松花粉安全性毒理學(xué)研究

陸梅，嚴(yán)峰，羅海燕，王國(guó)斌，沈華，李蕾

(江蘇吉貝爾藥業(yè)有限公司，江蘇 鎮(zhèn)江 212009)

摘要：目的檢驗(yàn)松花粉作為保健食品的安全性。方法按原衛(wèi)生部發(fā)布的《保健食品功能學(xué)評(píng)價(jià)程序和檢驗(yàn)方法規(guī)范(2003年版)》中安全性毒理學(xué)評(píng)價(jià)程序和檢驗(yàn)方法規(guī)范進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果急性毒性實(shí)驗(yàn)表明該產(chǎn)品為無(wú)毒級(jí)；遺傳毒性實(shí)驗(yàn)表明松花粉未見(jiàn)遺傳毒性作用；大鼠30 d喂養(yǎng)實(shí)驗(yàn)表明未見(jiàn)異常。結(jié)論松花粉能夠安全服用。

關(guān)鍵詞：松花粉；急性毒性；遺傳毒性；安全性

作者簡(jiǎn)介：陸梅，女，研究方向：藥理學(xué)，E-mail：lmei1968@163.com

中圖分類(lèi)號(hào)：R285.1文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

Toxicological research on the edible safety of pine pollen

LUMei,YANFeng,LUOHai-yan,WANGGuo-bin,SHENHua,LILei

(JiangsuJibeierPharmaceuticalCo.,Ltd.,Zhenjiang212009,China)

Abstract：ObjectiveTo evaluate the edible safety of pine pollen as health food.MethodsAccording to Health Food Function Evaluation Procedure and Inspection Method Specification,released by Ministry of Public Health,the safety and toxicology were tested as health food.ResultsAcute toxicity experiment showed that the product was a non-toxic level;Genetic toxicity experiment showed that pine pollen did not see the genetic toxic effect;30 days feeding experiments of rats showed no exception.ConclusionPine pollen can safely take.

Key words:Pine pollen;Acute toxicity;Genetic toxicity;Edible safety

松花粉是馬尾松和油松的干燥花粉，在傳統(tǒng)醫(yī)藥學(xué)中具有悠久的應(yīng)用歷史?！渡褶r(nóng)本草經(jīng)》將松花粉列為“上品”。現(xiàn)代研究表明，松花粉中含有22種氨基酸(其中含有8種人體必需的氨基酸)、14種維生素、30余種礦物元素和上百種活性酶，此外還含有核酸、纖維素、不飽和脂肪酸、黃酮類(lèi)物質(zhì)、膽堿、磷脂等[1,2]。松花粉在我國(guó)有著悠久的應(yīng)用歷史，《中國(guó)藥典》2005年版記載：“松花粉燥濕，收斂止血。用于濕疹、黃水瘡、皮膚糜爛，膿水淋漓，外傷出血、尿布性皮炎[3]。近年來(lái)，隨著人們對(duì)松花粉的研究不斷深入，松花粉逐漸成為人們?nèi)粘I(yíng)養(yǎng)保健的佳品[4,5]。為研究松花粉作為保健食品及普通食品的安全性，對(duì)其進(jìn)行了安全性毒理學(xué)研究。

1材料與方法[6]

1.1樣品松花粉購(gòu)自云南惠爾生物科技有限公司。經(jīng)江蘇省藥品檢驗(yàn)所劉午霞教授鑒定為松花粉。受試樣品以蒸餾水制備成一定的濃度供實(shí)驗(yàn)用。

1.2試驗(yàn)動(dòng)物清潔級(jí)SD大鼠，ICR種小鼠，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(滬)2013-0016，使用許可證號(hào)：SYXK(滬)2009-0068。

1.3急性毒性試驗(yàn)雌、雄小鼠各10只(18～22 g)。采用最大耐受劑量法，劑量為10.0 g·kg-1，灌胃容量0.4 mL·(20 g)-1。小鼠禁食不禁水16 h后一次性灌胃給予受試物，觀(guān)察14 d，記錄動(dòng)物的中毒表現(xiàn)及死亡情況。

1.4遺傳毒性試驗(yàn)

1.4.1Ames試驗(yàn)采用常規(guī)平板摻入法，TA97a、TA98、TA100、TA102標(biāo)準(zhǔn)菌株和S9由上海市疾病預(yù)防控制中心提供。將松花粉樣品配制成8、40、200、1 000、5 000 μg/皿進(jìn)行試驗(yàn)，

1.4.2小鼠骨髓微核試驗(yàn)隨機(jī)選小鼠50只，雌、雄小鼠各半(25～30 g)，隨機(jī)分為5組，每組雌、雄各5只。樣品設(shè)2 500 mg·kg-1(低劑量)、5 000 mg·kg-1(中劑量)和10 000 mg·kg-1(高劑量)3個(gè)劑量組及陰性對(duì)照組(蒸餾水)和陽(yáng)性對(duì)照(環(huán)磷酰胺，40 mg·kg-1)組。以0.4 mL·(20 g)-12次灌胃(間隔24 h)，第二次灌胃后6 h取胸骨制片鏡檢。

1.4.3小鼠精子畸形試驗(yàn)選雄性小鼠25只(25～35 g)，按體重隨機(jī)分為5組。陰性對(duì)照組(蒸餾水)、樣品設(shè)每天2 500 mg·kg-1(低劑量)、5 000 mg·kg-1(中劑量)和10 000 mg·kg-1(高劑量)3個(gè)劑量組，陽(yáng)性對(duì)照(環(huán)磷酰胺，40 mg·kg-1)組。連續(xù)5 d灌胃給藥[灌胃容量0.4 mL·(20 g)-1]，每天1次，于第35天取雙側(cè)附睪制片鏡檢。

1.530 d喂養(yǎng)試驗(yàn)SD大鼠80只，雌、雄各半。大鼠按體重隨機(jī)分為4組，每組20只，雌、雄各10只。受試物摻入飼料給予，動(dòng)物單籠飼養(yǎng)，自由攝食攝水。另設(shè)：樣品低、中、高三個(gè)劑量組，低劑量組：每天3.0 g·kg-1(相當(dāng)于推薦劑量的50倍)，即1 kg飼料含松花粉30.0 g；中劑量組：每天4.5 g·kg-1(相當(dāng)于推薦劑量的75倍)，即1 kg飼料含松花粉45.0 g；高劑量組：每天6.0 g·kg-1(相當(dāng)于推薦劑量的100倍)，即1 kg飼料含松花粉60.0 g。正常對(duì)照組：給予全價(jià)營(yíng)養(yǎng)配合飼料；高劑量組調(diào)整飼料中蛋白質(zhì)含量至與對(duì)照組相當(dāng)。連續(xù)觀(guān)察30 d。每天觀(guān)察動(dòng)物一般情況、體重生長(zhǎng)狀況、飼料消耗及利用率；實(shí)驗(yàn)結(jié)束采血進(jìn)行血液學(xué)檢查、血液生化學(xué)檢查、臟器重量及病理組織學(xué)檢查。

1.6實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析和處理實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)用SAS 6.12軟件中的單因素方差分析進(jìn)行多組間的比較。

2結(jié)果

2.1急性毒性試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)期間，動(dòng)物均未見(jiàn)中毒癥狀，14 d內(nèi)動(dòng)物無(wú)死亡。雌、雄小鼠經(jīng)口MTD大于10.0 g·kg-1，屬實(shí)際無(wú)毒級(jí)。

2.2遺傳毒性試驗(yàn)

2.2.1Ames試驗(yàn)各劑量組(無(wú)論是否加入S9 混合液)回變菌落數(shù)均未超過(guò)自發(fā)回變數(shù)的2倍，并且未見(jiàn)劑量-反應(yīng)關(guān)系。而各陽(yáng)性對(duì)照組均顯示強(qiáng)烈的誘變作用。表明在試驗(yàn)劑量范圍內(nèi)Ames試驗(yàn)結(jié)果為陰性，未見(jiàn)致突變作用。松花粉Ames試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1和表2。

表1　松花粉第一次Ames試驗(yàn)結(jié)果

表2　松花粉第二次Ames試驗(yàn)結(jié)果

陽(yáng)性對(duì)照：不加用S9:TA97a 500.0 μg/皿米帕林；TA98 6.0 μg/皿柔紅霉素； TA100及TA102 1.0 μL/皿甲基磺酸甲酯；加用S9:TA97a、TA98、TA100 10.0 μg/皿2-氨基芴；TA102 50.0 μg/皿 1，8-二羥基蒽醌。

2.2.2小鼠骨髓微核試驗(yàn)各劑量組小鼠嗜多染紅細(xì)胞(PCE)微核出現(xiàn)率、PCE/成熟紅細(xì)胞(RBC)與陰性對(duì)照組均無(wú)顯著性差異(P>0.05)，而陽(yáng)性對(duì)照組與陰性對(duì)照組相比差異具有顯著性(P<0.05)。試驗(yàn)結(jié)果表明，小鼠骨髓微核試驗(yàn)結(jié)果為陰性，受試樣品在本次試驗(yàn)劑量下未見(jiàn)致突變作用，結(jié)果見(jiàn)表3。

2.2.3小鼠精子畸形試驗(yàn)結(jié)果顯示3個(gè)劑量組的精子畸形率分別為2.14%、2.26%、2.20%，與陰性對(duì)照組的精子畸形率相近(2.10%)，無(wú)顯著性(P>0.05)。而陽(yáng)性對(duì)照組(環(huán)磷酰胺組)精子畸形率為5.02%，與陰性對(duì)照組的差異有顯著性(P<0.05)。表明小鼠精子畸形試驗(yàn)結(jié)果為陰性，結(jié)果見(jiàn)表4。

表3　松花粉對(duì)骨髓細(xì)胞微核發(fā)生率的影響 ± s)

表4　松花粉對(duì)小鼠精子畸形率的影響

2.330 d喂養(yǎng)試驗(yàn)

2.3.1一般情況試驗(yàn)期間，各組動(dòng)物反應(yīng)敏捷，毛色正常，行動(dòng)靈活，生長(zhǎng)發(fā)育良好，未見(jiàn)行為異常，無(wú)明顯中毒反應(yīng)，無(wú)死亡發(fā)生。

2.3.230 d喂養(yǎng)動(dòng)物體重情況各劑量組動(dòng)物增重與對(duì)照組比較差異無(wú)顯著性(P>0.05)，結(jié)果見(jiàn)表5。

表5　松花粉30 d喂養(yǎng)試驗(yàn)對(duì)大鼠體重(g)的影響

2.3.3食物利用率以大鼠增重克數(shù)/100 g飼料計(jì)，各劑量組動(dòng)物食物利用率與同性別對(duì)照組差異無(wú)顯著性(P>0.05)，結(jié)果見(jiàn)表6和表7。

2.3.4血液學(xué)檢查見(jiàn)表8，試驗(yàn)各劑量組與對(duì)照組比較差異無(wú)顯著性(P>0.05)。

表6　松花粉30 d喂養(yǎng)試驗(yàn)對(duì)大鼠食物利用率的影響 ± s， n=10)

表7　松花粉對(duì)大鼠各周食物利用率的影響 ± s， n=10)

表8　松花粉30 d喂養(yǎng)試驗(yàn)大鼠血液學(xué)檢查結(jié)果 ± s， n=10)

續(xù)表8：

組別血紅蛋白(g·L-1)紅細(xì)胞(1012·L-1)白細(xì)胞(109·L-1)中性粒細(xì)胞(%)堿性粒細(xì)胞(%)酸性粒細(xì)胞(%)淋巴細(xì)胞(%)單核細(xì)胞(%)♂對(duì)照組134.2±12.37.76±0.9510.8±2.0017.3±4.50.9±0.61.4±0.577.9±5.32.5±0.7♂低劑量組141.8±9.98.89±0.6311.7±0.5818.4±3.91.3±0.51.7±0.576.3±4.92.3±0.8♂中劑量組139.2±15.77.66±1.0812.4±1.3919.1±3.51.1±0.61.6±0.775.6±3.92.6±0.8♂高劑量組147.4±17.37.91±0.6211.0±1.9616.9±3.10.9±0.71.4±0.578.7±4.72.1±0.9

2.3.5血液生化學(xué)檢查結(jié)果見(jiàn)表9。

表9　松花粉30 d喂養(yǎng)試驗(yàn)大鼠血清生化測(cè)定結(jié)果 ± s， n=10)

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05

由試驗(yàn)結(jié)果可見(jiàn)，雄性大鼠中劑量組的谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、雌性大鼠低劑量組的膽固醇(T-CHE)與對(duì)照組比較差異有顯著性(P<0.05)，但上述數(shù)值均在本實(shí)驗(yàn)室歷史檢測(cè)對(duì)照范圍內(nèi)，且無(wú)劑量反應(yīng)關(guān)系，因此可以認(rèn)為沒(méi)有生物學(xué)意義。其余各指標(biāo)與對(duì)照組比較差異未見(jiàn)顯著性(P>0.05)。

2.3.6臟體比松花粉對(duì)大鼠臟器絕對(duì)重量及臟體比差異無(wú)顯著性。組織病理學(xué)檢查：大體解剖時(shí)，對(duì)照組及松花粉低、中、高3個(gè)劑量組大鼠脾、肝、腎、十二指腸、胃、卵巢、睪丸在體觀(guān)察未見(jiàn)有意義的病理改變，鏡下檢查對(duì)照組和高劑量組間比較未見(jiàn)明顯的病理差異，組織病理學(xué)檢查結(jié)果均在正常范圍內(nèi)

3討論

松花粉含有豐富的營(yíng)養(yǎng)成分和生物活性物質(zhì)，資源非常豐富。松花粉對(duì)人體的生理調(diào)節(jié)功能也很廣泛，具有抗疲勞、延緩衰老、增強(qiáng)消化、保肝護(hù)肝、治療前列腺疾病、美容以及心血管疾病的維護(hù)等[7，8]，是不可多得的保健佳品，當(dāng)前的松花粉產(chǎn)品大多是營(yíng)養(yǎng)保健品，應(yīng)加大開(kāi)發(fā)力度，開(kāi)發(fā)松花粉藥品以及食品。此次通過(guò)對(duì)松花粉系統(tǒng)的毒性研究，表明了松花粉無(wú)論作為藥品、保健食品還是普通食品都是安全的，這將為松花粉資源的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)提供有力的支持。

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