作者單位：510630 廣州，中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院腎內(nèi)科

線粒體功能障礙在晚期糖基化終產(chǎn)物致腎小球內(nèi)皮細(xì)胞通透性增加中的作用機(jī)制

唐驊李燦明賴渭妍饒嘉玲葉增純婁探奇

【摘要】目的探討晚期糖基化終產(chǎn)物(AGEs)對(duì)大鼠腎小球內(nèi)皮細(xì)胞(rGEnC)通透性的影響及線粒體功能障礙在其中的作用。方法采用原代培養(yǎng)的rGEnC，予AGEs 80 mg/L作用24 h，采用跨內(nèi)皮細(xì)胞電阻抗和異硫氰酸熒光素標(biāo)記的牛血清白蛋白濾過(guò)率觀察通透性的變化，MitoSOX試劑盒檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧，JC-1熒光標(biāo)記法檢測(cè)線粒體膜電位(△Ψm)，熒光素酶檢測(cè)系統(tǒng)測(cè)定三磷酸腺苷(ATP)的生成，蛋白免疫印跡法檢測(cè)NF-E2相關(guān)因子2(Nrf2)的表達(dá)。結(jié)果AGEs可引起rGEnC通透性升高，活性氧產(chǎn)生增加，采用叔丁基對(duì)苯二酚(tBHQ)(20 μmol/L)、N-乙酰半胱氨酸(NAC)(10 mmol/L)和抗AGE受體抗體(100 mg/L)預(yù)處理后，上述AGEs作用被抑制。AGEs可引起rGEnC △Ψm下降，ATP和Nrf2減少，而anti-RAGE抗體可抑制△Ψm下降和ATP減少，tBHQ則能抑制△Ψm下降和Nrf2減少。結(jié)論AGEs可導(dǎo)致rGEnC線粒體功能障礙，引起活性氧產(chǎn)生增加，從而導(dǎo)致rGEnC間通透性增加。

【關(guān)鍵詞】晚期糖基化終產(chǎn)物；線粒體；腎小球內(nèi)皮細(xì)胞；氧化應(yīng)激

DOI：10.3969/g.issn.0253-9802.2015.03.003

基金項(xiàng)目：廣東省醫(yī)學(xué)科研基金(A2011186)

通訊作者，婁探奇，E-mail：Lou.tq@163.com

收稿日期：(2014-12-18)

Role of mitochondrial dysfunction in advanced glycation end products-induced permeability increases in glomerular endothelial cellsTangHua,LiCanming,LaiWeiyan,RaoJialing,YeZengchun,LouTanqi.DepartmentofNephrology,theThirdAffiliatedHospitalofSunYat-senUniversity,Guangzhou510630,China

Correspondingauthor,LouTanqi,E-mail：Lou.tq@163.com

Abstract【】ObjectiveTo investigate the effect of advanced glycation end products (AGEs) on the permeability of glomerular endothelial cells (rGEnC) in rats and the role of mitochondrial dysfunction in this pathological process. MethodsPrimary cultured rGEnC were incubated with AGEs (80 mg/L) for 24 h. The changes in endothelial permeability were investigated by transendothelial electrical resistance and the flux of fluorescein isothiocyanate-conjugated bovine serum albumin. MitoSOX kit was used to detect intracellular reactive oxygen species (ROS). Mitochondrial membrane potential (△Ψm) was measured by JC1 fluorescein staining. The generation of adenosine triphosphate (ATP) was evaluated by luciferase assay system. The expression of NF-E2-related factor 2 (Nrf2) was detected by western blotting. ResultsThe monolayer permeability and the generation of ROS of rGEnC were increased by AGEs. Pretreatment with tert-Butyl-hydroquinone (tBHQ) (20 μmol/L), N-acetylcysteine (NAC) (10 mmol/L) and anti-RAGE antibody (100 mg/L) could suppress the detrimental effect of AGEs. The decline of △Ψm, ATP and Nrf2 were induced by AGEs, whereas the decreases of △Ψm and ATP could be blocked by pretreatment with anti-RAGE antibody and the decline of △Ψm and Nrf2 inhibited by tBHQ pretreatment. ConclusionsAGEs can cause mitochondrial dysfunction, leading to elevated levels of ROS, which contributes to increase of permeability in rGEnC.

【Key words】Advanced glycation end products; Mitochondria; Glomerular endothelial cells;

Oxidative stress

作為腎小球?yàn)V過(guò)膜的第一道屏障，腎小球內(nèi)皮細(xì)胞(GEnC)在糖尿病腎病發(fā)病和蛋白尿產(chǎn)生中的作用日益受到重視[1]。目前研究證實(shí)，糖尿病腎病時(shí)GEnC存在著線粒體功能障礙，可能是導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞損傷，引致腎小球?yàn)V過(guò)屏障通透性增高的機(jī)制之一[2-4]。筆者前期研究初步發(fā)現(xiàn)，晚期糖基化終產(chǎn)物(AGEs)可導(dǎo)致GEnC活性氧產(chǎn)生增多，而且下調(diào)細(xì)胞內(nèi)重要的抗氧化蛋白NF-E2相關(guān)因子2(Nrf2)的表達(dá)，最終導(dǎo)致GEnC之間的通透性增加，但線粒體功能障礙是否參與了GEnC損傷的過(guò)程，目前仍不清楚。為此，本研究觀察了AGEs對(duì)大鼠GEnC(rGEnC)通透性的影響及線粒體功能障礙在其中的作用，現(xiàn)報(bào)告如下。

材料與方法

一、 細(xì)胞培養(yǎng)

原代培養(yǎng)的rGEnC受贈(zèng)于美國(guó)西北大學(xué)Dr. Stephen Adler。rGEnC采用含有10%胎牛血清(美國(guó)Gibco)，10%NuSerum血清替代品(美國(guó)BD)、100 kU/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco)培養(yǎng)。使用4～8代細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)。

二、 實(shí)驗(yàn)分組

將細(xì)胞分為5組：①對(duì)照組(Control組)，內(nèi)皮細(xì)胞在不加任何刺激的RPMI1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)；②AGEs組，內(nèi)皮細(xì)胞與80 mg/L AGEs(德國(guó)Merck)培養(yǎng)24 h；③AGEs+叔丁基對(duì)苯二酚(tBHQ)組(AGEs+tBHQ組)，20 μmol/L tBHQ(美國(guó)Sigma)預(yù)處理內(nèi)皮細(xì)胞4 h，然后加入80 mg/L AGEs；④AGEs+N-乙酰半胱氨酸(NAC)組(AGEs+NAC組)，10 mmol/L NAC(美國(guó)Sigma)預(yù)處理內(nèi)皮細(xì)胞4 h，然后加入80 mg/L AGEs；⑤AGEs+抗RAGE抗體組(AGEs+anti-RAGE組)，100 mg/L anti-RAGE(美國(guó)Sigma)預(yù)處理內(nèi)皮細(xì)胞1 h，然后加入80 mg/L AGEs。其中tBHQ為Nrf2的激動(dòng)劑，NAC是抗氧化劑，anti-RAGE為AGEs受體的中和性抗體。

三、 跨內(nèi)皮細(xì)胞電阻的檢測(cè)

單層細(xì)胞電阻抗采用Millicell-Electrical Resistance System(美國(guó)Millipore)檢測(cè)。rGEnC生長(zhǎng)于Transwell filter(美國(guó)Corning)上，檢測(cè)時(shí)電極上下極均浸泡在培養(yǎng)基中，電阻抗由浸入培養(yǎng)基中的探頭檢測(cè)，直至3次讀數(shù)相近則記錄數(shù)值。上下極之間的差值用于計(jì)算電阻抗值(Ω/cm2)。

四、 含異硫氰酸熒光素標(biāo)記的牛血清白蛋白濾過(guò)率

rGEnC生長(zhǎng)于Transwell filter上，待生長(zhǎng)成為致密連接狀態(tài)后，上室換為含異硫氰酸熒光素標(biāo)記的牛血清白蛋白(FITC-BSA，美國(guó)Sigma)的培養(yǎng)基，下室換為含未標(biāo)記的BSA培養(yǎng)基。加處理因素后，從上下室各收集液體200 μl，放于96孔板中(黑色)。采用多功能讀板機(jī)(美國(guó)Molecular Devices)，測(cè)定收集液體在492 nm波長(zhǎng)處熒光吸光度值，計(jì)算收集液FITC-BSA濃度。通過(guò)以下公式計(jì)算濾過(guò)率：濾過(guò)率=C下室×V下室/(C上室×V上室)，C為FITC-BSA濃度，V為液體體積。

五、 細(xì)胞線粒體內(nèi)活性氧的檢測(cè)

細(xì)胞線粒體內(nèi)活性氧的生成量采用MitoSOX法(美國(guó)Invitrogen)檢測(cè)。細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿，加入終濃度5 μmol/L MitoSOX，37 ℃避光孵育10 min，洗滌后，加入DNA染料Hoechst。利用激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)MitoSOX熒光強(qiáng)度變化。每份樣品檢測(cè)30個(gè)細(xì)胞，激發(fā)波長(zhǎng)514 nm，發(fā)射波長(zhǎng)580 nm，所有樣品拍攝條件固定不變。

六、 線粒體膜電位測(cè)定

采用JC-1熒光標(biāo)記法(美國(guó)Molecular Probes)測(cè)定。在細(xì)胞懸浮液中加入JC-1，使其達(dá)所需終濃度，37℃孵育15 min后，磷酸鹽緩沖液清洗2次，流式細(xì)胞儀測(cè)定熒光值。

七、 細(xì)胞ATP生成測(cè)定

采用熒光素酶檢測(cè)系統(tǒng)(美國(guó)Promega)測(cè)定。按照試劑盒步驟，采用1%三氯乙酸提取細(xì)胞ATP后，加入TRIS-醋酸鹽調(diào)整pH至7.75。在細(xì)胞裂解液中加入熒光素酶試劑。光度計(jì)測(cè)定熒光強(qiáng)度。

八、 蛋白免疫印跡

提取總蛋白，SDS-PAGE凝膠電泳后，轉(zhuǎn)膜，封閉，分別加入抗Nrf2抗體(1∶500，美國(guó)Santa Cruz Biotechnology)，抗GAPDH抗體(1∶10 000，美國(guó)Protein Tech Group)，加入辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的羊抗兔IgG(1∶40 000)，曝光，顯片。

九、 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié)果

一、 AGEs對(duì)rGEnC通透性的影響

AGEs可引起單層rGEnC的電阻下降(tAGEs/Control=28.00，P<0.001)，同時(shí)，F(xiàn)ITC-BSA濾過(guò)率在AGEs作用后增加(與對(duì)照組比較，t=21.59，P<0.01)，提示AGEs可使單層rGEnC的通透性升高。予tBHQ、NAC和anti-RAGE抗體預(yù)處理后，AGEs升高rGEnC通透性的作用被阻斷(電阻：tAGEs+tBHQ/AGEs=8.000、tAGEs+tNAC/AGEs=5.231、tAGEs+anti-RAGE抗體/AGEs=13.99；濾過(guò)率：tAGEs+tBHQ/AGEs=8.982、tAGEs+tNAC/AGEs=7.131、tAGEs+anti-RAGE抗體/AGEs=18.48；P均<0.01)，見(jiàn)圖1。

圖1AGEs對(duì)rGEnC通透性的影響(n=3)

A：跨內(nèi)皮細(xì)胞電阻；B：FITC-BSA 濾過(guò)率；與Control組比較，*P<0.01；與AGEs組比較，#P<0.01

二、 AGEs對(duì)rGEnC活性氧產(chǎn)生的影響

AGEs可升高rGEnC的活性氧水平；予tBHQ、NAC和anti-RAGE抗體預(yù)處理后，AGEs導(dǎo)致活性氧生成增加被抑制，見(jiàn)圖2。

圖2AGEs對(duì)rGEnC活性氧產(chǎn)生的影響(免疫熒光，×1 000)

A：Control組；B：AGEs組；C：AGEs+tBHQ組；D：AGEs+NAC組；E：AGEs+anti-RAGE抗體組

三、 AGEs對(duì)rGEnC線粒體膜電位的影響

AGEs可導(dǎo)致rGEnC線粒體膜電位下降(tAGEs/Control=12.31，P<0.01)；予tBHQ和anti-RAGE抗體預(yù)處理后，可減輕AGEs引起的rGEnC線粒體膜電位下降(tAGEs+tBHQ/AGEs=5.651、tAGEs+anti-RAGE抗體/AGEs=9.042，P均<0.01)，見(jiàn)圖3。

圖3AGEs對(duì)rGEnC線粒體膜電位的影響(n=3)

與Control組比較，*P<0.01；與AGEs組比較，#P<0.01

四、 AGEs對(duì)rGEnC ATP生成的影響

AGEs可引起rGEnC ATP生成減少(tAGEs/Control=14.72，P<0.01)。予anti-RAGE抗體預(yù)處理后，ATP的生成減少被抑制(tanti-RAGE抗體/AGEs=10.78，P<0.01)；而予tBHQ預(yù)處理后，AGEs引起的ATP減少未能被抑制(tAGEs+tBHQ/AGEs=0.646，P>0.05)，見(jiàn)圖4。

圖4AGEs對(duì)rGEnC ATP生成的影響(n=3)

與Control組比較，*P<0.01；與AGEs組比較，#P<0.01

五、 AGEs對(duì)rGEnC Nrf2的影響

AGEs組Nrf2表達(dá)低于Control組(t=9.232，P<0.01)；AGEs+tBHQ組rGEnC Nrf2表達(dá)高于AGEs組(t=5.273，P<0.01)，見(jiàn)圖5。

圖5AGEs對(duì)rGEnC Nrf2的影響(n=3)

與Control組比較，*P<0.01；與AGEs組比較，#P<0.01

討論

糖尿病腎病是由糖尿病所導(dǎo)致的腎損害，不積極治療的糖尿病腎病最終進(jìn)展為ESRD。糖尿病腎病的發(fā)病機(jī)制尚未闡明，目前相關(guān)研究以糖尿病和高血壓病所致的腎小球高灌注和過(guò)度濾過(guò)以及高血糖所致的蛋白非酶糖化和AGEs的生成為熱點(diǎn)[5]。

GEnC為一薄層扁平細(xì)胞，細(xì)胞體滿布窗孔，可攔阻血液中血細(xì)胞等有形成分，選擇性地截留中到大分子物質(zhì)，在防止蛋白尿產(chǎn)生中起著重要作用[6-7]。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)，AGEs可以增加GEnC之間的通透性，可能是糖尿病腎病時(shí)引起內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙，進(jìn)而導(dǎo)致腎小球?yàn)V過(guò)屏障損害和蛋白尿增加的原因[8]。

線粒體是細(xì)胞有氧代謝的樞紐，通過(guò)氧化磷酸化產(chǎn)生能量，滿足代謝需要，是細(xì)胞的動(dòng)力工廠[9]。一旦線粒體功能出現(xiàn)障礙，ATP產(chǎn)生減少和活性氧產(chǎn)生增多，都可能導(dǎo)致GEnC結(jié)構(gòu)和功能的損傷，破壞內(nèi)皮細(xì)胞之間的連接結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致通透性增加[4, 9]。線粒體功能障礙可能是GEnC損傷的早期事件[10]。目前有研究發(fā)現(xiàn)，GEnC線粒體功能障礙引起的氧化應(yīng)激增加，甚至可導(dǎo)致足細(xì)胞損傷[3]。但線粒體功能障礙是否參與了GEnC損傷的過(guò)程，目前仍不清楚。

本研究發(fā)現(xiàn)，AGEs可以引起單層rGEnC電阻下降、濾過(guò)率增加，同時(shí)細(xì)胞活性氧產(chǎn)生增加，線粒體膜電位下降， ATP的生成減少，rGEnC之間的通透性增加。當(dāng)使用Nrf2激動(dòng)劑tBHQ或者是活性氧清除劑NAC，可以明顯阻斷AGEs升高rGEnC通透性的作用，活性氧的生成被抑制，線粒體膜電位下降，抗氧化蛋白Nrf2明顯增加，從而逆轉(zhuǎn)AGEs對(duì)rGEnC線粒體功能的影響。應(yīng)用AGEs受體的中和性抗體anti-RAGE后也可得到類似的結(jié)果，且其可明顯增加被AGEs抑制的ATP生成。研究結(jié)果提示，減少氧化應(yīng)激的損傷，可能是保護(hù)GEnC功能的有效途徑之一，但這是否能作為糖尿病腎病的藥物治療靶點(diǎn)，尚需要進(jìn)一步的研究證實(shí)。

綜上所述，糖尿病腎病時(shí)體內(nèi)升高的AGEs可能會(huì)導(dǎo)致GEnC線粒體功能障礙，引起活性氧產(chǎn)生增加，從而導(dǎo)致細(xì)胞間通透性增加，這可能是糖尿病腎病時(shí)蛋白尿生成的機(jī)制之一。

參考文獻(xiàn)

[1]Cheng H, Harris RC. Renal endothelial dysfunction in diabetic nephropathy. Cardiovasc Hematol Disord Drug Targets,2014,14:22-33.

[2]Wang W, Wang Y, Long J, et al. Mitochondrial fission triggered by hyperglycemia is mediated by ROCK1 activation in podocytes and endothelial cells. Cell Metab,2012,15:186-200.

[3]Daehn I, Casalena G, Zhang T, et al. Endothelial mitochondrial oxidative stress determines podocyte depletion in segmental glomerulosclerosis. J Clin Invest,2014,124:1608-1621.

[4]Reidy K, Kang HM, Hostetter T, et al. Molecular mechanisms of diabetic kidney disease. J Clin Invest,2014,124:2333-2340.

[5]楊念生，肖海鵬. 糖尿病腎病診治新進(jìn)展——內(nèi)分泌代謝疾病(9). 新醫(yī)學(xué)，2004，35：117-119.

[6]Siddiqi FS, Advani A. Endothelial-podocyte crosstalk: the missing link between endothelial dysfunction and albuminuria in diabetes. Diabetes,2013,62:3647-3655.

[7]Haraldsson B, Nystrom J. The glomerular endothelium: new insights on function and structure. Curr Opin Nephrol Hypertens,2012,21:258-263.

[8]李燦明，葉增純，彭暉，等. 腎素血管緊張素系統(tǒng)在晚期糖基化終產(chǎn)物改變腎小球內(nèi)皮細(xì)胞通透性中的作用. 中華腎臟病雜志,2011,27:667-672.

[9]Joshi M, Kotha SR, Malireddy S, et al. Conundrum of pathogenesis of diabetic cardiomyopathy: role of vascular endothelial dysfunction, reactive oxygen species, and mitochondria. Mol Cell Biochem, 2014,386:233-249.

[10]Sawant DA, Wilson RL, Tharakan B, et al. Tumor necrosis factor-α-induced microvascular endothelial cell hyperpermeability: role of intrinsic apoptotic signaling. J Physiol Biochem,2014，70:971-980.

(本文編輯：林燕薇)

臨床研究論著