HPLC法同時(shí)測(cè)定華山參中山莨菪堿、東莨菪堿、阿托品的含量

陳妤1,2，閆曉楠1,2，楊曉宏3

(1.天津中新藥業(yè)研究中心，天津 300457；2.天津市中藥質(zhì)量控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300457；

3.天津中新藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司，天津 300193)

摘要：目的建立高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定華山參中山莨菪堿、東莨菪堿、阿托品的含量。方法色譜柱：Agilent Zorbax SB-Aq C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相：乙腈-50 mmol·L-1磷酸二氫鉀(含0.08%三乙胺，用磷酸調(diào)pH至6.0)(15∶85)；檢測(cè)波長：210 nm；柱溫：30 ℃；流速：1.0 mL·min-1。結(jié)果山莨菪堿在0.058 8～2.949 1 μg線性范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系(r=0.999 9)，平均回收率為100.03%(n=6)，RSD為0.13%；東莨菪堿在0.145 7～7.284 1 μg線性范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系(r=0.999 9)，平均回收率為100.77%(n=6)，RSD為0.97%；阿托品在0.161 7～8.084 4 μg線性范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系(r=0.999 9)，平均回收率為99.20%(n=6)，RSD為0.80%。結(jié)論方法穩(wěn)定、可靠，可作為華山參的質(zhì)量控制方法。

關(guān)鍵詞：華山參；山莨菪堿；東莨菪堿；阿托品；高效液相色譜法

作者簡介：陳妤,女，研究方向：藥物分析，E-mail:chen2351@126.com

中圖分類號(hào)：R927.2文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

Determination of anisodamine,scopolamine and atropine in Huashanshen by HPLC

CHENYu1,2，YANXiao-nan1,2，YANGXiao-hong3

(1.TianjinZhongxinPharmaceuticalR&DCenter，Tianjin300457，China;2.TianjinTraditional

ChineseMedicineQualityControlKeyLaboratory，Tianjin300457，China;3.Tianjin

ZhongxinPharmaceuticalGroupCo.,Ltd.，Tianjin300193，China)

Abstract：ObjectiveTo establish an HPLC method to determine anisodamine,scopolamine and atropine in Huashanshen.Methods Anisodamine,scopolamine and atropine were assayed on an Agilent Zorbax SB-Aq C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)column;The mobile phase composed of acetonitrile-50 mmol·L-1 potassium dihydrogen phosphate (containing 0.08% triethylamine,adjust pH to 6.0 with phosphatic acid)(15∶85) at a flow rate of 1.0 mL·min-1;The determination wavelength was 210 nm.ResultsThe calibration curves were linear in the range of 0.058 8～2.949 1 μg(r=0.999 9)for anisodamine,0.145 7～7.284 1 μg(r=0.999 9)for scopolamine and 0.161 7～8.084 4 μg(r=0.999 9)for atropine,respectively.The average recoveries (n=6) of anisodamine,scopolamine and atropine were 100.03%(RSD=0.13%),100.77%(RSD=0.97%) and 99.20%(RSD=0.80%),respectively.ConclusionThe method was simple and reliable,accurate,repeatable and can be used for the quality control of Huashanshen．

Key words:Huashanshen;Anisodamine;Scopolamine;Atropine;HPLC

華山參為茄科泡囊草屬植物漏斗泡囊草(PhysochlainainfundibularisKuang)的干燥根，具溫肺祛痰，平喘止咳的功效，用于寒痰喘咳，驚悸失眠，為《中國藥典》2010年版所收載。華山參的主要成分有阿托品、東莨菪堿、山莨菪堿等托烷生物堿，東莨菪內(nèi)酯、華山參苷和東莨菪苷等香豆素類化合物，以及氨基酸、多糖等多種成分[1,2]?！吨袊幍洹?010年版采用紫外-可見分光光度法測(cè)定華山參中總生物堿的含量，規(guī)定華山參藥材中含總生物堿以莨菪堿計(jì)算，不得少于0.2%，該方法操作復(fù)雜，準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性差[3]。同時(shí)，《中國藥典》2010年版采用HPLC法測(cè)定其中東莨菪內(nèi)酯含量，但該成分在很多植物中均含有，專屬性不足。本研究建立了同時(shí)測(cè)定華山參中山莨菪堿、東莨菪堿和阿托品含量的HPLC法，結(jié)果準(zhǔn)確，重復(fù)性好，快速簡便，可作為華山參藥材更加有效的質(zhì)量控制方法。

1儀器與試藥

Agilent 1200高效液相色譜儀(美國安捷倫公司)；Waters 2695高效液相色譜儀(美國沃特世公司)。氫溴酸山莨菪堿對(duì)照品(批號(hào)：100051-201105)，氫溴酸東莨菪堿對(duì)照品(批號(hào)：100049-201009)和硫酸阿托品對(duì)照品(批號(hào)：100040-200510)均購自中國藥品生物制品檢定所；華山參由天津中新藥業(yè)集團(tuán)有限公司第六中藥廠提供，經(jīng)檢驗(yàn)符合《中國藥典》2010年版(一部)“華山參”項(xiàng)下的相關(guān)規(guī)定；乙腈、甲醇為色譜純，水為純化水，其他試劑均為分析純。

2方法與結(jié)果

2.1色譜條件色譜柱：Agilent Zorbax SB-Aq C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相：乙腈-50 mmol·L-1磷酸二氫鉀(含0.08%三乙胺，磷酸調(diào)pH至6.0)(15∶85)；檢測(cè)波長：210 nm；柱溫：30 ℃；流速：1.0 mL·min-1，理論塔板數(shù)按東莨菪堿峰計(jì)算應(yīng)不低于10 000。

2.2對(duì)照品和供試品的配制

2.2.1對(duì)照品溶液的制備分別取氫溴酸山莨菪堿、氫溴酸東莨菪堿和硫酸阿托品對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含氫溴酸山莨菪堿30 μg、氫溴酸東莨菪堿30 μg、硫酸阿托品60 μg的混合溶液，即得。

2.2.2供試品溶液的制備取華山參藥材細(xì)粉1 g，精密稱定，置具塞瓶中，精密加入60%甲醇25 mL；密塞；超聲處理30 min，放冷，微孔濾膜(0.45 μm)濾過，即得。

2.3測(cè)定方法精密吸取上述供試品溶液與對(duì)照品溶液10 μL，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算樣品的含量。根據(jù)分子式計(jì)算，氫溴酸山莨菪堿折算成山莨菪堿系數(shù)為0.790 6，氫溴酸東莨菪堿折算成東莨菪堿系數(shù)為0.789 4，硫酸阿托品折算成阿托品系數(shù)為0.855 1(見圖1、2)。

2.4方法學(xué)考察

2.4.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備精密稱取氫溴酸山莨菪堿對(duì)照品適量，精密稱定，配制成5.88、11.82、23.63、59.10、88.49、294.91 μg·mL-1的對(duì)照品溶液。精密稱取氫溴酸東莨菪堿對(duì)照品適量，精密稱定，配制成14.57、29.14、58.27、145.73、218.54、728.41 μg·mL-1的對(duì)照品溶液。精密稱取硫酸阿托品堿對(duì)照品適量，精密稱定，配制成16.17、32.34、64.67、161.71、242.53、808.44 μg·mL-1的對(duì)照品溶液。分別取上述對(duì)照品10 μL注入高效液相色譜儀，以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo),相應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并以最小二乘法計(jì)算得氫溴酸山莨菪堿、氫溴酸東莨菪堿、硫酸阿托品的標(biāo)準(zhǔn)曲線分別為：

Y=1 350.015 4X+1.768 9(r=0.999 9)；

Y=992.680 4X+11.288 3(r=0.999 9)；

Y=1 212.888 3X+16.145 1(r=0.999 9)。

結(jié)果顯示，氫溴酸山莨菪堿對(duì)照品在0.058 8～2.949 1 μg、氫溴酸東莨菪堿對(duì)照品在0.145 7～7.284 1 μg、硫酸阿托品對(duì)照品在0.161 7～8.084 4 μg的范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.4.2儀器精密度試驗(yàn)取供試品溶液，按以上色譜條件于同一日內(nèi)重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積，結(jié)果氫溴酸山莨菪堿、氫溴酸東莨菪堿、硫酸阿托品的RSD(n=6)分別為0.56%、0.48%、0.41%。

2.4.3樣品溶液的穩(wěn)定性試驗(yàn)取供試品溶液，按以上色譜條件每隔1 h進(jìn)樣1針，測(cè)定峰面積，結(jié)果在12 h內(nèi)測(cè)定，供試品溶液氫溴酸山莨菪堿峰面積RSD為0.64%，氫溴酸東莨菪堿峰面積RSD為0.38%，硫酸阿托品峰面積RSD為0.57%。結(jié)果表明，供試品溶液在12 h內(nèi)基本無變化，穩(wěn)定性良好。

圖1　混合對(duì)照品色譜圖 1.氫溴酸山莨菪堿；2.氫溴酸東莨菪堿;3.硫酸阿托品

圖2　華山參樣品色譜圖

2.4.4重復(fù)性試驗(yàn)精密稱取同一批號(hào)樣品6份，制備供試品溶液，測(cè)定峰面積并計(jì)算山莨菪堿、東莨菪堿、阿托品含量，結(jié)果山莨菪堿平均含量為2.81 mg·g-1，RSD為0.49%(n=6)。東莨菪堿平均含量為1.20 mg·g-1，RSD為0.32%(n=6)。阿托品平均含量為4.43 mg·g-1，RSD為0.63%(n=6)。

2.4.5加樣回收率試驗(yàn)精密稱取已知含量樣品6份，每份0.5 g，精密加入氫溴酸山莨菪堿、氫溴酸東莨菪堿、硫酸阿托品對(duì)照品適量，制備供試品溶液，測(cè)定峰面積并計(jì)算含量，結(jié)果表明山莨菪堿回收率的平均值為100.03%，RSD為0.13%。東莨菪堿回收率的平均值為100.77%，RSD為0.97%。阿托品回收率的平均值為99.20%，RSD為0.80%。表明本方法回收率較好，方法可行，結(jié)果見表1~3。

表1　山莨菪堿加樣回收試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果

表2　東莨菪堿加樣回收試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果

表3　阿托品加樣回收試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果

2.4.6樣品含量測(cè)定取華山參藥材，按“2.2.2”項(xiàng)下操作，測(cè)定山莨菪堿、東莨菪堿和阿托品的含量，并計(jì)算分離度和理論塔板數(shù)，結(jié)果見表4。

表4　華山參樣品含量測(cè)定結(jié)果

3討論

3.1分別選擇色譜柱Diamonsil C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)、Hypersil C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)、Agilent Zorbax SB-Aq C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，根據(jù)樣品分離效果、理論塔板數(shù)等柱效參數(shù)，綜合考慮山莨菪堿、東莨菪堿和阿托品的測(cè)定要求及分離效果，選擇Agilent Zorbax SB-Aq C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)作為色譜柱。

3.2試驗(yàn)中參考比較了3種流動(dòng)相體系：①周軍等[4]對(duì)華山參滴丸中3種生物堿的測(cè)定方法，采用乙腈-醋酸鹽體系，結(jié)果樣品中3種生物堿的分離較好，但此流動(dòng)相體系存在基線漂移的問題，而且梯度洗脫過于復(fù)雜；②康輝等[5]的研究中，采用甲醇-磷酸水體系，雖然山莨菪堿的分離較好，但對(duì)于東莨菪堿的分離較差，而且阿托品峰嚴(yán)重拖尾；③本文參考《中國藥典》[6]中硫酸阿托品的含量測(cè)定方法，選擇乙腈-磷酸二氫鉀體系，在此體系中不加入離子對(duì)試劑，減少對(duì)色譜柱的損害，加入適量三乙胺，調(diào)整峰形，并用磷酸調(diào)至pH為6.0，結(jié)果表明色譜圖中山莨菪堿、東莨菪堿、阿托品與雜質(zhì)峰分離效果最佳，峰型最好。

參考文獻(xiàn)3.3[4~7]報(bào)道中，山莨菪堿、東莨菪堿和阿托品的檢測(cè)波長為210 nm；采用二極管陣列檢測(cè)器對(duì)山莨菪堿、東莨菪堿和阿托品進(jìn)行光譜掃描，結(jié)果表明3種生物堿的最大吸收也均在196 nm?？紤]到末端吸收的干擾，本文借鑒參考文獻(xiàn)選取210 nm作為檢測(cè)波長，該波長下各色譜峰響應(yīng)良好，而且沒有雜峰干擾。

參考文獻(xiàn)3.4根據(jù)[7]考察了前處理中提取方法(超聲、回流)、提取溶劑(甲醇、30%甲醇、60%甲醇、水)、提取體積(10、25、50 mL)、提取時(shí)間(20、30、40 min),對(duì)華山參中山莨菪堿、東莨菪堿、阿托品提取情況的影響，結(jié)果顯示使用超聲提取的方法，精密加入60%甲醇25 mL，超聲處理30 min，可以將華山參中山莨菪堿、東莨菪堿和阿托品提取完全。

通過方法學(xué)考察建立了高效液相色譜法測(cè)定華山參中山莨菪堿、東莨菪堿、阿托品含量的方法。本方法簡便易行，結(jié)果準(zhǔn)確，重復(fù)性好，可作為華山參藥材質(zhì)量控制的方法。

參考文獻(xiàn)：

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[2]趙森淼,侴桂新,王崢濤.華山參化學(xué)成分研究[J].中草藥,2013,44(8)：938-941.

[3]國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典2010年版(一部)[S].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：692.

[4]周軍,苗淑森,胡永峰,等.HPLC法測(cè)定華山參滴丸中消旋山莨菪堿、東莨菪堿及阿托品的含量[J].藥物分析雜志,2010,30(5)：838-841.

[5]康輝,聶桂華,代雪平.HPLC法測(cè)定華山參中山莨菪堿的含量[J].中醫(yī)研究,2010,23(10):33-35.

[6]國家藥典委員會(huì)．中華人民共和國藥典2010年版(二部)[S].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：981.

[7]代雪平,宋漢敏.華山參中東莨菪苷的含量測(cè)定研究[J].現(xiàn)代中藥研究與實(shí)踐,2012,26(5)：66-68.