鐘珊珊 何洋 劉廣志

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視神經(jīng)脊髓炎動(dòng)物模型制備的研究進(jìn)展

鐘珊珊 何洋 劉廣志

視神經(jīng)脊髓炎(neuromyelitis optica，NMO)是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)炎性脫髓鞘性疾病，目前主要認(rèn)為是由水通道蛋白(aquaporin4，AQP4)抗體(即NMO-IgG抗體)所介導(dǎo)的自身免疫應(yīng)答所致。目前NMO病因尚未完全明確，其動(dòng)物模型的建立將有助于進(jìn)一步開展發(fā)病機(jī)制和疾病干預(yù)的研究。因此，本文將對(duì)NMO的動(dòng)物模型，包括NMO/實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE)模型、NMO特異性抗體/補(bǔ)體經(jīng)顱注射模型、細(xì)胞因子經(jīng)顱注射模型和特異性AQP4反應(yīng)性T細(xì)胞誘導(dǎo)模型的研究進(jìn)展作一綜述。

視神經(jīng)脊髓炎；水通道蛋白4；視神經(jīng)脊髓炎IgG；實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎

視神經(jīng)脊髓炎(neuromyelitis optica，NMO)，亦稱Devic病，是一種發(fā)生于中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)炎性脫髓鞘疾病[1]。目前NMO病因尚未完全明確，多被認(rèn)為是主要由“NMO-IgG”抗體 〔后經(jīng)Lennon等[2]證實(shí)為水通道蛋白4(aquaporin4，AQP4)抗體(Ab)〕所介導(dǎo)的自身免疫應(yīng)答所致，因此其動(dòng)物模型的建立必將有助于更深入地開展發(fā)病機(jī)制和疾病干預(yù)的研究。目前針對(duì)鼠科動(dòng)物已成功地建立了多種誘導(dǎo)NMO的方法，包括NMO/實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE)模型、NMO特異性抗體/補(bǔ)體(AQP4 Ab/C)經(jīng)顱注射模型、細(xì)胞因子經(jīng)顱注射模型和特異性AQP4反應(yīng)性T細(xì)胞誘導(dǎo)模型等。據(jù)此，本文針對(duì)上述NMO動(dòng)物模型制備的進(jìn)展作一綜述。

1 NMO發(fā)病機(jī)制及臨床、病理學(xué)特點(diǎn)

2004年Lennon等[2]報(bào)道于NMO患者體內(nèi)發(fā)現(xiàn)一種特異性抗體“NMO-IgG”，隨后經(jīng)細(xì)胞免疫熒光法證實(shí)其靶抗原為AQP4。目前認(rèn)為NMO的發(fā)病機(jī)制過程可能為：某外源性抗原激活免疫系統(tǒng)AQP4反應(yīng)性T細(xì)胞，促使B細(xì)胞產(chǎn)生AQP4 Ab，透過血-腦屏障(blood brain barrier，BBB)與位于星型膠質(zhì)細(xì)胞足突上的AQP4分子結(jié)合，激活補(bǔ)體級(jí)聯(lián)反應(yīng)，破壞BBB完整性，導(dǎo)致AQP4抗體以及其他致病因子進(jìn)入至CNS內(nèi)，激活中性粒細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞，從而產(chǎn)生血管周圍炎性反應(yīng)并進(jìn)一步損害少突膠質(zhì)細(xì)胞，最終導(dǎo)致CNS組織破壞[3]。

NMO臨床上主要表現(xiàn)為急性橫貫性或播散性脊髓炎，同時(shí)或繼發(fā)視神經(jīng)炎。病理學(xué)上表現(xiàn)為脊髓較長(zhǎng)節(jié)段的廣泛脫髓鞘并伴有壞死和囊樣改變、軸索損傷，典型病變位于脊髓中央部位，而周邊髓鞘保留。鏡下顯示為病灶內(nèi)血管數(shù)量增加、管壁增厚，少突膠質(zhì)細(xì)胞顯著脫失，軸索腫脹和變性；在急性活動(dòng)性病灶內(nèi)，有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，血管周圍可見由抗體(主要是IgM)和補(bǔ)體聚集成的“玫瑰花環(huán)”樣改變及血管壁的玻璃樣變性[2]。視神經(jīng)或視交叉處可見腫脹或增粗、髓鞘脫失和輕度的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)[3]。

2 NMO動(dòng)物模型

2.1 NMO/EAE模型 此模型制備原理是在EAE模型基礎(chǔ)上，進(jìn)一步將特異性AQP4 Ab注入實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)以誘導(dǎo)NMO發(fā)生。眾所周知，EAE是由特異性致敏T細(xì)胞介導(dǎo)的CNS脫髓鞘性自身免疫病，可經(jīng)主動(dòng)免疫或被動(dòng)免疫兩種誘導(dǎo)方式，前者是將溶解于佐劑的MS特異性抗原〔如髓鞘堿性蛋白(MBP)、髓鞘少突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白(MOG)、蛋白脂質(zhì)蛋白(PLP)〕注入動(dòng)物體內(nèi)，誘發(fā)抗原特異性T細(xì)胞產(chǎn)生；后者是將已被特異性抗原激活的特異T細(xì)胞轉(zhuǎn)移至特定基因敲除鼠體內(nèi)進(jìn)行誘導(dǎo)。當(dāng)動(dòng)物出現(xiàn)EAE臨床癥狀(如體質(zhì)量減輕、肢體癱瘓等異常行為)時(shí)，提示鼠BBB的通透性改變，進(jìn)一步向腦組織內(nèi)注入人AQP4 Ab即可致病。

NMO/EAE模型主要制備步驟：(1)EAE模型的誘導(dǎo)，視動(dòng)物品系采用不同的誘導(dǎo)抗原肽段，Lewis大鼠選擇MBP68-86或MBP82-99肽段[4]，C57BL/6小鼠則多為MOG35-55[5]。Lewis大鼠采用不完全福氏佐劑(IFA)加入結(jié)核分枝桿菌制備成完全福氏佐劑(CFA)，而后與等體積含MBP磷酸鹽緩沖液(PBS，PH7.4)混勻制備免疫乳劑，通過尾靜脈注入體內(nèi)[6]；C57BL/6小鼠則將MOG35-55稀釋，與CFA混勻后制成油包水乳狀抗原，于背部脊柱兩側(cè)分四點(diǎn)皮下注射MOG抗原，百日咳毒素(PTX)可同時(shí)及48 h后腹腔內(nèi)注射[5]。(2)NMO模型的建立：在免疫后10～14 d，Lewis大鼠剛開始出現(xiàn)EAE臨床病情變化(如尾部無力拖垂、步履蹣跚、后肢癱瘓和行走困難等表現(xiàn))，連續(xù)4 d于大鼠腹腔內(nèi)注射10 mg NMO患者IgG，即可誘導(dǎo)出NMO癥狀[7]。

與EAE模型不同，成功建立NMO/EAE模型的Lewis大鼠CNS病變區(qū)域鏡下可見AQP4 Ab特異性結(jié)合于星型角質(zhì)細(xì)胞表面，與沉積于血管周圍的補(bǔ)體形成類似NMO患者的特征型的“玫瑰花環(huán)”樣改變，進(jìn)一步引起星型膠質(zhì)細(xì)胞的破壞等變化，后期可見及髓鞘變性和脫失[7-8]。

NMO/EAE模型是一種研究NMO較為理想的模型，但仍存在一定局限性。首先，制作該模型需要較高劑量的NMO患者IgG，每只Lewis大鼠需10 mg/d[6]，C57BL/6小鼠則需2 mg/d[9]。其次，人鼠間存在致病性T細(xì)胞亞群的差異[7]，如Lewis鼠由Ⅰ型輔助性細(xì)胞(Th1)介導(dǎo)，而人類亦可由Th17致病，因此，利用大鼠NMO/EAE模型并不能完全模擬人體NMO的發(fā)病機(jī)制。

2.2 AQP4 Ab/C經(jīng)顱內(nèi)注射誘導(dǎo)的NMO模型 此模型制備原理是將人AQP4 Ab及補(bǔ)體直接注入鼠大腦半球或腦室內(nèi)致病，而毋須BBB通透性改變。制備步驟如下：將分離獲取的AQP4 Ab陽(yáng)性NMO患者的IgG，用PBS稀釋為濃度為6～38 mg/mL，取16.8 μL IgG和11.2 μL人補(bǔ)體，利用腦立體定位儀定位，對(duì)野生AQP4免疫缺陷小鼠行腦室內(nèi)注射，即可誘導(dǎo)出NMO癥狀[8]。

注射后12 h可見小鼠AQP4表達(dá)下降、星型膠質(zhì)細(xì)胞水腫、髓鞘崩解和軸索破壞[3]；7 d后可見血管周圍大量的補(bǔ)體沉積、星型膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目減少、長(zhǎng)節(jié)段的髓鞘脫失、神經(jīng)元壞死和大量的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，以單核和多核粒細(xì)胞為主。

此模型毋須T細(xì)胞激活，將人AQP4 Ab和補(bǔ)體注入T細(xì)胞缺失裸鼠，亦可見炎性細(xì)胞聚集、AQP4表達(dá)減少和髓鞘脫失[8]。相對(duì)于NMO/EAE模型，此模型對(duì)AQP4 Ab需求量較低，但亦有一定局限性，如單憑人抗體無法結(jié)合和激活鼠補(bǔ)體系統(tǒng)，須同時(shí)添加人補(bǔ)體，從而無法模擬生理狀態(tài)下鼠補(bǔ)體激活以及產(chǎn)生補(bǔ)體抑制因子的過程。此外，反復(fù)多次腦內(nèi)注射亦會(huì)影響CNS組織對(duì)炎性刺激的敏感性[4]。

2.3 細(xì)胞因子經(jīng)顱內(nèi)注射誘導(dǎo)的NMO模型 此模型制備原理是基于Bradl等[3]提出的“在AQP4 Ab和補(bǔ)體存在的前提下，促炎性細(xì)胞因子亦會(huì)促進(jìn)損傷形成”的觀點(diǎn)。對(duì)血清學(xué)AQP4 Ab陽(yáng)性的Lewis大鼠分別經(jīng)顱骨注射多種細(xì)胞因子，包括白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、干擾素-γ和趨化因子CXCL2等，其中IL-1β可成功誘導(dǎo)NMO模型。制作此模型可選用3周(未成年)和7周(成年)野生Lewis大鼠，將100 ng/μL IL-1β溶于無肉毒素的PBS溶液，取0.3 μL通過立體定位儀定位注射至AQP4 Ab陽(yáng)性鼠的紋狀體內(nèi)[11]即造模成功。

注射24 h后，病理學(xué)觀察可發(fā)現(xiàn)注射半球(包括皮層、胼胝體、紋狀體、丘腦)白細(xì)胞的遷移及聚集、血管周圍中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)區(qū)域AQP4表達(dá)降低和補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞損傷，表明IL-1β改變了BBB的通透性，從而使外周血中的AQP4 Ab滲入注射大腦半球內(nèi)而引起CNS損傷；而且相對(duì)于活動(dòng)期MS，NMO損傷區(qū)域激活的小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞含有更多的IL-1β，表明IL-1β作為重要的繼發(fā)因子在CNS損傷形成和炎性細(xì)胞聚集的過程中發(fā)揮重要作用[11]。此模型利于研究炎性細(xì)胞因子對(duì)AQP4 Ab陽(yáng)性鼠CNS損害的致病作用，并為細(xì)胞因子的治療提供依據(jù)，不足之處是對(duì)CNS的外科操作要求較高。

2.4 AQP4反應(yīng)性T細(xì)胞誘導(dǎo)的NMO模型 此模型制備原理是基于在抗原特異性T細(xì)胞針對(duì)CNS的免疫攻擊發(fā)生后，AQP4 Ab進(jìn)一步促進(jìn)補(bǔ)體激活和炎性細(xì)胞聚集而加重NMO癥狀。AQP4在細(xì)胞膜上形成穩(wěn)定的四聚體由6個(gè)跨膜螺旋片段及2個(gè)非跨膜螺旋片段組成，研究證實(shí)其中AQP4 C環(huán)(AQP4135-53)肽段可激活A(yù)QP4免疫缺陷鼠CNS內(nèi)T細(xì)胞[12-13]。此模型制備步驟：將合成的人AQP4 C環(huán)肽段，用PBS緩沖液稀釋為2 mg/mL，與8 mg/mL CFA等體積混合，取100 μL通過尾靜脈注入AQP4表達(dá)缺陷的C57BL/6小鼠體內(nèi)，同時(shí)及48 h后腹腔內(nèi)注射PTX。注射AQP4 C環(huán)肽段23 d后，取小鼠脾臟獲取AQP4特異性T細(xì)胞并連續(xù)培養(yǎng)3 d，隨后將培養(yǎng)的AQP4特異性T細(xì)胞(約5×106)通過尾靜脈注入野生型鼠體內(nèi)，5 d后觀察可見注射鼠體質(zhì)量減輕、肢體癱瘓等癥狀[8]，即造模成功。造模成功14～21 d后，免疫組織化學(xué)染色可見脊髓、視神經(jīng)和腦內(nèi)的AQP4的丟失、髓鞘脫失以及T細(xì)胞聚集等NMO樣改變。

有趣的是，在AQP4特異性T細(xì)胞誘導(dǎo)過程中，若加以IL-6和IL-23刺激，可誘導(dǎo)Th17的產(chǎn)生，同法注入則可出現(xiàn)更為嚴(yán)重的髓鞘脫失和神經(jīng)功能缺損，包括四肢無力、偏癱和體質(zhì)量減輕等癥狀[14]。此模型證實(shí)AQP4反應(yīng)性T細(xì)胞導(dǎo)致行為障礙和CNS少突膠質(zhì)細(xì)胞損害的潛在作用，利于嘗試針對(duì)AQP4抗原的特異性免疫治療，且高劑量AQP4 C環(huán)肽段注射誘導(dǎo)的免疫耐受已被認(rèn)為是NMO治療的一個(gè)新方向[15]。但因其操作步驟較多，精細(xì)度要求較高，成功率低于前述方法。

3 目前NMO動(dòng)物模型存在的問題

3.1 人類和嚙齒類動(dòng)物的星形膠質(zhì)細(xì)胞特點(diǎn)迥異 人類和嚙齒類動(dòng)物星形膠質(zhì)細(xì)胞均表達(dá)AQP4，而人類除AQP4外亦表達(dá)AQP1，在AQP4缺失時(shí)可發(fā)揮代償作用[16]。另外，人類每個(gè)星型膠質(zhì)細(xì)胞可支持和調(diào)節(jié)約2百萬個(gè)突觸的功能，而嚙齒類僅為9萬個(gè)左右[17]。

3.2 人類和嚙齒類動(dòng)物外周血白細(xì)胞比例不同 人類中性粒細(xì)胞占外周血白細(xì)胞總數(shù)〔(4.0～10.0)×109/L〕的45%～75%，Lewis大鼠約占35%[17]，小鼠則為5%～27%[18]。中性粒細(xì)胞的比例差異決定了損傷部位AQP4表達(dá)改變程度的不同。

總之，盡管NMO模型的制備迄今已取得了很大進(jìn)展，但仍存在不少問題或疑點(diǎn)，如目前NMO模型大多通過持續(xù)、反復(fù)、多部位注射AQP4 Ab獲得，不同遺傳背景的鼠系NMO模型臨床和病理學(xué)表現(xiàn)迥異等問題，均須今后開展更多的工作予以確證。

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(本文編輯：鄒晨雙)

10.3969/j.issn.1006-2963.2016.04.012

100044北京大學(xué)人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科(鐘珊珊、何洋、劉廣志)

劉廣志，Email：guangzhi2002@hotmail.com

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