陸洪省,徐瑩瑩,于夢夢，張慶瑩，王建燕，譚好臣

(山東科技大學 化學與環(huán)境工程學院,山東 青島　266590)

?

一株黃河三角洲鹽堿地耐鹽菌的分離、鑒定及耐鹽能力分析

陸洪省,徐瑩瑩,于夢夢，張慶瑩，王建燕，譚好臣

(山東科技大學 化學與環(huán)境工程學院,山東 青島266590)

摘要:從黃河三角洲鹽堿地土壤分離到一株耐高鹽菌株NM-1.對該菌株生理生化性質(zhì)、耐鹽性以及系統(tǒng)分類位置進行了分析.結(jié)果表明:菌株NM-1為長桿狀,革蘭氏陰性,菌落黃色,呈圓形,濕潤、光滑.能利用葡萄糖、乳糖和蔗糖,不能利用淀粉和明膠.生長pH范圍為8.0～10.0,最高耐鹽濃度(NaCl)為30%,為中度嗜鹽微生物,最適生長的Na2CO3濃度為0.25 M.16S rDNA 序列分析表明:該菌株與Halomonas variabilis (JN645866)以及Halomonas variabilis (AY204638)序列的相似性均為98%,結(jié)合其形態(tài)、生理生化性質(zhì),認定該菌株屬于耐鹽單胞菌屬,暫命名為Halomonas sp. NM-1(AB917466).

關(guān)鍵詞:鹽堿地;鹽單胞菌;分離鑒定

我國北方如黃河三角洲以及內(nèi)蒙古等地廣泛分布著大面積的鹽堿地,在這些高鹽環(huán)境中生長的微生物群體由于長期適應(yīng)環(huán)境,逐漸形成了極為特殊的耐鹽機制,具有很高的研究和利用價值.

目前,已發(fā)現(xiàn)的中度嗜鹽菌多為鹽單胞菌屬(Halomonas) 的革蘭氏陰性菌、好氣桿菌[1-3].該屬是1980 年Vreeland 等[4]鑒定出伸長鹽單胞菌(Halomonaselongate) 時首次提出的.也有其他科的好氧或兼性厭氧菌,包括革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽性菌、產(chǎn)甲烷菌和嚴格厭氧細菌.耐鹽單胞菌是一類能在絕對鹽度(NaCl) 為0%～ 32%條件下生長的耐鹽細菌.目前報道的鹽單胞菌屬細菌都生長在高鹽環(huán)境,如鹽場和鹽湖[5]、鹽水濕地[6]、鹽漬土[7]、海水[8]、海生生物[9]、深海熱液噴口[10]、鹽堿地[11].

作者從黃河三角洲鹽堿地土壤中分離一株高耐鹽菌,對其形態(tài)、生理生化性質(zhì)、耐鹽能力以及16S rDNA基因序列進行了解析,以期為開發(fā)和利用耐鹽菌種資源奠定一定的理論基礎(chǔ).

1材料與方法

1.1試樣及培養(yǎng)基

土壤樣品采集于黃河三角洲鹽堿地,共選取11個采樣點,將各點表層(3～30 cm)土壤采集后混勻,立即裝入滅菌的密封袋中,土樣帶回實驗室后立即對菌進行富集和分離.剩余樣品儲存于4 ℃冰箱中待用.

富集培養(yǎng)基成分: (NH4)2SO41 g,K2HPO47 g, KH2PO43 g, MgSO4·7H2O 0.1 g, 葡萄糖10 g, 蒸餾水1 000 mL.分離培養(yǎng)基成分:酵母膏 10 g,蛋白胨7.5 g,檸檬酸鈉3.0 g,KCl 2.0 g,MgSO4·7H2O 0.2 g,FeSO4·7H2O 0.036 g,NaCl 20.0 g,Na2CO310.0 g,蒸餾水1 000 mL,pH用鹽酸或氫氧化鈉調(diào)節(jié).富集培養(yǎng)基及分離培養(yǎng)基均在121 ℃滅菌20 min 后使用,制備固體平板培養(yǎng)基時加入15 g·L-1瓊脂,制備半固體培養(yǎng)基時加入2 g·L-1瓊脂.

1.2耐鹽細菌的富集、分離和篩選

稱量5 g土樣加入盛有45 mL無菌水的燒杯中,攪拌,使土壤溶解,靜置20 min,取土壤浸出液10 mL加入盛有200 mL已滅菌的富集培養(yǎng)基中,恒溫振蕩培養(yǎng)6 d(130 r·min-1,30 ℃),取3 mL上述培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接到新鮮的富集培養(yǎng)基中,重復(fù)培養(yǎng)3次,培養(yǎng)條件同上,得到耐鹽堿細菌富集液.

1.3生理生化性質(zhì)測定

對上述純化得到的單菌落用耐鹽菌富集液體培養(yǎng)基進行富集培養(yǎng),得到富集培養(yǎng)液,對其生理生化性質(zhì)進行測定,測定指標包括革蘭氏染色、MR實驗、V.P實驗、明膠水解實驗、淀粉水解實驗、糖發(fā)酵實驗、H2O2酶測定,操作方法見參考文獻[1].

1.4不同pH對耐鹽堿菌生長的影響

所用培養(yǎng)基為富集培養(yǎng)基.用NaOH調(diào)整培養(yǎng)基pH分別為8、9、10、11和12.分裝150 mL于250 mL三角瓶中,121 ℃滅菌20 min,冷卻,然后接種1.5 mL富集培養(yǎng)液(109cfu·mL-1).培養(yǎng)條件為恒溫振蕩培養(yǎng)(130 r·min-1,30 ℃),每隔24 h定期取培養(yǎng)液,測定其吸光度(OD),波長采用560 nm,平行測定3個重復(fù).

1.5不同NaCl濃度對菌生長的影響

向富集培養(yǎng)基中加入NaCl,分別配制成含10%、20%和30%的NaCl溶液,調(diào)整pH為9.0,接種、培養(yǎng)以及吸光度測定均同1.4,平行測定3個重復(fù).

1.6不同Na2CO3濃度對菌株生長的影響

向富集培養(yǎng)基中加入不同質(zhì)量的Na2CO3,使Na2CO3濃度分別為0、0.2、0.25、0.3 M,121 ℃滅菌20 min,接種富集培養(yǎng)液并定期測定菌液吸光度OD560,培養(yǎng)條件及測定方法同1.4,平行做3個重復(fù).

1.7耐鹽菌DNA的提取、PCR反應(yīng)及系統(tǒng)樹的創(chuàng)建

1.7.1細菌DNA提取

采用UNIQ-10柱式細菌基因組抽提試劑盒(上海生物工程有限公司)對菌株進行DNA提取,提取步驟按照試劑盒說明書進行.

1.7.2引物

采用細菌16S rDNA通用引物進行PCR擴增,引物序列:7F:5'-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3';1 540R:5'-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3'.

1.7.3PCR反應(yīng)條件

1.7.4系統(tǒng)發(fā)育樹的創(chuàng)建及分類學位置的確定

利用DDBJ (DNA Data Bank of Japan, http://www.ddbj.nig.ac.jp/)數(shù)據(jù)庫,把分離菌株測得的16S rDNA序列進行序列比較,與相似度高的16S rDNA序列創(chuàng)建系統(tǒng)發(fā)育樹,所用軟件為CustalX2.1和Mega5 (Molecular Evolutionary Genetics Analysis),系統(tǒng)進化距離矩陣根據(jù)Kimura模型估算[12],創(chuàng)建方法為鄰接法(Neighbor-Joining)[13-15].

2實驗結(jié)果與討論

2.1耐鹽菌生理生化性質(zhì)

菌株NM-1為長桿狀,革蘭氏陰性,在耐鹽堿分離培養(yǎng)基上,菌落呈圓形、濕潤、光滑,菌落為黃色,可利用葡萄糖、乳糖和蔗糖,氧化酶以及過氧化氫酶陽性,理化性質(zhì)見表1.

表1　菌株NM-1生理生化性質(zhì)

注：“+”為陽性;“-”為陰性

2.2不同pH對菌株生長的影響

在不同pH(8.0、9.0、10.0、11.0、12.0)條件下, 利用耐鹽菌富集培養(yǎng)基對菌株NM-1進行培養(yǎng),每隔24 h測定培養(yǎng)液吸光度,繪制成時間-吸光度曲線,結(jié)果如圖1所示.

由圖1可以看出,在pH 為8.0、9.0 和10.0條件下,菌株NM-1的最大吸光度接近,分別為0.76、0.74和0.64,遠遠高于pH 為11.0和12.0 條件下的吸光度,因此,菌株NM-1的最適pH生長范圍為8.0～10.0.

2.3不同NaCl濃度對菌株生長的影響

將菌株NM-1在含有10%、30%和50% NaCl的富集培養(yǎng)基中培養(yǎng),每隔24 h測定其吸光度OD560,繪制生長曲線如圖2所示.

由圖2可以看出,菌株NM-1在NaCl濃度為10% 和30%條件下,均在培養(yǎng)4 d時吸光度達到最大值,分別為0.98和0.96.而4 d后,菌株NM-1在NaCl濃度為30%條件下的吸光度明顯下降至0.75.而在NaCl濃度為50%的培養(yǎng)條件下,菌株NM-1的生長停滯期明顯延長,吸光度變化很小,且培養(yǎng)3 d時出現(xiàn)最大吸光度.因此,該菌株最大耐受NaCl的濃度為30%,為中度嗜鹽微生物.

2.4不同Na2CO3濃度對菌的生長的影響

分別配制含有0.2、0.25、0.3 M Na2CO3的富集培養(yǎng)基,將菌株NM-1在30 ℃條件下振蕩培養(yǎng),每24 h測定培養(yǎng)液吸光度,繪制生長曲線如圖3 所示.

由圖3可以看出,菌株NM-1在Na2CO3濃度為0.25 M條件下,吸光度最大,均高于0.2 M和0.3 M條件下的吸光度,而在0.3 M Na2CO3濃度下,吸光度最小,且基本沒有變化,因此,菌株NM-1生長的最適Na2CO3濃度為0.25 M.

2.5細菌系統(tǒng)發(fā)育樹

菌株NM-1 16S r RNA 序列長度為1 415 bp.將序列進行BLASTn 比對及利用CustalX2.1和Mega5 軟件構(gòu)建系統(tǒng)樹,如圖4 所示.

由圖4可以看出,菌株NM-1 16S r RNA序列與Halomonasvariabilisstrain SL121(JN645866)以及HalomonasvariabilisstrainHTG7(AY204638)序列的相似度最高,均為98%,且三者同在一個分支上,結(jié)合菌株NM-1所處的系統(tǒng)樹位置,初步判定菌株NM-1應(yīng)為鹽單胞菌屬(Halomonassp.).

3結(jié)束語

鹽單胞菌屬(Halomonas) 屬于鹽單胞菌科, 為革蘭氏陰性、好氣桿菌, 能在鹽度為0%～ 32% (w/v) 條件下生長.作者從黃河三角洲鹽堿地土壤中分離到一株耐鹽堿菌株NM-1.該菌株生長最適pH范圍為8.0～10.0,最大耐受NaCl的濃度為30%,為中度嗜鹽微生物,生長的最適Na2CO3濃度為0.25 M.該菌株形態(tài)特征及生理生化性質(zhì)與耐鹽單胞菌屬基本一致,與鹽單胞菌屬的幾個相近種相同的特征有:革蘭氏陰性,氧化酶、過氧化氫酶陽性,具反硝化作用,淀粉水解陰性.結(jié)合菌株16S rDNA序列相似度以及系統(tǒng)分類學位置,基本判定菌株NM-1屬于耐鹽單胞菌屬(Halomonassp.),建議命名為Halomonassp. NM-1(AB917466).

參考文獻：

[1]Garrity G M, Bell J A，Lilburn T G.Taxonomic outline of the prokaryotes.Bergey’s manual of systematic bacteriology[M].2nd ed.New York：Springer-Verlag，2004.

[2]Mata J A，Martínez-Cánovas J，Quesada E，et al.A detailed phenotypic characterisation of the type strains ofHalomonasspecies[J].Systematic and Applied Microbiology,2002,25(3):360-375.

[3]Louis P，Galinski E A.Characterization of genes for the biosynthesis of the compatible solute ectoine fromMarinococcushalophilusand osmoregulated expression inEscherichiacoli[J].Microbiology,1997,143(4):1141-1149.

[4]Vreeland R H，Litchfield C D，Martin E L，et al.Halomonaselongata，a new genus and species of extremely salt-tolerant bacteria[J].International Journal of Systematic Bacteriology,1980,30(2):485-495.

[5]Franzmann P D，Burton H R，McMeekin T A.Halomonassubglaciescola，a new species of halotolerant bacteria isolated from Antarctica[J].International Journal of Systematic Bacteriology,1987,37(1):27-34.

[6]Martínez-Cánovas M J，Quesada E，Llamas I，et al.Halomonasventosaesp.nov.，a moderately halophilic，denitrifying，exopolysaccharide-producing bacterium[J].International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology,2004,54(3):733-737.

[7]García M T，Mellado E，Ostos J C，et al.Halomonasorganivoranssp.nov.，a moderate halophile able to degrade aromatic compounds[J].International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology,2004,54(5):1723-1728.

[8]Yoon J H，Choi S H，Lee K C，et al.Halomonasmarisflavaesp.nov.，a halophilic bacterium isolated from the Yellow Sea in Korea[J].International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology,2001,51(3):1171-1177.

[9]Yoon J H，Lee K C，Kho Y H，et al.Halomonasalimentariasp.nov.，isolated from jeotgal，a traditional Korean fermented seafood[J].International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology,2002,52(1):123-130.

[10]Kaye J Z，Márquez M C，Ventosa A，et al.Halomonasneptuniasp.nov.，Halomonassulfidaerissp.nov.，Halomonasaxialensissp.nov.andHalomonashydrothermalissp.nov.：Halophilicbacteriaisolated from deep-sea hydrothermal-vent environments[J].International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology,2004,54(2):499-511.

[11]Berendes F，Gottschalk G，Heine-Dobbernack E，et al.Halomonasdesideratasp.nov，a new alkaliphilic，halotolerant and denitrifying bacterium isolated from a municipal sewage works[J].Systematic and Applied Microbiology,1996,19(2):158-167.

[12]Kimura M. A simple method for estimating evolutionary rates of base substitutions through comparative studies of nucleotide sequences[J].Journal of Molecular Evolution,1980,16(2):111-120.

[13]Pearson W R，Lipman D J.Improved tools for biological sequence comparison[J].Proceedings of the National Academy of Sciences,1988,85(8):2444-2448.

[14]Saitou N，Nei M.The neighbor-joining method：a new method for reconstructing phylogenetic trees[J].Molecular Biology and Evolution,1987,4(4):406-425.

[15]Felsenstein J.Confidence limits on phylogenies：an approach using the bootstrap[J].Evolution,1985,39(4):783-791.

(責任編輯于敏)

The isolation of a halotolerant bacteria from Yellow River Delta

saline-alkali soil and the analysis of its salt tolerant capability

LU Hong-sheng, XU Ying-ying, YU Meng-meng, ZHANG Qing-ying,

WANG Jian-yan, TAN Hao-chen

(College of Chemical and Environmental Engineering,Shandong University of Science

and Technology, Qingdao 266590, China)

Abstract:A high salt tolerant strain NM-1 was isolated from Yellow River Delta saline-alkali soil and was characterized for its morphology, biochemical properties, the growth under different concentration of NaCl and Na2CO3, and 16S rDNA sequences. The results showed that strain NM-1 was gram negative, rods. Colonies were yellow, round, moist and smooth. Strain NM-1 could utilize glucose, lactose and sucrose, not starch and gelatine. The growth pH ranges was from 8.0 to 10.0. The tolerant concentration of NaCl for strain NM-1 reached up to 30%. The optimum concentration of Na2CO3for strain NM-1 to grow was 0.25 M. 16S rDNA sequences analysis proved the high homology of 98% between strain NM-1 with Halomonas variabilis (AY204638) and Halomonas variabilis (JN645866). Based on its morphology and biochemical properties, strain NM-1was regarded as one member of Halomonas genus and named as Halomonas sp. NM-1(AB917466).

Key words:saline-alkali soil; Halomonas; isolation and identification

中圖分類號：X703

文獻標志碼:A

文章編號:1000-2162(2015)04-0103-06

作者簡介：陸洪省(1972-),男,山東沂水人，山東科技大學副教授，博士(后),碩士生導師.

基金項目:山東省博士后創(chuàng)新基金資助項目(201201008)

收稿日期：2014-12-05

doi:10.3969/j.issn.1000-2162.2015.04.018