馬開明，王耀輝，吳　銘，樊　航，閆鈺鑫，蔡　歡，牛利娜，李　丹，王國英*

(1. 河南大學(xué)醫(yī)學(xué)院 細(xì)胞與分子免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室, 河南 開封 475004；2. 河南大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，河南 開封 475004)

四種旋毛蟲肌幼蟲囊包染色方法的比較探討

馬開明1，王耀輝1，吳銘2，樊航2，閆鈺鑫2，蔡歡2，牛利娜2，李丹2，王國英1*

(1. 河南大學(xué)醫(yī)學(xué)院 細(xì)胞與分子免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室, 河南 開封 475004；2. 河南大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，河南 開封 475004)

摘要：目的比較4種染色方法制作旋毛蟲肌幼蟲囊包標(biāo)本的效果。 方法①醋酸卡紅(含鐵)染色液染色：染色1.5 h，不分色；②固綠染色液染色：染色4 s，不分色；③醋酸明礬卡紅色液染色：染色30 h，分色；④乙醇硼砂卡紅染色液染色：染色 22 h，不分色。結(jié)果醋酸明礬卡紅染色制作的標(biāo)本囊包輪廓清晰，梭形顯著，與周圍組織分界明顯，囊壁內(nèi)、外層空隙明顯，囊內(nèi)幼蟲清晰。結(jié)論醋酸明礬卡紅染色制作的標(biāo)本，染色效果好，易于觀察。

關(guān)鍵詞：旋毛蟲；肌幼蟲囊包；染色; 比較

中圖分類號：R383.1

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：編號： 1672-7606(2015)01-0043-03

收稿日期：2014-10-16

基金項(xiàng)目：河南大學(xué)醫(yī)學(xué)院2014年度卓越醫(yī)師計劃項(xiàng)目(2014-17)。

作者簡介：馬開明(1957-)，男，實(shí)驗(yàn)師，山東鄄城人，從事實(shí)驗(yàn)技術(shù)及實(shí)驗(yàn)教學(xué)的工作。

通訊作者：*王國英(1962-)，女，山西運(yùn)城人，碩士，高級實(shí)驗(yàn)師，從事寄生蟲免疫及寄生蟲病流行病學(xué)的教學(xué)和科研工作。

Abstract:ObjectiveA comparative staining effect of four staining methods for specimen of Trichinella spiralis encapsulated larvae. Methods1) The specimen were stained with Acetate-carmine staining solution for 24 h, and without fading. 2) The specimen were stained with fast green staining solution for 4 s,and without fading. 3) The specimen were stained with acetate alum carmine staining solution for 30 h,and faded. 4) The specimen were stained with alcohol borax carmine staining solution for 22 h,and without fading. ResultsThe results showed that with the acetate alum carmine staining method, specimen had clearly defined capsule edges. It was prominence that third dimension structures of capsulate. The results also showed that the larva, cyst internal layer, cyst external layer and muscle cells were distinguished clearly.Conclusion Capsule showed obvious figure that specimen of acetate alum carmine staining method.

A Comparative Study of Four Staining Methods for specimen of Trichinella spiralis encapsulated larvae

MA Kaiming1, WANG Yaohui1, WU Ming2, FAN Hang2, YAN Yuxin2, CAI Huan2, NIU Lina2, LI Dan2, WANG Guoying1*

(1.LaboratoryofCellularandMolecularImmunology，MedicalCollege，HenanUniversity，Kaifeng,Henan475004，China；2.MedicalCollegeOfHenanUniversity，Kaifeng,Henan475004，China)

Key words: Trichinella spiralis; encapsulated larvae; staining; comparison

旋毛蟲病是一種嚴(yán)重的人獸共患寄生蟲病，為我國進(jìn)、出口肉類的首檢和必檢病種[1]。此病對人類健康和畜牧業(yè)生產(chǎn)均構(gòu)成嚴(yán)重威脅，位列我國三大人獸共患寄生蟲病之首(旋毛蟲、囊蟲及棘球蚴)。在活檢的肌肉中查到旋毛蟲肌幼蟲囊包是確診旋毛蟲病的病原學(xué)診斷依據(jù)[2]。制作結(jié)構(gòu)清晰的旋毛蟲肌幼蟲囊包標(biāo)本對臨床診斷和實(shí)驗(yàn)教學(xué)具有重要意義。為尋找較好的染色制片方法，我們將4種染色方法用于旋毛蟲肌幼蟲囊包標(biāo)本制作，并對染色效果進(jìn)行比較觀察，旨在得到更好的染色制片效果。

1材料與方法

1.1　主要試劑

1.1.1固定液甲醛 6 mL、體積分?jǐn)?shù)為 95%乙醇20 mL、冰醋酸1 mL、蒸餾水40 mL，混合均勻。

1.1.2醋酸卡紅(含鐵)染色液[3]取100 mL 體積分?jǐn)?shù)為45%冰醋酸，煮沸后徐徐加入卡紅1 g，攪拌均勻后加入0.2 g鐵銹，煮沸10 min，冷卻后過濾，避光貯存在棕色瓶內(nèi)。使用時將原液與蒸餾水按1∶4 的比例配制。

1.1.3固綠染色液固綠0.1 g，溶于體積分?jǐn)?shù)為95%乙醇100 mL中。

1.1.4醋酸明礬卡紅染色液[4]鉀明礬4 g，卡紅2 g，蒸餾水50 mL，冰醋酸5 mL。將明礬溶于水中煮沸，加入卡紅繼續(xù)煮沸5 min，以玻棒攪拌至卡紅溶解為止。冷卻后置棕色瓶中放于窗口，陽光下曝曬2~7 d后過濾，再加入冰醋酸。

1.1.5乙醇硼砂卡紅染色液[4]量取96 mL蒸餾水，加入4 g硼砂攪拌至溶解，配成40 g/L硼砂水溶液；將卡紅1 g加入硼砂水溶液內(nèi)，煮沸約5 min，使之溶解，然后加入體積分?jǐn)?shù)為70%乙醇100 mL。2~4 h后過濾，備用。

1.1.6分色液體積分?jǐn)?shù)為2%鹽酸乙醇。

1.2　標(biāo)本采集、制片、固定

旋毛蟲引自河南省疾病預(yù)防控制中心。10 只昆明小鼠，體質(zhì)量18~22 g，雌性，購自鄭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心。每只鼠經(jīng)口感染200 條肌幼蟲，感染后30 d引頸處死，生理鹽水清洗，置4 ℃冷卻2 h。膈肌剪為長、寬各約0.5 cm，其他部位肌肉剪成如綠豆大小，夾2張載玻片之間，輕輕加壓、細(xì)線捆扎，制成制片。置固定液中24 h，取出后解線，流水沖洗 10 min,蒸餾水沖洗5 min。

1.3　染色

1.3.1醋酸卡紅(含鐵)染色制片置染色液 1.5 h 后取出，蒸餾水沖洗5 min，然后依次放入體積分?jǐn)?shù)為50%、70%、80%、95%和100%乙醇中脫水，各30 min；無水乙醇與二甲苯(1∶1)混合液中透明30 min，純二甲苯30 s。在載玻片上滴 2 滴中性樹膠，將制片放入，加蓋玻片，平置標(biāo)本盒內(nèi)，室溫陰干。

1.3.2固綠染色固定后的制片依次放入體積分?jǐn)?shù)為50%、70%、80%乙醇中各30 min；固綠染液染色4 s，取出后，蒸餾水沖洗2 min；制片放入體積分?jǐn)?shù)為95%、100%乙醇中各30 min；無水乙醇與二甲苯(1∶1)混合液中透明30 min，純二甲苯30 s。在載玻片上滴 2 滴中性樹膠，將制片放入，加蓋玻片，平置標(biāo)本盒內(nèi)，室溫陰干。

1.3.3醋酸明礬卡紅染色固定后的制片置染色液中30 h，取出后蒸餾水沖洗至標(biāo)本不脫色為止。體積分?jǐn)?shù)為2%鹽酸酒精分色液中分色10 min，然后依次放入體積分?jǐn)?shù)為50%、70%、80%、95% 和100% 乙醇中脫水，各30 min；無水乙醇與二甲苯(1∶1)混合液中透明30 min，純二甲苯30 s。在載玻片上滴 2 滴中性樹膠，將制片放入，加蓋玻片，平置標(biāo)本盒內(nèi)，室溫陰干。

1.3.4乙醇硼砂卡紅染色固定后的制片置染色液中 22 h，取出后蒸餾水沖洗 2 min，然后依次放入體積分?jǐn)?shù)為 50%、70%、80%、95% 和 100% 乙醇中脫水，各 30 min；無水乙醇與二甲苯(1∶1)混合液中透明 30 min，純二甲苯 30 s。在載玻片上滴 2 滴中性樹膠，將制片放入，加蓋玻片，平置于標(biāo)本盒內(nèi)，室溫陰干。

2結(jié)果

2.1　醋酸卡紅(含鐵)染色制作的標(biāo)本

光鏡下觀察，標(biāo)本呈深桃紅色；囊包色澤與肌纖維相近，囊壁外層與周圍分界不清，囊壁內(nèi)、外層之間有明顯空隙，囊壁內(nèi)層著色均勻且較深；蟲體蜷曲，呈較淺的桃紅色，較易辨認(rèn)。見圖1 。

2.2　固綠染色制作的標(biāo)本

光鏡下觀察，肌纖維被染成深綠色；囊包所在位置被染成淺綠色，囊包無明顯輪廓，與周圍分界不清，囊壁內(nèi)、外之間無明顯界限；蟲體蜷曲，輪廓模糊，不易觀察。見圖2。

2.3　醋酸明礬卡紅染色制作的標(biāo)本

光鏡下觀察，肌細(xì)胞呈較淺的咖啡色；囊包梭形顯著，囊外壁較薄，與周圍分界明顯，囊內(nèi)呈深咖啡色，囊壁內(nèi)、外層之間有明顯空隙，囊包與周圍肌細(xì)胞能較明顯地區(qū)分；幼蟲淡染，能清晰地辨認(rèn)。見圖3。

圖3　醋酸明礬卡紅染色標(biāo)本

2.4　乙醇硼砂卡紅染色制作的標(biāo)本

光鏡下觀察，囊包結(jié)構(gòu)模糊，無明顯輪廓，與周圍肌細(xì)胞界限不易區(qū)分；肌細(xì)胞呈較暗的粉紅色；內(nèi)、外囊壁之間無明顯界限；蟲體淡染，輪廓可辨認(rèn)。見圖4。

3討論

通過染色可使不同的組織顏色相異，并在光鏡下有較好的顯示，典型特征清晰顯現(xiàn)，可以優(yōu)化教學(xué)效果。旋毛蟲肌幼蟲囊包常用固綠、卡紅、蘇木精類染液染色，常規(guī)染色一般為單染。

固綠屬胞質(zhì)染料，系人工合成，特點(diǎn)是染色速度快。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，固綠染色制作的標(biāo)本，囊包無明顯輪廓，蟲體不易觀察。染色效果不佳。

卡紅是一種天然染料，常用于絳蟲、吸蟲的染色制片[5-6]。 我們的實(shí)驗(yàn)將卡紅用于旋毛蟲肌幼蟲囊包染色，結(jié)果顯示，醋酸卡紅(含鐵)染色液、醋酸明礬卡紅染色液、乙醇硼砂卡紅染色液 3 種染液，雖然染料均為卡紅，由于配方不同，通過染制旋毛蟲肌幼蟲囊包，染色效果差別較大。醋酸明礬卡紅染色制作的標(biāo)本，囊包輪廓清晰，梭形顯著，與周圍組織分界明顯，囊壁內(nèi)、外之間層有明顯空隙；囊內(nèi)幼蟲能清晰的辨認(rèn)。醋酸明礬卡紅染色液染色效果較好，制作的標(biāo)本結(jié)構(gòu)清晰，著色適度，便于觀察。

參考文獻(xiàn)：

[1] 許汴利,杜尊偉,趙旭東.我國部分省市旋毛蟲病的血清學(xué)調(diào)查研究[J].中國人獸共患病學(xué)報，2009,25(10)：1 021-1 024.

[2] 詹希美. 人體寄生蟲學(xué)[M].5版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2001：216-219.

[3] 皮本偉，牛利娜，李丹，等. 旋毛蟲肌幼蟲囊包染色標(biāo)本制作方法的改進(jìn)[J].中國病原生物學(xué)雜志，2012,7(1):48-49.

[4] 陳佩惠, 孔德芳, 李惠珠,等.人體寄生蟲學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)[M].北京:科學(xué)出版社, 1988：15.

[5] 紀(jì)偉華, 郭冀玲.帶絳蟲妊娠節(jié)片標(biāo)本制作方法的研究[J].中國人獸共患病雜志, 2001,17(4):73-74.

[6] 邱莎莎, 鄧曉. 長期保存姜片蟲標(biāo)本固定及染色方法的改進(jìn)[J].中國寄生蟲學(xué)與寄生蟲病雜志, 2008,26(3):239-240.

[責(zé)任編輯姬荷]