xì)胞活化增殖的影響

王琪，王和，饒玲，趙晗，楊鳳，楊巖，呂雄文，李俊

(安徽醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，安徽醫(yī)科大學(xué)肝病研究所，安徽 合肥230032)

中國圖書分類號：R-332；R322.47；R329.24；R392.11；R575.2

摘要：目的研究大鼠腺苷A1受體(A1R)和腺苷A2A(A2AR)受體的siRNA分別轉(zhuǎn)染大鼠肝星狀細(xì)胞(HSC)對乙醛誘導(dǎo)的HSC活化增殖的影響。 方法采用乙醛誘導(dǎo)HSC-T6建立離體的大鼠酒精性肝纖維化HSC模型，設(shè)計并合成A1R和A2AR小干擾RNA(small interfering RNA, siRNA)序列，通過脂質(zhì)體Lipofectamine`(TM) 2000瞬時轉(zhuǎn)染至HSC-T6細(xì)胞內(nèi)，熒光倒置顯微鏡觀察細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率，用四甲基偶氮唑鹽(MTT)法檢測HSC-T6細(xì)胞增殖變化；利用Real-Time qPCR及Western blot法分別檢測HSC-T6的A1R、A2AR、α-SMA、Collagen I mRNA及蛋白表達。 結(jié)果將A1R和A2AR siRNA轉(zhuǎn)染至HSC-T6細(xì)胞內(nèi)，A1R和A2AR基因及蛋白的表達水平明顯降低；同時α-SMA、Collagen I mRNA及蛋白表達水平亦明顯降低；靶向封閉A1R或A2AR基因的表達可明顯抑制HSC-T6細(xì)胞的活化增殖。 結(jié)論靶向封閉A1R或A2AR基因的表達可明顯抑制HSC-T6細(xì)胞的活化增殖，A1R和A2AR可能是潛在的酒精性肝纖維化的治療靶點。

關(guān)鍵詞：腺苷A1受體；腺苷A2A受體；肝星狀細(xì)胞；細(xì)胞增殖；乙醛；酒精性肝纖維化

doi:10.3969/j.issn.1001-1978.2015.01.012

文章編號：

文獻標(biāo)志碼：A1001-1978(2015)01-0050-06

收稿日期:2014-09-03,修回日期:2014-11-22

基金項目：國家自然科學(xué)基金資助項目(No 81270498)；安徽省自然科學(xué)基金項目(No 11040606M194)；安徽高校省級科學(xué)研究重點項目(No KJ2012A148)；國家級大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目(No 201310366032)

作者簡介：王琪(1992-)，女，碩士生，研究方向：抗炎免疫藥理學(xué)， E-mail:leodd1992@126.com；

通訊作者呂雄文(1970-)，男，博士，教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：抗炎免疫藥理學(xué)，，Tel: 0551-65161115，E-mail:lxw31288@aliyun.com

Abstract:AimTo investigate the influence of down-regulating adenosine A1 receptor and adenosine A2A receptor gene expression on proliferation and activation of acetaldehyde-induced hepatic stellate cell-T6 cells through siRNA. MethodsAlcoholic liver fibrosis in vitro model was constructed by inducing HSC-T6 cells with acetaldehyde. siRNA targeting A1R and A2AR were designed and synthesized according to its mRNA. The siRNA was transfected into rat HSC-T6 cells by liposome Lipofectamine`(TM) 2000. HSC cell proliferation was measured by MTT. The mRNA levels of A1R, A2AR, α-SMA, Collagen I in the supernatant of the cell culture were measured by Quantitative Real-Time PCR. The protein levels of A1R, A2AR, α-SMA, Collagen I were measured by Western blot. ResultsA1R and A2AR siRNA effectively inhibited the cell proliferation, and they also significantly decreased the levels of A1R, A2AR, α-SMA, Collagen I, suggesting that A1R and A2AR might be potential target genes in the alcoholic liver fibrosis. ConclusionsSilencing A1R or A2AR by RNAi can significantly inhibit the HSC proliferation, A1R and A2AR may be potential therapeutic target genes for alcoholic liver fibrosis.

酒精性肝病是指長期大量飲用各種含乙醇的飲料所導(dǎo)致的肝臟損害性病變[1]。在酒精性肝纖維化發(fā)生過程中，乙醇可通過代謝毒性產(chǎn)物、氧化應(yīng)激、細(xì)胞因子相互作用等多種因素激活肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cell，HSC)。乙醇在酒精脫氫酶的作用下轉(zhuǎn)化成乙醛，接著在乙醛脫氫酶作用下轉(zhuǎn)化成醋酸，最后分解為二氧化碳和水。根據(jù)文獻報道，乙醛在酒精性肝纖維化的形成中起到關(guān)鍵作用。HSC的活化增殖是肝纖維化的核心環(huán)節(jié)，肝臟受損時HSC活化增殖轉(zhuǎn)化為肌樣成纖維化細(xì)胞，α-SMA合成與分泌細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM)增多，導(dǎo)致ECM合成與降解失衡[2-3]。腺苷受體(adenosine receptors，ARs)家族包括A1、A2A、A2B和A3受體，屬于G蛋白偶聯(lián)受體超家族，廣泛存在于HSC、枯否細(xì)胞(kupffer cell, KC)和肝細(xì)胞中[4]。在酒精性脂肪肝以及肝纖維化發(fā)展過程中，腺苷和ARs激活的作用受到眾多研究者的關(guān)注。其中A1受體(A1 receptor，A1R)和A2A受體(A2A receptor，A2AR)為高表達受體，也是4種ARs中最主要的2種亞型[5]。有研究表明，在肝纖維化的發(fā)病機制中，腺苷受體活化扮演著重要的角色，有望成為預(yù)防和治療肝纖維化的一個新穎的靶點[6]。但ARs在酒精性肝纖維化中的重要調(diào)節(jié)功能仍未完全明確。本研究在采用乙醛誘導(dǎo)HSC-T6細(xì)胞建立離體大鼠酒精性肝纖維化HSC模型的基礎(chǔ)上，運用RNA干擾技術(shù)，通過構(gòu)建針對A1R和A2AR基因的小干擾RNA，特異性降低A1R和A2AR的表達，觀察靶向抑制A1R和A2AR基因的表達對HSC活化增殖及對α-SMA、Collagen I表達的影響，為酒精性肝纖維化的防治提供新的靶點。

1材料

1.1實驗細(xì)胞株大鼠肝星狀細(xì)胞株(HSC-T6)，購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞研究所。

1.2試劑和儀器新生牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司，中國)，DMEM培養(yǎng)液、TRIzol Reagent RNA 提取試劑(Gibco公司，美國)，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000 (Invitrogen公司，美國)，乙醛(質(zhì)量分?jǐn)?shù)40%，天津大茂化學(xué)試劑廠，中國)，胰蛋白酶、RIPA、PMSF(碧云天公司，中國)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Fermentas 公司，美國)，SYBR Green，ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(Thermo公司，美國)，A1R、A2AR抗體(安博公司，中國)，α-SMA、Collagen I(博奧森公司，中國)，β-actin抗體(中山金橋公司，中國)，HRP標(biāo)記的辣根過氧化物酶二抗(中山金橋公司，中國)，引物(捷瑞公司，中國)，siRNA序列(上海吉瑪公司，中國)。Thermo forma 3111型培養(yǎng)箱(Thermo公司，美國)，倒置熒光顯微鏡(OLYMPUS公司，日本)，酶標(biāo)儀(BiotekEL，美國)

2方法

2.1HSC-T6細(xì)胞的培養(yǎng)大鼠肝星狀細(xì)胞系(HSC-T6)以10%小牛血清DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，另外加抗生素(1×105U·L-1青霉素、100 mg·L-1鏈霉素)。置于CO2培養(yǎng)箱(5%CO2、37℃)中，1~2 d換液，2~3 d細(xì)胞傳代，換液用PBS沖洗3次，傳代時用0.25%的胰酶消化細(xì)胞1~2 min。

2.2siRNA的設(shè)計與合成A1R和A2AR的siRNA序列由上海吉瑪公司設(shè)計并合成，該序列經(jīng)BLAST查詢，確認(rèn)所設(shè)計siRNA序列的唯一性。另合成一對帶FAM標(biāo)記的陰性對照siRNASRC序列。(A1R siRNA上游引物序列：5′-CCA GCA UUC UGA UCU ACA UTT -3′，下游引物為：5′-AUG UAG AUC AGA AUG CUG GTT -3′。 A2AR siRNA 上游引物序列：5′-GUG GCU GUA UGA AGU UGA ATT-3′，下游引物為：5′-UUC AAC UUC AUA CAG CCA CTT-3′。siRNASCR 上游引物序列：5′-UUC UCC GAA CGU GUC ACG UTT-3′，下游引物為：5′-ACG UGA CAC GUU CGG AGA ATT-3′)。

2.3A1R及A2AR siRNA轉(zhuǎn)染 取對數(shù)生長期HSC-T6細(xì)胞，用含10%新生牛血清不含抗生素的DMEM接種于培養(yǎng)瓶中，調(diào)整細(xì)胞濃度至每毫升4×105個。參照脂質(zhì)體LipofectamineTM2000說明書進行siRNA轉(zhuǎn)染。首先轉(zhuǎn)染FAM標(biāo)記陰性對照siRNA并在熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率。實驗分為正常組、模型組、轉(zhuǎn)染組、陰性對照組。正常組不經(jīng)任何處理，模型組、轉(zhuǎn)染組、陰性對照組加入終濃度為200 μmol·L-1的乙醛，并且每12 h補充1次。轉(zhuǎn)染組轉(zhuǎn)染A1R或A2AR siRNA，A1R及A2AR siRNA終濃度均為200 nmol·L-1。陰性對照組轉(zhuǎn)染FAM標(biāo)記的陰性對照siRNA。按照上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司siRNA說明書進行操作，用Opti-MEM(Invitrogen) 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑進行轉(zhuǎn)染，于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中轉(zhuǎn)染6 h后每組將轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基換為含10%血清培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)不同時間后收集。采用熒光倒置顯微鏡觀察各組轉(zhuǎn)染后細(xì)胞形態(tài)及其形態(tài)學(xué)變化，判斷轉(zhuǎn)染效果。

2.4細(xì)胞增殖實驗收集對數(shù)生長期細(xì)胞,胰酶消化后進行細(xì)胞計數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度至每毫升1×105個接種于96孔板，每孔終體積100 μL，分為4組：正常組(常規(guī)培養(yǎng))；模型組(200 μmol·L-1乙醛刺激)；siRNA組(200 μmol·L-1乙醛+siRNA 200 nmol·L-1)；陰性對照組(200 μmol·L-1乙醛+siRNASCR)，進行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，6 h后棄去轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基，每孔加入200 μL含10%血清培養(yǎng)基置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后加MTT(5 g·L-1)20 μL/孔，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清，加DMSO 100 μL/孔，避光振蕩10 min，使結(jié)晶充分溶解后，待結(jié)晶充分溶解后，使用酶聯(lián)儀在492 nm波長處測各孔的吸光度。

2.5Real-time qPCR法檢測A1R、A2AR、α-SMA、Collagen I mRNA表達收集培養(yǎng)48 h的細(xì)胞，采用TRIzol法提取HSC總RNA，采用分光光度法測定其含量及純度(A260/A280>1.8)。取2 μg總RNA，參照Fermentas公司的RNA PCR Kit試劑盒說明書進行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。10 μL PCR反應(yīng)體系，用PIKO REAL 96 進行實時定量PCR擴增，以β-actin作為內(nèi)參。下列引物(Tab 1)均由上海捷瑞生物技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

Tab 1　　Sequences of primers used for real-time

2.6Western blot 檢測A1R、A2AR、α-SMA、Collagen Ⅰ蛋白表達收集培養(yǎng)48 h的細(xì)胞，每組加1 mL細(xì)胞裂解液(含10 μL PMSF)，于冰上裂解30 min后置于4℃離心機上12 000×g，離心30 min。取上清，用BCA試劑盒進行蛋白定量。加入上樣緩沖液，100℃，加熱10 min使蛋白變性。每孔上樣20 μL總蛋白，進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(濃縮膠電壓80V，分離膠120V)。電泳結(jié)束后用BioRAD濕轉(zhuǎn)儀器將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。膜在室溫下用含5%脫脂奶粉的TBST緩沖液封閉3 h后,用TBST清洗3次,每次15 min。加入第一抗體(1 ∶500)，4 ℃中孵育過夜，再與HRP偶聯(lián)第二抗體(1 ∶10 000)室溫孵育1 h，ECL發(fā)光試劑盒顯影，以β-actin為內(nèi)參，分別以相應(yīng)蛋白與β-actin光密度比值表示該蛋白相對表達水平。以上實驗結(jié)果至少重復(fù)3次。

3結(jié)果

3.1熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率FAM標(biāo)記siRNA轉(zhuǎn)染HSC-T6細(xì)胞48 h后熒光顯微鏡下觀察，可見轉(zhuǎn)染成功的HSC-T6細(xì)胞內(nèi)有綠色熒光，而未轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞則無熒光，在同一位置經(jīng)普通倒置顯微鏡和熒光顯微鏡對比觀察，轉(zhuǎn)染48 h后轉(zhuǎn)染效率可達70%以上，見Fig 1。

Fig 1　Transfection efficiency of siRNA on HSC-T6 cells

A, B: A1R; C, D: A2AR.

3.2siRNA對HSC-T6細(xì)胞增殖的作用 轉(zhuǎn)染siRNA 48 h后，細(xì)胞增長明顯減慢，MTT比色法結(jié)果顯示：與正常組比較，模型組和陰性對照組顯示，200 μmol·L-1的乙醛對HSC-T6細(xì)胞有明顯的增殖作用(P<0.05)，siRNA組抑制率與模型組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。表明A1和A2A受體siRNA對乙醛誘導(dǎo)的HSC細(xì)胞的增殖具有明顯抑制作用，見Fig 2。

Fig 2　Proliferation inhibitory effect of siRNA

#P<0.05vsnormal group;*P<0.05vsmodel group.

3.3Real-time qPCR檢測siRNA轉(zhuǎn)染后HSC-T6細(xì)胞A1R、A2AR、α-SMA、Collagen I mRNA表達變化采用相對定量法測定轉(zhuǎn)染siRNA后的HSC-T6細(xì)胞內(nèi)A1R、A2AR基因相對于β-actin內(nèi)參基因的表達變化。與正常組比較，乙醛作用48 h后，A1R、A2AR、α-SMA、Collagen I mRNA的表達明顯增強(P<0.01)。瞬時轉(zhuǎn)染A1R、A2AR siRNA 48h后，A1R、A2AR mRNA表達降低(P<0.05)，與模型組相比差異有顯著性(P<0.05)；同時，siRNA組α-SMA、Collagen I mRNA表達也降低(P<0.05)，與模型組相比差異有顯著性(P<0.05) 模型組與陰性對照組之間的差異無顯著性(P>0.05)，見Fig 3、4。

Fig 3　mRNA expression levels of A1R, α-SMA,

#P<0.05,##P<0.01vsnormal group;*P<0.05vsmodel group.

Fig 4　mRNA expression levels of A2AR, α-SMA, Collagen I

##P<0.01vsnormal group;*P<0.05vsmodel group.

3.4Western blot檢測siRNA轉(zhuǎn)染后HSC-T6細(xì)胞A1R、A2AR、α-SMA、Collagen I 蛋白表達變化Western blot檢測結(jié)果表明，200 μmol·L-1的乙醛對HSC-T6細(xì)胞增殖具有促進作用，模型組的A1R、A2AR、α-SMA、Collagen I蛋白表達明顯增強，與正常組比較差異有顯著性(P<0.05)。瞬時轉(zhuǎn)染A1R、A2AR siRNA 48 h后，A1R、A2AR蛋白表達降低(P<0.05)，與模型組相比差異有顯著性(P<0.05)，同時，siRNA組α-SMA、Collagen Ⅰ蛋白表達也降低(P<0.05)，與模型組相比差異有顯著性(P<0.05)。陰性對照組與空白對照組之間的差異無顯著性(P>0.05)，見Fig 5、6。

Fig 5　Protein expression levels of A1R, α-SMA,

#P<0.05,##P<0.01vsnormal group;*P<0.05vsmodel group.

4討論

HSC是位于大鼠肝Disses間隙內(nèi)，緊貼肝竇內(nèi)皮細(xì)胞與肝細(xì)胞，是肝內(nèi)的貯脂細(xì)胞，正常情況下HSC表現(xiàn)為富含脂滴的靜止?fàn)顟B(tài)，但當(dāng)肝臟受到炎癥或機械刺激損傷時，HSC可被活化，HSC的激活是肝纖維化發(fā)生發(fā)展的中心環(huán)節(jié)[7]。酒精在生物體內(nèi)經(jīng)乙醇脫氫酶可代謝為乙醛，再經(jīng)乙醛脫氫酶代謝為乙酸。乙醛作為乙醇的直接代謝產(chǎn)物，是激活HSC并導(dǎo)致酒精性肝纖維化發(fā)生的關(guān)鍵分子[8]。根據(jù)本課題組前期研究結(jié)果，選用200 μmol·L-1的乙醛作用48 h作為體外大鼠酒精性肝纖維化的細(xì)胞模型是較為理想的[9-11]。

Fig 6　Protein expression levels of A2AR, α-SMA,

#P<0.05,##P<0.01vsnormal group;*P<0.05vsmodel group.

腺苷作為一種內(nèi)源性嘌呤核苷，主要通過結(jié)合并激活與 G 蛋白偶聯(lián)的ARs，對機體的許多系統(tǒng)及組織發(fā)揮著重要的作用。目前已發(fā)現(xiàn)，ARs亞型包括 A1、A2A、A2B和A3受體，其中 A1受體和 A2A受體為高表達受體，也是 4種 ARs中最主要的2種亞型。 Peng等[12]2009年研究表明缺乏或阻斷A1R 可阻止小鼠酒精性脂肪肝的發(fā)生;Yang等[13]2010年研究報道長期注射 CCl4誘發(fā)的肝纖維化在 A1R 缺乏的小鼠體內(nèi)減輕，且伴有膠原沉積和 HSC 活化明顯減少。亦有研究表明經(jīng)乙醇誘導(dǎo)后的HSC通過激活A(yù)2AR，釋放大量腺苷，促進大鼠和人HSC膠原的合成，在Hashmi等[14]和Sohail等[15]的研究也證實了腺苷通過激活A(yù)2AR在HSC活化致肝纖維化中的作用。Che等[16]2007年也報道， A2AR通過其偶聯(lián)的Gs蛋白上調(diào) cAMP-PKA 信號途徑，再分別經(jīng)由其下游信號通路PKA-Src-ERK1/2 MAPK和p38 MAPK誘導(dǎo)LX-2人肝星形狀細(xì)胞株Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原的生成。

鑒于ARs的重要生理功能，本實驗采用特異性A1R和A2AR siRNA轉(zhuǎn)染HSC-T6細(xì)胞，并從多角度觀察轉(zhuǎn)染效果，成功建立A1R和A2AR siRNA轉(zhuǎn)染HSC-T6細(xì)胞的方法，為后續(xù)研究打下基礎(chǔ)。

觀察A1R和A2AR siRNA轉(zhuǎn)染后其mRNA和蛋白的表達，結(jié)果顯示不論是A1R或A2AR的mRNA及蛋白表達水平均明顯減少，說明轉(zhuǎn)染成功。200 μmol·L-1乙醛作用48 h可激活HSC-T6細(xì)胞，使α-SMA、Collagen Ⅰ mRNA和蛋白的表達明顯增高，但A1R或A2AR siRNA轉(zhuǎn)染對乙醛誘導(dǎo)的HSC-T6細(xì)胞的增殖具有抑制作用，轉(zhuǎn)染A1R或A2AR siRNA 48 h后，細(xì)胞增長明顯減慢，且轉(zhuǎn)染后可明顯抑制α-SMA、Collagen Ⅰ的mRNA和蛋白的表達，再次證明轉(zhuǎn)染成功,且表明沉默A1R或A2AR可使HSC的活化增殖受到抑制。

綜上所述，本研究通過利用腺苷A1R或A2AR siRNA下調(diào)A1R及A2AR基因的表達，可明顯抑制乙醛誘導(dǎo)的HSC-T6細(xì)胞的活化，抑制α-SMA，Collagen Ⅰ的產(chǎn)生。提示A1R和A2AR在肝纖維化的形成過程中發(fā)揮了重要作用，有望成為防治酒精性肝纖維化的靶點之一。但肝纖維化形成是一個復(fù)雜的多因素過程，ARs如何調(diào)控相關(guān)信號通路抑制HSC的活化和增殖，尚需進一步深入研究。

參考文獻:

[1]Reyes-Gordillo K, Shah R, Arellanes-Robledo J, et al. Mechanisms of action of Acetaldehyde in the up-regulation of the human α2 (I) collagen gene in hepatic stellate cells: Key roles of Ski, SMAD3, SMAD4, and SMAD7[J].AmJPathol, 2014, 184(5): 1458-67.

[2]Hernandez-Gea V, Friedman S L. Pathogenesis of liver fibrosis. Annual review of pathology [J].MechanDis, 2011, 6:425-56.

[3]陶輝, 黃成, 楊晶晶, 等. RNAi介導(dǎo)MeCP2基因沉默對HSC-T6細(xì)胞活化增殖的影響[J]. 中國藥理學(xué)通報, 2012, 28(3): 333-6.

[3]Tao H, Huang C, Yang J J, et al. Experimental study of proliferation and activation of HSC-T6 cells through RNA inference targeting MeCP2 [J].ChinPharmacolBull, 2012, 28(3):333-6.

[4]Sands W A, Palmer T M．Adenosine receptors and the control of endothelial cell function in inflammatory disease [J].ImmunolLett, 2005, 101(1):1-11.

[5]Gessi S, Merighi S, Varani K, et al. Adenosine receptors in health and disease [J].AdvPharmacol, 2011, 61:41-75.

[6]Chan E S, Cronstein B N. Adenosine in fibrosis [J].ModRheumatol, 2010, 20(2): 114-22.

[7]Cohen J, Nagy L E. Pathogenesis of alcoholic liver disease: interactions between parenchymal and non-parenchymal cells [J].JDigDis, 2011, 12(1):3-9.

[8]邱萍, 李相, 孔德松, 等. 酒精性肝病發(fā)病機制研究的新進展[J]. 中國藥理學(xué)通報, 2014, 30(2): 160-3.

[8]Qiu P, Li X, Kong D S, et al. Research progress on pathogenesis of alcoholic liver disease [J].ChinPharmacolBull, 2014, 30(2): 160-3.

[9]楊萬枝，呂雄文，余世春,等.cAMP-PKA-CREB信號通路在大鼠酒精性肝纖維 化星狀細(xì)胞模型中的作用[J].安徽醫(yī)藥, 2012, 16(6):729-31.

[9]Yang W Z, Lv X W, Yu S C, et al. Effect of cAMP-PKA-CREB signal pathway in the model of alcoholic hepatic fibrosis stellate cells isolated from rats [J].AnhuiMedPharmJ, 2012, 16(6):729-31.

[10]管文婕，呂雄文，楊萬枝,等.咖啡因?qū)σ胰┱T導(dǎo)的HSC-T6中TGF-β1，CTGF信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響[J].安徽醫(yī)藥, 2012, 16(8):1060-3.

[10]Guan W J, Lv X W, Yang W Z, et al. Effect of caffeine on signaling transduction of TGF-1 and CTGF in hepatic stellate cell-T6 stimulated by acetaldehyde [J].AnhuiMedPharmJ, 2012, 16(8):1060-3.

[11]Wang H, Guan W, Yang W, et al. Caffeine inhibits the activation of hepatic stellate cells induced by acetaldehyde via adenosine A2A receptor mediated by the cAMP/PKA/SRC/ERK1/2/p38 MAPK signal pathway[J].PloSone, 2014, 9(3): e92482.

[12]Peng Z, Borea P A, Varani K, et al. Adenosine signaling contributes to ethanol-induced fatty liver in mice [J].JClinInvest, 2009, 119(3):582-94.

[13]Yang P, Han Z, Chen P, et al. A contradictory role of A1 adenosine receptor in carbon tetrachloride and bile duct ligation induced liver fibrosis in mice[J].JPharmacolExpTher, 2010, 332(3):747-54.

[14]Hashmi A Z, Hakim W, Kruglov E A, et al. Adenosine inhibits cytosolic calcium signals and chemotaxis in hepatic stellate cells [J].AmJPhysiolGastrointestLiverPhysiol, 2007, 292(1):395-401.

[15]Sohail M A, Hashmi A Z, Hakim W, et al. Adenosine induces loss of actin stress fibers and inhibits contraction in hepatic stellate cells via Rho inhibition [J].Hepatology, 2009, 49(1):185-94.

[16]Che J, Chan E S, Cronstein B N. Adenosine A2A receptor occupancy stimulates collagen expression by hepatic stellate cells via pathways involving protein kinase A, Src, and extracellular signal-regulated kinases 1/2 signaling cascade or p38 mitogen-activated protein kinase signaling pathway [J].MolPharmacol, 2007, 72: 1626-36.

Proliferation and activation of acetaldehyde-induced HSC-T6

cells through RNA inference targeting adenosine A1 and A2A receptors

WANG Qi, WANG He, RAO Ling, ZHAO Han, YANG Feng, YANG Yan, Lü Xiong-wen, LI Jun

(SchoolofPharmacy,InstituteofLiverDiseases,AnhuiMedicalUniversity,Hefei230032,China)

Key words: adenosine A1 receptor； adenosine A2A receptor；hepatic stellate cell；cell proliferation；acetaldehyde；alcoholic liver fibrosis