李 娟，馮亞蘭，吳東輝，徐曉芃，曠 翎， 馮 浩

惡性黑素瘤組織iNOS的表達與血管增生研究

李 娟，馮亞蘭，吳東輝，徐曉芃，曠 翎， 馮 浩

[摘要]目的 探討惡性黑素瘤組織中iNOS表達與增生及臨床資料相關(guān)性。方法 收集30例惡性黑素瘤患者皮損組織和20例色素痣患者的皮損組織，采用免疫組化檢測惡性黑素瘤和色素痣組織中iNOS的表達，并與患者臨床資料進行分析，同時觀察其與癌細胞增生、血管生成的關(guān)系。結(jié)果 iNOS表達陽性率在惡性黑素瘤組織中比色素痣組織高(P＜0.05)，惡性黑素瘤iNOS表達在患者年齡、性別、部位中差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P ＞0.05）。病理分期Ⅲ～Ⅳ期患者iNOS陽性率顯著高于Ⅰ～Ⅱ期（P＜0.05）。iNOS陽性腫瘤患者細胞增生核抗原（PCNA）標志指數(shù)（PLI）和微血管密度（MVD）的值明顯高于iNOS陰性腫瘤患者（P＜0.01）。結(jié)論 iNOS能促進惡性黑素瘤細胞增生與血管形成，是惡性黑素瘤的重要調(diào)節(jié)因子。

[關(guān)鍵詞]黑素瘤，惡性；iNOS；細胞增生核抗原；血管生成

[中圖分類號]R758.24

[文獻標識碼]A

[文章編號]1674-1293(2015)05-0329-03

DOI：10.11786/sypfbxzz.1674-1293.20150504

基金項目：湖南省自然科學(xué)基金青年基金項目(09JJ4011)，湖南省人民醫(yī)院仁術(shù)科研基金項目

作者簡介：李娟，醫(yī)學(xué)碩士，主治醫(yī)師，研究方向：銀屑病、黑素瘤，E-mail: juanlee0731@163.com

通訊作者：馮浩，E-mail: doctorfenghao@126.com

[Abstract]Objective To investigate the expression of iNOS in malignant melanoma(MM) and its correlation with the cancer cell proliferation, angiogenesis and clinical data, as well as its effects on the development of MM. Methods Total 30 cases of MM tissues and 20 cases of nevus were collected, and the immunohistochemical method was adopted to detect the expression of iNOS, then the clinical data were analyzed, finally the relationship between the cancer cell proliferation and angiogenesis was observed. Results The positive rate of iNOS in MM was higer than that of nevus group (P<0.05). In MM group, there was no relevance between the expression of iNOS and the gender, location and tumor growth pattern (P>0.05). The iNOS positive rate of pathological staging III-IV was significantly higher than that of I-II (P<0.05). The PLI and MVD value of iNOS positive tumors was obviously higher than that of iNOS negative tumors (P<0.01). Conclusion The expression of iNOS can promote the proliferation of cancer cells and vessel formation in MM, which is an important regulatory factor in tumor biological behavior.

收稿日期（2015-05-15 修回日期 2015-07-06）

作者單位：100084，北京市上地醫(yī)院皮膚科（李娟）；湖南省郴州市第一人民醫(yī)院（馮亞蘭）；湖南省人民醫(yī)院（吳東輝，徐曉芃，曠翎， 馮浩）

The relationship between the cancer cell proliferation, angiogenesis and the expression of iNOS in malignant melanoma

LI Juan，F(xiàn)ENG Ya-lan，WU Dong-hui，et al
Department of Dermatology, Shangdi Hospital of Beijing, Beijing 100084, China

[Key words]Melanoma，malignant；iNOS；Proliferating cell nuclear antigen；Angiogenesis

[J Pract Dermatol, 2015, 8(5):329-331]

誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase, iNOS)可能與黑素瘤的進展相關(guān)。本研究主要探討其在惡性黑素瘤組織中的表達及與癌細胞增生、血管生成的關(guān)系，以及與臨床資料的相關(guān)性，現(xiàn)總結(jié)如下。

1　資料和方法

1.1 臨床資料

收集2011年1月—2014年6月湖南省人民醫(yī)院，長沙市中醫(yī)醫(yī)院與長沙市馬王堆療養(yǎng)院門診及住院確診為惡性黑素瘤的患者30例，其中男17例，女13例。平均年齡51歲 （29 ～82）歲，平均病程10個月（2個月～3年）。惡性黑素瘤TNM分期（AJCC 第7版），Ⅰ～Ⅱ期10例；Ⅲ～Ⅳ期20例。對照組20例為我院皮膚科與整形外科門診就診的色素痣患者，其中男11例，女9例。平均年齡46歲（18～62）歲。兩組患者的年齡、性別差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），

具有可比性。所有患者切除的皮損組織即刻置入4%甲醛液固定過夜，常規(guī)石蠟包埋，4 μm切片覆于多聚賴氨酸處理過的玻片上備用。

1.2 方法

iNOS抗體購自Labvision公司；免疫組化試劑盒購自福州邁新生物技術(shù)公司。采用Envision兩步法進行免疫組化檢測，陽性結(jié)果判定根據(jù)陽性細胞計數(shù)和陽性細胞染色強度判定。觀察患者一般資料、腫瘤部位、生長方式、TNM分期與iNOS表達的相關(guān)性。

細胞增生核抗原（PCNA）陽性為絕大多數(shù)陽性細胞的胞核染色呈棕褐色顆粒狀或彌散性，也有部分胞質(zhì)著色。觀察500個腫瘤細胞，PCNA 陽性細胞數(shù)所占的百分數(shù)即為PCNA標志指數(shù)（PLI）。微血管密度（MVD）標準按照Weidner法[1]計算腫瘤著色的毛細血管及微血管，在切片中隨機選取20個高倍視野（HP），分別計算出這20個視野中的血管數(shù)，取其平均值，為該例患者的MVD。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS19.0進行統(tǒng)計學(xué)處理，組間陽性率比較采用卡方檢驗，P＜0.05認為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1 惡性黑素瘤患者iNOS表達及與臨床相關(guān)性

30例惡性黑素瘤患者中，iNOS陽性21例（70%），20例色素痣患者中iNOS陽性8例（40%），兩組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=4.433，P=0.035）。惡性黑素瘤iNOS表達在年齡、性別、部位中差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。而惡性黑素瘤患者病理分期Ⅲ～Ⅳ期者iNOS 陽性率顯著高于Ⅰ～Ⅱ期，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（表1，圖1）。

表1　惡性黑素瘤患者iNOS表達與臨床資料相關(guān)性[例(%)]

2.2 惡性黑素瘤患者iNOS表達與PLI 關(guān)系

iNOS陽性患者皮損PLI的值為（88.54 ±3.82）%，高于iNOS陰性者（77.13±4.01）%，兩者比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（t=7.395，P＜0.01）。

iNOS陽性患者皮損MVD值為（51.77 ±4.24）個/mm2，高于iNOS陰性者（41.81 ±5.20）個/mm2，兩者比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（t=5.514，P＜0.01）。

3　討論

一氧化氮(NO)是一種多效且重要的生物調(diào)控遞質(zhì)，參與血管舒張、神經(jīng)傳遞和細胞毒性等多種生物學(xué)過程[2]。NO由L-精氨酸產(chǎn)生，首次在內(nèi)皮細胞和巨噬細胞中發(fā)現(xiàn)，在髓樣細胞和其他細胞類型中，炎性細胞因子或細菌脂多糖刺激可引起NO合酶的同種型（iNOS）表達，產(chǎn)生大量的NO。但NO對腫瘤的影響存在兩個不同方向，極高水平的NO對腫瘤細胞有細胞毒性作用，細胞內(nèi)NO低水平可促進腫瘤進展和存活，以及誘導(dǎo)抗凋亡效果。iNOS可由炎癥刺激因子等作用而產(chǎn)生出大量的NO，從而參與機體的病理生理過程，與許多腫瘤如肺癌[3]、胰腺癌等的進展及患者低存活率相關(guān)。

本研究發(fā)現(xiàn)iNOS在皮膚惡性黑素瘤中陽性表達率為70%，明顯高于其在色素痣中的表達（P＜0.05）。有研究顯示其在皮膚惡性黑素瘤中陽性表達率大約為47.7%[4]，這比本研究結(jié)果稍低，可能與地區(qū)、人種、樣本數(shù)等差異有關(guān)。同時本研究還發(fā)現(xiàn)iNOS的表達在患者年齡、性別、腫瘤發(fā)病部位中均無差異（P

＞0.05），而與TNM分期有相關(guān)性（P＜0.05）。而TNM分期對指導(dǎo)患者的治療及觀察患者的預(yù)后有著十分重要的作用。

圖1　惡性黑素瘤患者皮損組織病理（SP法）

iNOS 誘導(dǎo)產(chǎn)生高水平的NO，NO有助于血管生成和促進腫瘤進展。并且NO使血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)產(chǎn)生增多，而VEGF需要NO持續(xù)釋放才能保證血管形成，并依靠NO環(huán)鳥苷酸途徑促進腫瘤細胞VEGF釋放的活力[5]。人體內(nèi)腫瘤生長依賴于血管生成與再生，觀察腫瘤內(nèi)微血管生成狀況及MVD有助于判斷腫瘤患者的預(yù)后[7,8]。本研究顯示，iNOS表達陽性患者皮損MVD高于iNOS表達陰性者（P ＜0.01)，表明iNOS 可能通過促進腫瘤血管生成在皮膚惡性黑素瘤中起到一定的作用。iNOS的表達亦被認為是腫瘤生物學(xué)行為中重要的調(diào)節(jié)因子[6]。

PCNA是一種與細胞增生有關(guān)的細胞周期蛋白，它參與細胞增生過程中的DNA復(fù)制。在細胞周期不同階段表達結(jié)果也不同，尤其在細胞周期G1 期和S期表達最強。因此觀察PCNA的表達情況能反映DNA合成與細胞增生情況。其對預(yù)測腫瘤的預(yù)后有著重要的作用。本研究顯示iNOS陽性患者皮損PLI值明顯高于iNOS陰性者（P＜0.01）。

綜上所述，iNOS在惡性黑素瘤發(fā)生、增生、凋亡、轉(zhuǎn)移和治療中起著重要的作用，但仍需臨床工作者不斷深入探討，從而為治療惡性黑素瘤提供新的思路和方法。

【參 考 文 獻】

[1]Weidner N, Semple JP, Welch WR, et al. Tumor angiogenesis and metastasis-correlation in invasive breast carcinoma [J]. N Engl J Med, 1991, 324(1):1-8.

[2]陶娟, 涂亞庭. 黑素瘤eNOS 和VEGF 的表達及其與腫瘤血管生成的關(guān)系 [J]. 中華皮膚科雜志, 2004, 37(10):575-577.

[3]Thomsen LL, Miles DW, Happerfield L, et al. Nitric oxide synthase activity in human breast cancer [J]. Br J Cancer, 1995, 72(1):41-44.

[4]Ekmekcioglu S, Ellerhorst JA, Prieto VG, et al. Tumor iNOS predicts poor survival for stage III melanoma patients [J]. Int J Cancer, 2006, 119(4):861-866..

[5]Joukov V, Pajusola K, Kaipainen A, et al. A novel vascular endothelial growth factor, VEGF-C, is a ligand for the Flt4 (VEGFR-3) and KDR (VEGFR-2) receptor tyrosine kinases [J]. EMBO J, 1996, 15(2):290-298.

[6]王瑩, 李文媛, 劉艷翠, 等. iNOS表達與喉癌組織中淋巴管生成及血管生成的相關(guān)性分析 [J]. 海南醫(yī)學(xué)院學(xué)報, 2012, 18(3):301-304.

[7]Niermann KJ, Fleischer AC, Huamani J, et al. Measuring tumor perfusion in control and treated murine tumors: correlation of microbubble contrast-enhanced sonography to dynamic contrastenhanced magnetic resonance imaging and fluorodeoxyglucose positron emission tomography [J]. J Ultrasound Med, 2007, 26(6):749-756.

[8]譚先杰, 郎景和, 樓偉珍, 等. 卵巢上皮癌組織微血管密度及血管形成相關(guān)分子的檢測及預(yù)后價值 [J]. 中華腫瘤雜志, 2008, 30(4):274-278.

（本文編輯 耿建麗）