易建華， 王留續(xù)， 董文賓， 楊　梅

(陜西科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院， 陜西 西安　710021)

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不同提取方法對(duì)核桃殼色素的抗氧化性影響

易建華， 王留續(xù)， 董文賓*， 楊梅

(陜西科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院， 陜西 西安710021)

摘要：利用超聲輔助，分別以水、乙醇為提取劑，在最優(yōu)工藝條件下提取核桃殼色素。以維生素C為對(duì)照，分別采取4種方法(總還原力、羥基自由基、DPPH自由基、超氧陰離子自由基)對(duì)不同方法提取的核桃殼色素進(jìn)行抗氧化活性的研究.結(jié)果表明：水提色素和醇提色素均有一定的抗氧化活性，在總還原力、羥基自由基、DPPH自由基清除力上，醇提色素的抗氧化活性高于水提色素；兩種色素對(duì)超氧陰離子自由基均沒(méi)有清除能力.

關(guān)鍵詞：核桃殼； 色素； 抗氧化； 自由基

0引言

核桃(walnut)又稱胡桃，是陜西省的著名土特產(chǎn)之一.我國(guó)是核桃大國(guó)，資源豐富，由于對(duì)核桃的綜合開發(fā)利用不夠，只注重于核桃仁的利用，而忽略了核桃殼的開發(fā).

目前，對(duì)廢棄物核桃殼的研究利用很少，大部分僅僅局限在做成不同規(guī)格的核桃殼超細(xì)粉、高級(jí)活性炭[1]、木質(zhì)素及碳分子篩[2,3]，生產(chǎn)高附加產(chǎn)值的產(chǎn)品幾乎沒(méi)有.

隨著人們消費(fèi)水平、健康意識(shí)的提高，消費(fèi)者更傾向于天然產(chǎn)物，對(duì)化學(xué)合成產(chǎn)品的信任感降低[4].從核桃殼中提取的色素，具有較好的穩(wěn)定性和一定的耐光性[5]，可以作為天然食品添加劑和抗氧化劑，使廢棄核桃殼變廢為寶，開發(fā)本地區(qū)廢棄資源，提高經(jīng)濟(jì)價(jià)值，延長(zhǎng)核桃加工產(chǎn)業(yè)鏈.

本實(shí)驗(yàn)以廢棄核桃殼為原料提取核桃殼色素，對(duì)不同方法提取的色素進(jìn)行體外抗氧化活性研究，為核桃殼色素作為天然抗氧化劑提供一定的理論支持.

1材料與方法

1.1　材料、儀器與設(shè)備

(1)材料：核桃殼,實(shí)驗(yàn)室廢棄核桃殼，清洗,40 ℃下烘干,粉碎后過(guò)80目篩；試驗(yàn)用水,純凈水，陜西省玉冰泉飲品有限公司；LSA-21樹脂,西安藍(lán)曉科技有限公司；磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、鄰苯三酚,分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；無(wú)水乙醇、鐵氰化鉀、三氯乙酸、三氯化鐵、硫酸亞鐵,分析純，天津市天力化學(xué)試劑有限公司；3、5-二硝基水楊酸,化學(xué)純，中國(guó)醫(yī)藥(集團(tuán))上海化學(xué)試劑公司；H2O2,分析純，天津市富宇精細(xì)化工有限公司；三羥甲基氨基甲烷,科昊生物工程有限公司；濃鹽酸,西安圣亞實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；DPPH·自由基,優(yōu)級(jí)純，sigma公司.

(2)儀器與設(shè)備：超聲波清洗器,KQ 5200E型，昆山市超聲儀器有限公司；電子天平,BS 323型、BS 224S型，賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器,RE-52A型，上海亞榮生化儀器廠；循環(huán)水式真空泵,SHZ-D (Ⅲ)型，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；可見分光光度計(jì),WFJ 7200型，尤尼柯(上海)儀器有限公司；冷凍干燥機(jī),FA-1A-50，上海比朗儀器公司.

1.2　實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1核桃殼色素的提取及初純化

取處理好的粉碎成80目核桃殼粉末5 g,以料液比1∶10加入60%乙醇，在70 ℃下超聲輔助提取(功率200 W, 頻率40 kHz)2次，每次40 min，過(guò)濾，合并濾液，濃縮，經(jīng)樹脂LSA-21純化，冷凍干燥得到醇提核桃殼色素粉末.取核桃殼粉5 g，料液比1∶20加入蒸餾水，在70 ℃下超聲輔助提取(功率160 W，頻率40 kHz)2次，每次40 min，以下同上，得到水提核桃殼色素粉末.冷藏備用.

1.2.2核桃殼色素的抗氧化性測(cè)定方法

(1)總還原力的測(cè)定

采用普魯士藍(lán)法，當(dāng)溶液中存在還原性物質(zhì)時(shí)，在酸性條件下，鐵氰化鉀能夠被還原成亞鐵氰化鉀，與鐵離子反應(yīng)形成普魯士藍(lán)，在700 nm有最大吸收峰.一般情況下，待測(cè)樣品的吸光值越大，其還原力越大，抗氧化性就越強(qiáng)[6].

根據(jù)李美利[7]的研究稍微改進(jìn)，取0.5 mL不同濃度的樣品于具塞試管中，加入0.60 mL 0.2 mol/L pH 6.6的PBS緩沖液，1.50 mL的1.0%鐵氰化鉀溶液，漩渦震蕩均勻，置于恒溫水浴鍋中，50 ℃，20 min，冷水快速冷卻，加3 mL的10%三氯乙酸，混勻取上清液3 mL，加5 mL蒸餾水、1 mL 0.1%三氯化鐵溶液，混勻，靜置10 min，在700 nm處測(cè)吸光度Ai.以1.50 mL蒸餾水代替鐵氰化鉀溶液，做空白組，測(cè)吸光度Aj.樣品的總還原力即為A=Ai-Aj.VC作為對(duì)照品，總還原力即為Ax.

(2)羥基自由基的清除能力測(cè)定

過(guò)氧化氫與Fe2+反應(yīng)生成·OH，加入具有清除能力的物質(zhì)，能夠與水楊酸競(jìng)爭(zhēng)，使有色物質(zhì)的生成量減少，有色物質(zhì)在510 nm有最大吸收峰.通過(guò)·OH清除能力的大小可以判斷待測(cè)樣品的抗氧化能力[8].

對(duì)陳偉等[9]的測(cè)定方法稍微改動(dòng)，取1 mL 10 mmol/L的硫酸亞鐵溶液于具塞試管中，加入2 mL 0.03%的過(guò)氧化氫溶液，2 mL不同濃度的樣品，混勻、靜置10 min，加2 mL 5 mmol/L的水楊酸-乙醇溶液，在恒溫水浴鍋中，37 ℃，30 min，在510 nm處測(cè)吸光度Ai.加樣品，不加水楊酸-乙醇溶液為樣品空白組，排除樣品本身顏色的干擾，測(cè)吸光度Aj；不加樣品，加水楊酸-乙醇溶液為空白組，測(cè)吸光度A0.VC作為對(duì)照組來(lái)比較效果.

式中,Ai:樣品組，加樣品和水楊酸的吸光度；Aj：樣品空白組，加樣品，無(wú)水楊酸時(shí)色素的吸光度；A0：空白組，不加樣品，有水楊酸時(shí)的色素吸光度.

(3)DPPH·清除能力測(cè)定

DPPH·自由基是一種穩(wěn)定的自由基，在517 nm處有最大吸收峰，其N上的一個(gè)游離電子，使其乙醇溶液呈紫色.當(dāng)加入抗氧化物質(zhì)后，自由基被清除，溶液顏色發(fā)生顯著變化，由紫色變?yōu)榈S色或者無(wú)色[10].DPPH·的乙醇溶液的褪色程度與抗氧化劑的強(qiáng)弱呈正向關(guān)系，因此可以通過(guò)顏色褪去程度來(lái)判斷物質(zhì)的抗氧化能力.

根據(jù)王標(biāo)詩(shī)[11]和李紫薇[12]等的研究稍微改動(dòng)，取2 mL不同濃度的核桃殼色素于具塞試管中，與50 mg/L DPPH·溶液混勻，避光放置30 min，以相對(duì)應(yīng)的溶劑為參比，在517 nm測(cè)吸光度Ai.取2 mL不同濃度的樣品于具塞試管中，與2 mL無(wú)水乙醇混勻，避光放置30 min，以相對(duì)應(yīng)的溶劑為參比，在517 nm測(cè)吸光度Aj.取2 mL DPPH·溶液于具塞試管中，與2 mL無(wú)水乙醇混勻，避光放置30 min，以無(wú)水乙醇為參比，在517 nm測(cè)吸光度A0.VC作為對(duì)照組，用來(lái)比較色素的抗氧化效果.

式中，Ai：樣品組，2 mL樣品+2 mL DPPH·溶液；Aj：樣品空白組，2 mL樣品+2 mL無(wú)水乙醇；A0：空白組，2 mL DPPH·溶液+2 mL無(wú)水乙醇.

(4)超氧陰離子自由基清除能力測(cè)定

鄰苯三酚在堿性條件下能夠迅速自動(dòng)氧化，釋放出超氧陰離子(O2-·)，生成的中間產(chǎn)物在420 nm有最大吸收波長(zhǎng).當(dāng)加入具有抗氧化性的物質(zhì)后，能夠與O2-·發(fā)生反應(yīng)，抑制鄰苯三酚的自動(dòng)氧化，使生成的有光吸收的中間產(chǎn)物減少[13].通過(guò)O2-·清除能力的大小可以判斷待測(cè)樣品的抗氧化效果.

根據(jù)何華等[14]的研究稍微改動(dòng)，取4.5 mL的50 mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH 8.5)于具塞試管中，在30 ℃下恒溫15 min，加1 mL不同濃度的樣品，再加入0.5 mL的25.0 mmol/L鄰苯三酚，混勻后30 ℃下恒溫反應(yīng)15 min，立即添加2~3滴8 mol/L HCl終止體系反應(yīng)，以蒸餾水為參比，在420 nm測(cè)吸光值A(chǔ)i.加樣品，不加鄰苯三酚為樣品空白組，測(cè)吸光度Aj，用來(lái)排除樣品自身顏色的干擾；不加樣品，加鄰苯三酚作為空白組，測(cè)吸光度A0.VC作為對(duì)照組，比較核桃殼色素的抗氧化效果.

式中,Ai：樣品組，加樣品和鄰苯三酚；Aj：樣品空白組，加樣品，不加鄰苯三酚；A0：空白組，不加樣品，加鄰苯三酚.

2結(jié)果與討論

2.1　核桃殼色素的總還原力測(cè)定

核桃殼色素總還原能力的測(cè)定，如圖1所示.

圖1　核桃殼色素的總還原力

由圖1可以看出，核桃殼色素濃度在0.4～1.2 mg/mL范圍內(nèi)，隨著濃度的升高，吸光值也逐漸升高，即表明核桃殼色素的總還原力隨著濃度的升高而增強(qiáng).VC的總還原能力與其濃度也是呈正相關(guān)關(guān)系.圖1同時(shí)表明，VC的抗氧化性最強(qiáng)，其次是醇提核桃殼色素，最后是水提核桃殼色素.

2.2　羥基自由基清除能力測(cè)定

羥基自由基(·OH)是氧化能力很強(qiáng)的自由基，可以通過(guò)電子轉(zhuǎn)移，奪取氫原子和一系列的氧化反應(yīng)，可以加速糖類、蛋白質(zhì)、脂類的氧化[15].過(guò)多的·OH具有很大的危害性，清除多余的·OH具有重要的意義.實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，核桃殼色素對(duì)·OH具有很好的清除效果，如圖2所示.

圖2　核桃殼色素對(duì)·OH清除作用

從圖2可以看出，醇提和水提核桃殼色素濃度在0.2～1.0 mg/mL范圍內(nèi)，隨著濃度的升高，·OH清除能力逐漸增強(qiáng).在1.0 mg/mL時(shí)，醇提色素和水提色素的·OH清除力分別能達(dá)到96.13%和95.60%，和VC的清除能力幾乎相當(dāng).·OH清除能力整體效果為VC>醇提色素>水提色素.

2.3　DPPH·清除能力測(cè)定

由圖3可知，VC、醇提和水提核桃殼色素三者對(duì)DPPH·的清除能力具有明顯的差異.

圖3　核桃殼色素對(duì)DPPH·清除作用

從圖3可以看出，隨著濃度的升高，三者對(duì)DPPH·的清除能力也隨之增強(qiáng).在0.01~0.05 mg/mL范圍內(nèi)，DPPH·的清除能力大小為VC>醇提色素>水提色素.在濃度為0.05 mg/mL時(shí)，醇提核桃殼色素對(duì)DPPH·的清除力能達(dá)到83.31%，而水提核桃殼色素僅有57.80%.因此在實(shí)際應(yīng)用方面，醇提色素要比水提色素具有更好的利用價(jià)值.

2.4　超氧陰離子自由基清除能力測(cè)定

實(shí)驗(yàn)表明，濃度在0.2～1.0 mg/mL之間，VC的清除能力與其是正相關(guān)關(guān)系，但是醇提和水提核桃殼色素均對(duì)O2-·沒(méi)有清除作用(數(shù)據(jù)略).實(shí)驗(yàn)結(jié)果同胡博路等[16]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果是一致的.

3結(jié)論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，醇提和水提核桃殼色素均有一定的抗氧化能力.在總還原力、·OH清除和DPPH·清除能力上，醇提核桃殼色素均要比水提核桃殼色素效果好，尤其是在對(duì)DPPH·清除方面.醇提和水提核桃殼色素對(duì)O2-·均沒(méi)有清除效果，則核桃殼色素的抗氧化能力可能主要通過(guò)對(duì)·OH的清除來(lái)實(shí)現(xiàn)的.本實(shí)驗(yàn)主要是對(duì)不同方法提取的核桃殼色素的抗氧化活性進(jìn)行了初步的探

究，而對(duì)核桃殼色素的具體成分及其化學(xué)性質(zhì)尚不明確，因此有待進(jìn)一步研究.

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【責(zé)任編輯：蔣亞儒】

Effects of different extraction methods on antioxidant

activity of walnut shell pigments

YI Jian-hua， WANG Liu-xu， DONG Wen-bin*， YANG Mei

(School of Food and Biological Engineering， Shaanxi University of Science & Technology， Xi′an 710021， China)

Abstract:Walnut shell pigments were extracted by water and ethanol with ultrasound-assistance under optimal conditions,respectively.Four methods (namely,total reducing power,hydroxyl free radical,DPPH free radical,superoxide anion radical) were used to investigate on the antioxidant activity of walnut shell pigments extracted by different methods and by taking VCas control.The results show that water extraction and ethanol extraction pigments have some antioxidant activity.Ethanol extracts have higher antioxidant activity than water extracts based on the total power,the hydroxyl radical scavenging,and DPPH radical scavenging;These pigments have no ability to scavenge superoxide anion radical.

Key words:walnut shell； pigments； antioxidant； radical

中圖分類號(hào)：TS202.3

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1000-5811(2016)01-0114-04

通訊作者:董文賓(1951-)，男，陜西寶雞人，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：天然產(chǎn)物化學(xué)，dongwb@sust.edu.cn

作者簡(jiǎn)介:易建華(1971-),女，河南信陽(yáng)人，副教授,研究方向：油脂與蛋白質(zhì)化學(xué)

基金項(xiàng)目：陜西省科技廳農(nóng)業(yè)科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目(2014K01-10-04)