·制劑研究·

解毒止瀉結(jié)腸緩釋微丸釋放度的方法學(xué)研究

武小赟，馬靜，王俊濤，夏成夫，趙小鵬

(百花醫(yī)藥集團股份有限公司，貴州 遵義 563000)

摘要：目的建立解毒止瀉結(jié)腸緩釋微丸釋放度的檢查方法并進行方法學(xué)驗證。方法采用高效液相色譜法測定制劑中槲皮素的含量，參照《中國藥典》2010年版的規(guī)定研究本制劑的釋放度檢查方法并進行方法學(xué)驗證。結(jié)果依次在人工胃液、人工腸液、人工結(jié)腸液中對微丸進行釋放度考察，人工胃液2 h不釋放，人工腸液3 h內(nèi)釋放在15%以內(nèi)，人工結(jié)腸液5 h釋放完全。結(jié)論該法簡單、靈敏、準(zhǔn)確，可有效監(jiān)控本品的質(zhì)量。

關(guān)鍵詞：微丸；結(jié)腸定位；釋放度

基金項目：貴州省中藥現(xiàn)代化科技產(chǎn)業(yè)研究開發(fā)專項(No.S2012ZP00503644369)

作者簡介：武小赟，女，研究方向：中藥化學(xué)及中藥制劑，E-mail：wuxiaoyunbingxue@163.com

中圖分類號：R944.9文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

Study on the dissolution of Jiedu Zhixie Colon-targeted Sustained-release Pellets

WUXiao-yun,MAJing,WANGJun-tao,XIACheng-fu,ZHAOXiao-peng

(BaihuaMedicalPharmaceuticalGroupCo.,Ltd.,Zunyi563000,China)

Abstract：ObjectiveTo establish a method for the dissolution of Jiedu Zhixie Colon-targeted Sustained-release Pellets,and prove that the method is reliable and durable.Methods The content of quercetin was determined by HPLC,the dissolution test of pellets was researched and avalidated according to requirement in China Phannacopeia 2010 Edition.Results The release in vitro was studied in the artificial gastric fluid,artificial intestinal fluid and artificial colon fluid in sequence.Quercetin was not released in artificial gastric fluid,less than 15% in artificial intestinal fluid,slowly in artificial colon fluid and completely at 5 h.Conclusion This method was simple,sensitive and accurate.It can be used for the quality control of pellets.

Key words:Pellet；Colon-targeted；Release

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)屬于炎癥性腸病的一種，是消化內(nèi)科常見病。多為直腸和結(jié)腸的慢性非特異性炎癥性病變，多呈反復(fù)發(fā)作的慢性過程，其發(fā)病機制尚不明確，治療難度大。當(dāng)前臨床治療手段繁多，有腸內(nèi)營養(yǎng)、西藥和中藥藥物治療、手術(shù)治療、生物靶向治療、干細(xì)胞移植等療法[1]。解毒止瀉結(jié)腸緩釋微丸由單一苗藥對坐葉組成，對坐葉為茜草科植物對坐葉HedyotisuncinellaHook.et Arn．的干燥全草，夏、秋二季采收，具有清熱解毒、調(diào)中止瀉之功效，用于治療腹瀉、腹脹、腹痛、里急后重以及痢疾、急慢性胃腸炎等證[2]。該味藥材在治療胃腸道疾病方面具有獨到療效。將其開發(fā)制成結(jié)腸緩釋制劑，使藥物主要在結(jié)腸定位緩慢釋放，提高結(jié)腸病變部位的藥物濃度，發(fā)揮治療結(jié)腸炎的最佳療效，為中藥新型結(jié)腸靶向給藥系統(tǒng)的研究積累實驗基礎(chǔ)。本文對解毒止瀉結(jié)腸緩釋微丸的釋放度的檢查方法進行研究，以期達(dá)到全面控制藥品質(zhì)量的目的。

1儀器與材料

1.1儀器BY300A小型包衣鍋(上海黃海藥檢儀器廠)；ZRS-8G智能溶出實驗儀(天津市新天光分析儀器技術(shù)有限公司)；島津液相色譜儀(包括LC-15C泵、SPD-15C紫外檢測器、SIL-10AF自動進樣器)；Diamonsil色譜柱(C18，4.6 mm×250 mm,5 μm)；AUY-220型電子天平(萬分之一，日本島津公司)；AB135-S型電子天平(十萬分之一，日本島津公司)；KQ-40ODB型數(shù)控超聲清洗波器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2材料對坐葉藥材：由公司采供部提供，經(jīng)檢驗符合《貴州省中藥材、民族藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》2003版的規(guī)定；Eudragit S100、Eudragit L100(德國羅姆公司)；羧甲基纖維素鈉(上?？房倒?;檸檬酸三乙酯(TEC，德國羅姆公司);滑石粉(北京燕京制藥);乙腈、甲醇為色譜純，水為重蒸餾水，其余試劑均為分析純。槲皮素對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：100081-200907)。

2實驗方法與結(jié)果

2.1溶液及微丸的制備

2.1.1解毒止瀉結(jié)腸緩釋微丸的制備取部分對坐葉藥材，粉碎成細(xì)粉并過100目篩，備用。剩余藥材加水煎煮三次，第一次2 h，第二、三次各1 h，合并煎液，濾過。濾液濃縮至適量，加乙醇使含醇量為60%，攪勻，靜置24 h，濾過。濾液濃縮至稠膏，減壓干燥至干。將干膏粉粉碎過100目篩，與上述細(xì)粉合并，然后與羧甲基淀粉鈉以8∶1(w/w)的比例混合均勻，過100目篩三次，用95%的乙醇為潤濕劑滾動凝聚成1 mm左右的微丸，60 ℃干燥5 h。再用濃度為6%的Eudragit L100∶Eudragit S100(1∶2)的包衣液包衣，包衣液中加入增塑劑檸檬酸三酯和抗粘劑滑石粉，增重6%，制得結(jié)腸緩釋微丸[3~6]。

2.1.2溶液的制備

0.2 mol·L-1磷酸二氫鉀溶液：取27.22 g磷酸二氫鉀，用水溶解并稀釋至1 000 mL。

0.2 mol·L-1氫氧化鈉溶液：取8 g氫氧化鈉，用水溶解并稀釋至1 000 mL。

人工胃液：取稀鹽酸7.65 mL，加水稀釋成1 000 mL，即得。

人工腸液：取上述250 mL的0.2 mol·L-1磷酸二氫鉀溶液與112 mL的0.2 mol·L-1氫氧化鈉溶液混合后，再加水稀釋至1 000 mL，搖勻，即得。

人工結(jié)腸液：取上述250 mL的0.2 mol·L-1磷酸二氫鉀溶液與222.5 mL的0.2 mol·L-1氫氧化鈉溶液混合后，再加水稀釋至1 000 mL，搖勻，即得。

對照品溶液的制備：精密稱取槲皮素對照品適量，加溶出介質(zhì)制成每1 mL含槲皮素5 μg的溶液，即得。

供試品溶液的制備：取溶出液直接測定。

2.2釋放度檢查方法采用《中國藥典》2010年版(二部)附錄Ⅹ C項下的溶出度測定第三法(小杯法)[7]，評估藥丸的體外釋藥性能。以槲皮素含量為指標(biāo)，釋放介質(zhì)依次為含0.5%吐溫-80的人工胃液(pH 1.2的鹽酸溶液)、人工腸液(pH 6.8的磷酸二氫鉀溶液)、人工結(jié)腸液(pH 7.8的磷酸二氫鉀溶液)，溶質(zhì)體積為200 mL，轉(zhuǎn)速為50 rpm，體系溫度控制在(37±0.5)℃，取樣時間為人工胃液2 h、人工腸液3 h、人工結(jié)腸液5 h(n=6)。用0.45 μm的濾膜過濾，取樣20 μL，測定。

2.3指標(biāo)成分槲皮素的含量測定方法色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以甲醇-0.4%磷酸溶液(53∶47)為流動相；檢測波長為370 nm；理論板數(shù)以槲皮素計算應(yīng)不低于4 000。對照品溶液與供試品溶液各20 μL，注入液相色譜儀，測定，即得。

2.4微丸釋放度檢查的方法學(xué)驗證

2.4.1溶出介質(zhì)的考察取微丸1.2 g，精密稱定，共六份，分別置200 mL的人工胃液、人工腸液、人工結(jié)腸液及含0.5%的吐溫-80的前述種介質(zhì)中，測定胃液2 h、腸液3 h、結(jié)腸液5 h，槲皮素在含和不含0.5%的吐溫-80的3種介質(zhì)中的溶出度。結(jié)果，兩種人工胃液中均檢測不到槲皮素；不加表明活性劑的腸液中亦檢測不出槲皮素，加表明活性劑的腸液中槲皮素的含量為11.28%；不加表面活性劑的結(jié)腸液中槲皮素含量為46.74%，加表面活性劑的結(jié)腸液中槲皮素中含量為95.23%。所以選擇含0.5%的吐溫-80的人工胃液、人工腸液、人工結(jié)腸液作為釋放度的溶出介質(zhì)。

2.4.2漏槽實驗分別于180、200、250 mL的人工結(jié)腸液(含0.5%的吐溫-80)中投入3.6 g微丸，超聲處理30 min，測定含量，結(jié)果3種體積的介質(zhì)中槲皮素溶出的百分含量分別為78.52%、96.45%、95.78%，故選擇200 mL的溶出介質(zhì)即可使槲皮素釋放完全。

2.4.3標(biāo)準(zhǔn)曲線的考察取槲皮素對照品(含量：96.5%)4 mg，精密稱定，置50 mL的容量瓶中，用人工結(jié)腸液(含0.5%的吐溫-80)溶解并稀釋至刻度，然后從中精密移取10 mL,置100 mL的容量瓶中，用溶出介質(zhì)定容至刻度，得到槲皮素對照品儲備液。精密移取對照品儲備液適量，稀釋制備得到4、2、1、0.5 μg·mL-1的溶液；取上述5種濃度的對照液注入高效液相色譜儀，測定槲皮素的峰面積積分值，以槲皮素濃度為橫坐標(biāo)，峰面積積分值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算得回歸方程：Y=85 393X-9 159.3，R2=0.999 8。說明槲皮素濃度在0.5~8 μg·mL-1范圍內(nèi)與峰面積積分值呈良好的線性關(guān)系。

2.4.4精密度實驗稱取適量的槲皮素對照品，用人工結(jié)腸液配制成高、低兩個濃度，分別為4.2 μg·mL-1和0.42 μg·mL-1，重復(fù)進樣6次，測定峰面積積分值，結(jié)果RSD分別為0.27%、0.92%。表明該檢測方法在高低兩個濃度下，精密度均良好。

2.4.5回收率實驗采用加樣回收法測定回收率。精密稱取6份已測定含量的腸溶微丸(槲皮素含量為702.15 μg·g-1)0.6 g于溶出杯中，各加入200 mL的人工結(jié)腸液(含0.5%的吐溫-80)，事先配制結(jié)腸液時加入適量的槲皮素對照品，使其槲皮素的濃度為2.13 μg·mL-1，照腸溶微丸溶出度的測定方法進行測定，5 h后取溶出液，過0.45 μm的濾膜，測定。計算回收率，結(jié)果見表1。

表1　加樣回收試驗結(jié)果表

2.4.6穩(wěn)定性試驗取解毒止瀉結(jié)腸緩釋微丸1.2 g，置200 mL的人工結(jié)腸液(含0.5%的吐溫-80)中，照腸溶微丸的溶出度測定方法進行檢測，5 h后取溶出液，分別于0、2、4、6、8 h各進樣1次，測定槲皮素的峰面積，分別為283 713、286 022、281 172、281 783、284 462，RSD為0.70%。說明樣品在溶出介質(zhì)中8 h內(nèi)穩(wěn)定性較好。

2.4.7濾膜的吸附性考察精密稱取槲皮素對照品適量，用人工結(jié)腸液(含0.5%的吐溫-80)制備成濃度為4.2 μg·mL-1的對照品溶液，共3份，測定峰面積，然后用0.45 μm的有機濾膜過濾，同法測定。結(jié)果顯示：槲皮素過膜與未過膜峰面積的比值為0.997，RSD為0.28%，表明有機濾膜對槲皮素?zé)o明顯吸附，可忽略不計。

2.4.8均一性試驗取解毒止瀉結(jié)腸緩釋微丸1.2 g，照腸溶微丸的溶出度測定方法進行測定，于2、3、4、5、6 h取溶出液過0.45 μm的濾膜，進行測定，并及時補充相同溫度的介質(zhì)。測定不同時間的溶出量，繪制溶出曲線，結(jié)果表明，本法溶出均一性良好(見表2)。

2.5樣品釋放度的測定取3批解毒止瀉結(jié)腸緩

釋微丸的中試樣品，按照“2.2”和“2.3”項下的方法進行釋放度的測定。結(jié)果3批產(chǎn)品釋放差異較小，符合規(guī)定。

表2　溶出均一性考察

3討論

3.1解毒止瀉結(jié)腸緩釋微丸是利用pH依賴性的包衣材料Eudragit包單層衣，并利用單層衣的厚度，使其具有綜合時滯效應(yīng)，在結(jié)腸定位緩慢釋放。該方法是目前普遍認(rèn)可的方法，具有受胃腸道環(huán)境影響較小，結(jié)腸定位性好等優(yōu)點。

3.2結(jié)腸定位制劑要求在胃中不釋放，在腸液釋放不超過20%，主要是在結(jié)腸中釋放。所以在做釋放度的方法學(xué)考察時，均以人工結(jié)腸液為介質(zhì)進行驗證。另外，因為微丸在結(jié)腸中是緩慢釋放，所以對低濃度和高濃度的溶出液分別進行精密度考察，以確保整個釋放過程中，含量都能精確測定。

3.3本研究中所制備的解毒止瀉結(jié)腸緩釋微丸，經(jīng)體外試驗表明，可以達(dá)到結(jié)腸定位給藥的要求。但尚需進行進一步的體內(nèi)研究，以充分表征其結(jié)腸定位釋放的特點。

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