孟勝喜，霍清萍

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局灶性腦缺血?jiǎng)游锬Ｐ偷难芯窟M(jìn)展

孟勝喜，霍清萍

上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院(上海 200233)

摘要：局灶性腦缺血?jiǎng)游锬Ｐ蛯?duì)于研究缺血性腦血管病發(fā)生、發(fā)展的病理生理學(xué)機(jī)制尤為重要。本研究概述局灶性腦缺血?jiǎng)游锬Ｐ偷膭?dòng)物選擇、建模方法、模型改良方法以及最新研究進(jìn)展。

關(guān)鍵詞：局灶性腦缺血；動(dòng)物模型；建模方法；病理生理

腦血管疾病(cerebral vasculardiseas，CVD)是嚴(yán)重危害人類健康的三大疾病之一，也是導(dǎo)致人類死亡的第二大疾病[1]，其發(fā)生率、致殘率及死亡率均高，給社會(huì)和家庭帶來(lái)沉重負(fù)擔(dān)[2]。所有CVD中，缺血性腦血管病(ischemic cerebrovascular disease，ICVD)占80%[3]。腦缺血?jiǎng)游锬Ｐ蛯?duì)于探究ICVD機(jī)制和防治非常重要，它分為彌漫性腦缺血模型和局灶性腦缺血模型。前者對(duì)周身影響較大，梗死不穩(wěn)定，應(yīng)用較少。后者可形成特定部位的腦梗死并可再灌注，對(duì)周身影響不大，類似人發(fā)病情況，是模擬和研究ICVD的重要工具。國(guó)際腦血管病委員會(huì)一致認(rèn)為ICVD研究應(yīng)以局灶性腦缺血模型為基礎(chǔ)，并對(duì)局灶性腦缺血模型提出了明確要求[4]。近些年來(lái)，局灶性腦缺血?jiǎng)游锬Ｐ偷脑炷７椒ú粩喔倪M(jìn)和發(fā)展，對(duì)于研究ICVD發(fā)生、發(fā)展的病理生理學(xué)機(jī)制極為重要[5]。

1局灶性腦缺血?jiǎng)游锬Ｐ偷膭?dòng)物選擇

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，局灶性腦缺血模型動(dòng)物有狒狒、猴、豬、狗、貓、家兔、鼠等。狒狒和猴的高級(jí)神經(jīng)中樞與人非常相近，但費(fèi)用高、來(lái)源不易、飼養(yǎng)難。豬的腦血管形態(tài)、生理特征和代謝等方面與人相似，側(cè)支循環(huán)少，但體型大，品系不純。狗的腦血管與人差異較大，其頸內(nèi)外動(dòng)脈間吻合網(wǎng)較豐富，單根顱內(nèi)動(dòng)脈阻斷難以形成穩(wěn)定的腦梗死灶。貓的神經(jīng)系統(tǒng)較發(fā)達(dá)，較易建立腦梗死模型。家兔飼養(yǎng)較易，但大腦皮質(zhì)不夠發(fā)達(dá)，效果不甚理想。嚙齒類動(dòng)物鼠成本低，飼養(yǎng)易，繁殖快，是目前最常用的研究動(dòng)物[6]。其中大鼠基因與人有98%同源性，腦血管解剖特點(diǎn)與人比較接近[7]，種系內(nèi)純性高，同系間遺傳差異不大，被廣泛用于實(shí)驗(yàn)研究。

2常用局灶性腦缺血?jiǎng)游锬Ｐ椭谱鞣椒?/p>

大多數(shù)局灶性腦缺血模型都是阻斷大腦中動(dòng)脈閉塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)造模。85%的ICVD是由MCAO引起[8]，因此MCAO模型普遍認(rèn)為是局灶性腦缺血的標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)物模型。該模型制作方法一般包括線栓法、開顱物理阻斷血流法、光化學(xué)誘導(dǎo)血栓形成法、血栓形成法、內(nèi)皮素-1灌注誘導(dǎo)血管收縮法、頸總動(dòng)脈(CCA)加壓夾閉法、負(fù)電流電解損傷法、FeCl3化學(xué)誘導(dǎo)法及其他。

2.1線栓法線栓法一般不開顱，易操作，損傷不大及對(duì)生理指標(biāo)影響也不大[9]，是目前應(yīng)用最廣泛的局灶性腦缺血模型造模方法，由Koizumi首創(chuàng)[10]。操作如下：分離大鼠一側(cè)CCA、頸外動(dòng)脈(ECA)和頸內(nèi)動(dòng)脈(ICA)，結(jié)扎、切斷頸外動(dòng)脈及分支，結(jié)扎翼腭動(dòng)脈，把來(lái)自顱外的側(cè)支循環(huán)阻斷，從頸外動(dòng)脈殘端插入頂端粘有硅橡膠的尼龍單絲線，沿頸外動(dòng)脈、頸總動(dòng)脈連接部和頸內(nèi)動(dòng)脈緩慢前進(jìn)，至頸內(nèi)動(dòng)脈顱內(nèi)連接部時(shí)即可阻斷大腦中動(dòng)脈(MCA)血流。若大鼠蘇醒后出現(xiàn)同側(cè)的Horner征和對(duì)側(cè)前肢為重的偏癱，則表明造模成功。Longa等[11]把頂端燙成光滑圓球的4-0單尼龍線作為栓塞物，也可制成相應(yīng)動(dòng)物模型，并可準(zhǔn)確控制腦缺血再灌注時(shí)間；同時(shí)創(chuàng)建了用于評(píng)價(jià)大鼠神經(jīng)功能缺損程度的Longa評(píng)分。Laing等[12]比較Koizumi法與Longa法，認(rèn)為Koizumi法比Longa法的梗死效果更好，模型成功率更高。1994年Huang等[13]用線栓法制作了出小鼠局灶性腦缺血模型。1997年Hara等[14]用改良線栓法制作小鼠急性局灶性腦缺血模型，即線栓阻斷小鼠左側(cè)MCA后進(jìn)行再灌注，使腦梗死體積減少約44%，提高了其存活率。李冠華等[15]應(yīng)用線栓阻斷大鼠左側(cè)MCA后再進(jìn)行再灌注，制作了大鼠局灶性腦缺血模型，成活率約67%。Zuo等[16]用石蠟涂層線栓建立大鼠MCA永久性閉塞模型，成功率達(dá)100%，而使用無(wú)石蠟涂層的線栓，成功率僅有55%。使用石蠟涂層線栓造模的腦梗死體積比普通尼龍線栓更大，死亡率更低。

線栓法在實(shí)驗(yàn)中不斷改進(jìn)和完善。目前用尼龍釣魚線代替4-0縫線，用動(dòng)脈夾夾閉來(lái)代替結(jié)扎翼腭動(dòng)脈[17]。曹霞等[18]將聚乙烯醇處理后的大鼠自體鼠須作為栓塞材料；劉運(yùn)泉等[19]采用硅橡膠和多聚賴氨酸處理線栓，使其頭端光滑圓鈍，兩者均提高了造模成功率。王橋生等[20]在Longa法基礎(chǔ)上予以改進(jìn)，從右側(cè)胸鎖乳突肌內(nèi)側(cè)和胸骨舌骨肌之間的肌間隙暴露頸動(dòng)脈鞘，稍分離即可見(jiàn)到CCA、ECA和ICA，在分離頸動(dòng)脈叉和周圍神經(jīng)組織時(shí)，在CCA上置一打單結(jié)的5-0縫合線，將傳統(tǒng)自ECA進(jìn)栓線改從CCA進(jìn)栓線。李艷紅等[21]用絲線結(jié)扎翼腭動(dòng)脈，但不結(jié)扎CCA，使CCA-ICA血行暢通，從而提高模型的成功率和穩(wěn)定性。包新杰等[22]分離與CCA伴行的迷走神經(jīng)和迷走神經(jīng)節(jié)，并加以保護(hù)，避免在牽拉血管時(shí)，損傷迷走神經(jīng)，提高了存活率。賈淑偉等[23]發(fā)現(xiàn)術(shù)前禁食可降低造模動(dòng)物死亡率，按大鼠體重選擇相應(yīng)直徑的栓線可提高造模成功率。沈斌等[24]認(rèn)為嚴(yán)格控制腦血流量、夾閉對(duì)側(cè)CCA、選擇合適栓線等，是提高成功率的關(guān)鍵。辛世萌等[25]利用析因設(shè)計(jì)，通過(guò)評(píng)價(jià)神經(jīng)功能缺陷程度和腦梗死體積，發(fā)現(xiàn)最佳造模方案是大鼠體重250 g～300 g、栓線長(zhǎng)17 mm或18 mm、栓線直徑0.28 mm。臧志萍等[26]認(rèn)為小鼠局灶性腦缺血模型造模術(shù)后的成活率、腦梗死體積、神經(jīng)行為學(xué)表現(xiàn)和手術(shù)方法存在相關(guān)性。閆峰等[27]應(yīng)用神經(jīng)介入微導(dǎo)絲導(dǎo)管技術(shù)，建立一種改良的家兔MCAO模型。劉學(xué)軍等[28]通過(guò)兔局灶性腦缺血再灌注模型實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，針對(duì)不同體重動(dòng)物而選擇相應(yīng)大小頭徑的線栓，可獲得較高的成功率，而插線深度不正確則為造模失敗的主要原因。李雪麗等[29]認(rèn)為體重250 g～350 g大鼠，理想線栓長(zhǎng)度應(yīng)為17 mm～18 mm，線栓直徑應(yīng)為0.25 mm～0.28 mm。張秋玲[30]采用韓國(guó)產(chǎn)3號(hào)圓柱形尼龍釣魚線，將其一端覆以少許乙醇稀釋指甲油，使得插線前端光滑且無(wú)明顯膨大，造模效果較滿。劉運(yùn)泉等[31]在線栓頭部覆以左旋多聚賴氨酸，增加了缺血的穩(wěn)定性，保證缺血效果。王耀明等[32]采用固體石蠟經(jīng)加熱熔化后處理栓線，操作簡(jiǎn)便，具有較好的一致性。動(dòng)物的品系和體重、尼龍線粗細(xì)及頭端大小、插線深度的不同等均可導(dǎo)致線栓法制備的模型在成功率、梗死體積、蛛網(wǎng)膜下腔出血發(fā)生率、動(dòng)物早期死亡率等方面存在一定的差異[33]。

2.2開顱物理阻斷血流法1981年Tamura等[34]首先建立該模型，后不斷改進(jìn)。開顱部位盡可能在需阻斷血管位置的后面，經(jīng)顱骨較薄或者缺損的部位進(jìn)行，盡量減少損傷。方法有以下三種：①通過(guò)顳下部入顱，可分離看到橫過(guò)嗅束內(nèi)緣或外緣的MCA；②通過(guò)眶部入顱[35]，沿眶上緣作弧形切口，分離眶內(nèi)結(jié)締組織，視神經(jīng)孔可見(jiàn)，電凝切斷視神經(jīng)，于視神經(jīng)孔外上方開窗，切開硬腦膜，便可找到MCA。張運(yùn)周等[36]在O’ Brien方法基礎(chǔ)上進(jìn)一步改進(jìn)：骨窗在視神經(jīng)孔的外上方，每次均在MCA主干末端電凝閉塞，略加游離MCA后電凝閉塞MCA，夾閉MCA；③通過(guò)眶后進(jìn)顱[37]：在距眶外沿縱形切開，分離眼輪匝肌、顳肌，從視神經(jīng)孔外沿鉆顱骨，除去相鄰顳骨及部分蝶骨翼，切開硬膜后見(jiàn)MCA主干。

開顱后阻斷血管可用電凝、結(jié)扎和夾閉等方法。電凝比結(jié)扎操作簡(jiǎn)單，但引起的腦組織水腫和局部創(chuàng)傷程度均明顯大于結(jié)扎；使用血管夾夾閉血管，操作簡(jiǎn)單，對(duì)血管損傷較小，又能制作缺血再灌注模型。金榮等[38]采用微動(dòng)脈夾夾閉一側(cè)大腦中動(dòng)脈和雙側(cè)頸總動(dòng)脈的方法制作大鼠局灶性腦缺血再灌注模型。Kaplan等[39]以金屬牽引鉤牽拉MCA，從而制作局灶性腦缺血再灌注模型。

2.3血栓形成法

2.3.1光化學(xué)誘導(dǎo)法由Waston等[40]于1985年首創(chuàng)，將一定量的孟加拉紅注射入動(dòng)物機(jī)體后，以特定光照射，二者在血管內(nèi)發(fā)生光化學(xué)反應(yīng)，大量活性氧隨之產(chǎn)生，損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞，進(jìn)而血小板黏附、聚集，血栓形成，進(jìn)一步形成血栓性腦梗死。Suzuki等[41]則從顳部開顱，直接對(duì)大腦中動(dòng)脈照射。Dietrich等[42]給大鼠靜脈注射玫瑰紅B，用光化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生氧自由基，破壞血管內(nèi)皮，血小板聚集形成血栓，以光束經(jīng)顱骨表面照射鼠腦特定部位，造成血栓性梗死模型。之后開顱選擇MCA起始端進(jìn)行光照誘導(dǎo)MCA閉塞方法，并在光照血管的局部滴注尼莫地平，使血管再通，從而制作出局灶性腦缺血再灌注模型。王偉等[43]以Bederson法[44]為基礎(chǔ)，分步照射MCA起始端、嗅束內(nèi)側(cè)至大腦下靜脈交叉處的一段MCP，閉塞MCA近端，阻斷豆紋動(dòng)脈，在額頂葉皮質(zhì)和基底核外側(cè)形成梗死灶。李樹清等[45]在大鼠尾靜脈內(nèi)注入孟加拉紅后，置于氙燈輻照系統(tǒng)內(nèi)，制作出局灶性腦缺血再灌注模型。楊淵等[46]制作了光化學(xué)誘導(dǎo)的老年大鼠局灶腦梗死模型，此模型適合研究老年腦血管病病人相關(guān)基因及干預(yù)治療。朱華等[47]首次把光化學(xué)法應(yīng)用于靈長(zhǎng)類動(dòng)物，成功地制作了食蟹猴局部腦缺血模型。光化學(xué)誘導(dǎo)血栓形成，缺血性腦損傷系統(tǒng)和凝血纖溶系統(tǒng)均參與其中，因此腦組織病理?yè)p害程度較其他腦缺血?jiǎng)游锬Ｐ透鼮槊黠@[48]。

2.3.2微栓子栓塞法從ICA系統(tǒng)引入栓子從而阻斷MCA血流。栓子可分為：①永久性栓塞栓子，如硅膠柱穩(wěn)定地阻塞MCA；②不穩(wěn)定再灌注栓子，如自體凝血塊。沈順姬等[49]將鼠尾靜脈的血推入微導(dǎo)管中，制成血栓，再將此導(dǎo)管從ECA逆行插入到與ICA相交處，把栓子推入ICA而制成大鼠腦缺血模型；③穩(wěn)定再灌注栓子，即帶軟線的栓子，可人為精確控制缺血再灌注時(shí)間[50]。另外，Toshima等[51]從ICA注入月桂酸鈉，選擇性地?fù)p傷大腦穿支動(dòng)脈內(nèi)膜，導(dǎo)致血小板黏附、聚集、血栓形成，從而成功地復(fù)制腔隙性腦梗死。王俊濤等[52]采用中藥白芨微粒作為栓塞劑建立大鼠局灶性腦缺血模型。Zhang等[53]經(jīng)導(dǎo)管介導(dǎo)，用凝血酶誘導(dǎo)血栓形成，該血栓與人體血栓成分相近，且選擇梗塞MCA起始部，可以比較接近地模仿人血栓形成過(guò)程。與Zhang方法類似的有銅線栓子誘導(dǎo)的血栓形成[54]，硅酮微球、碳粒微球等作為栓子制成局灶性腦缺血模型。

2.4內(nèi)皮素-1灌注誘導(dǎo)血管收縮法內(nèi)皮素-1(Endotheline-1，ET-1)由內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生，是迄今為止發(fā)現(xiàn)作用最強(qiáng)的血管收縮活性物質(zhì)。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，ET-1通過(guò)強(qiáng)烈持續(xù)的血管收縮作用，使局部腦血流量(iCBF)減少，形成梗死灶，還可通過(guò)直接損傷神經(jīng)細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞而誘發(fā)卒中。Macrae等[55]于MCA近端表面滴加ET-1后，發(fā)現(xiàn)腦血流量呈劑量依賴性減少，并產(chǎn)生腦梗死，還伴隨缺血出現(xiàn)緩慢進(jìn)展的再灌注。Fuxe等[56]在大鼠一側(cè)紋狀體內(nèi)注射微量ET-1后，導(dǎo)致缺血性腦損害和半暗帶形成。Sharkey等[57]經(jīng)定向?qū)Ч芟虼笫蟮腗CA管腔周圍的腦實(shí)質(zhì)內(nèi)灌注微量ET-1后平均動(dòng)脈壓可增加20%，MCA供應(yīng)區(qū)iCBF減少93%以上，還產(chǎn)生類似于MCA永久閉塞后的缺血性腦損害表現(xiàn)。ET-1灌注誘導(dǎo)血管收縮法避免了對(duì)血管和腦組織的機(jī)械損傷，并可通過(guò)改變ET-1的用量或用拮抗劑來(lái)控制缺血和再通時(shí)間[58]。

2.5CCA加壓夾閉法Nishimura等[59]首創(chuàng)此法：實(shí)驗(yàn)對(duì)象為沙土鼠，在頸正中切口，暴露、分離CCA，把CCA夾于一副未完全切斷的聚乙烯管之間并持續(xù)若干分鐘。此法通過(guò)加壓夾閉、機(jī)械損傷CCA局部?jī)?nèi)皮，血栓出現(xiàn)快，重復(fù)性高。

2.6負(fù)電流電解損傷法將不絕緣負(fù)電極穿入血管，保證和內(nèi)膜接觸良好，連接負(fù)電極與一個(gè)雙道方波產(chǎn)生器的正極，電流損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞，引發(fā)血栓形成，阻塞血管腔，使腦血流量減少造成腦缺血。

2.7FeCl3化學(xué)誘導(dǎo)法該法是一種原位血栓形成的方法[60]，即用化學(xué)物質(zhì)FeCl3局部浸潤(rùn)動(dòng)脈，可使血管內(nèi)膜剝脫、內(nèi)膜下組織暴露，從而引起動(dòng)脈內(nèi)血栓形成。劉小光等[61]開顱顯露位于嗅束和大腦下靜脈之間的一段MCA，將FeCl3溶液的小片濾紙貼于該段血管上，術(shù)后24 h可形成混合血栓，隨之形成腦梗死灶。

3其他

3.1圈套器結(jié)扎模型[62]使用圈套器結(jié)扎大腦中動(dòng)脈或松解圈套器，阻斷血流或再灌注。該法常用于貓及靈長(zhǎng)類動(dòng)物的研究。

3.2轉(zhuǎn)基因和基因敲除模型轉(zhuǎn)基因和基因敲除鼠為缺血和再灌注細(xì)胞損傷及神經(jīng)保護(hù)機(jī)制中相關(guān)基因和蛋白質(zhì)的研究提供新方法[63]。線栓法也可用于轉(zhuǎn)基因或基因敲除小鼠[64]。

3.3皮層壓迫法[65]在初級(jí)軀體感覺(jué)皮質(zhì)對(duì)應(yīng)的顱骨處鉆一小孔，保持硬腦膜完整，然后用裝有激光多普勒探頭的銅柱小合壓迫硬腦膜，從而形成腦梗死灶。

3.4球囊導(dǎo)管法該法可認(rèn)為是線栓法的改進(jìn)， Hamberg等[66]將血管入口選在股動(dòng)脈，球囊導(dǎo)管經(jīng)升主動(dòng)脈到CCA，然后經(jīng)ICA入顱，通過(guò)MCA球囊擴(kuò)張或縮小達(dá)到阻斷或恢復(fù)血流目的。Jungreis等[67]進(jìn)行改進(jìn)，在血管內(nèi)用導(dǎo)絲阻斷MCA和用球囊可逆的阻斷ICA，形成腦梗死灶。

4小結(jié)

綜上所述，近幾十年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)局灶性腦缺血模型從動(dòng)物的選擇、模型的分類及方法制備等方面進(jìn)行有益探索和不斷完善，明顯提高了模型的成功率和腦梗死灶的穩(wěn)定性，使得局灶性腦梗死模型制作日趨成熟和完善。在今后的研究中，不僅應(yīng)重視缺血損傷的可控性和重復(fù)性，嚴(yán)格控制各種干擾因素，盡量減少其對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，還應(yīng)從實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、模型選擇、實(shí)驗(yàn)條件、實(shí)驗(yàn)流程、評(píng)價(jià)指標(biāo)與測(cè)試等方面構(gòu)建一系列統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)體系，使得實(shí)驗(yàn)方法和實(shí)驗(yàn)流程等方面進(jìn)一步科學(xué)化、標(biāo)準(zhǔn)化、規(guī)范化，為ICVD科學(xué)研究提供更有力的工具和手段。同時(shí)應(yīng)積極嘗試和構(gòu)建病證結(jié)合腦缺血?jiǎng)游锬Ｐ?，為中醫(yī)研究腦血管疾病提供良好的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，為中醫(yī)藥對(duì)ICVD防治作用的評(píng)價(jià)提供客觀依據(jù)。

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(本文編輯薛妮)

基金項(xiàng)目：上海市科委中醫(yī)類引導(dǎo)項(xiàng)目(No.15401933300)；上海市衛(wèi)計(jì)委項(xiàng)目(No.YSNXD-YL-YSZK013)

通訊作者：霍清萍，E-mail：huoqingping005@163.com

中圖分類號(hào)：R743R255.2

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

doi：10．3969/j．issn．1672-1349．2016．12．019

文章編號(hào)：1672-1349(2016)12-1366-05

Corresponding Author：Huo Qingping

(收稿日期：2015-08-09)

Research Progress on Animal Model with Focal Cerebral Ischemia

Meng Shengxi，Huo Qingping

Shanghai Sixth People’s Hospital，Shanghai Jiaotong University，Shanghai 200233，China

Abstract：The animal model of focal cerebral ischemia plays an important role in the investigation of pathophysiology， pathogenesis of ischemic cerebrovascular disease.The paper summarizes animal selection，modeling method，model improvement method and the latest research progress of focal cerebral ischemia animal model and so on.

Key words：focal cerebral ischemia；animal model；modeling methods；pathophysiology