一株新城疫病毒分離鑒定及分子特性分析

程榮華 呼延含蓉 李蓉 高原 石霖 徐鵬

（1，吉林省畜牧獸醫(yī)科學(xué)研究院 130062；2，吉林省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心 130062；3，遼寧省動(dòng)物醫(yī)學(xué)研究院 110164；4，錦州醫(yī)科大學(xué) 121001）

一株新城疫病毒分離鑒定及分子特性分析

程榮華1呼延含蓉2李蓉3高原3石霖3徐鵬4*

（1，吉林省畜牧獸醫(yī)科學(xué)研究院 130062；2，吉林省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心 130062；3，遼寧省動(dòng)物醫(yī)學(xué)研究院 110164；4，錦州醫(yī)科大學(xué) 121001）

新城疫 （Newcastle disease，ND）是由新城疫病毒 （New castle disease virus，NDV）所引起的禽類一種急性、烈性傳染病，其主要侵害雞和火雞，發(fā)病率和死亡率均非常高，為危害我國養(yǎng)禽業(yè)的最嚴(yán)重疾病之一，該病為世界動(dòng)物衛(wèi)生組織 （OIE）所規(guī)定的A類動(dòng)物疫病，我國將其列為一類動(dòng)物疫病，并為國家中長期動(dòng)物疫病防治規(guī)劃 （2012-2020年）所規(guī)定的5種優(yōu)先防治的一類動(dòng)物疫病之一。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新城疫病毒核酸熒光RT-PCR試劑盒購自于深圳匹基公司；Taq DNA聚合酶、dNTP、RNA酶抑制劑購自大連寶生物公司；Trizol LS和反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Invitrogen公司。

1.2 病毒的分離鑒定

對(duì)疑似新城疫的臟器樣品處理后提取核酸，應(yīng)用新城疫病毒核酸熒光RT-PCR試劑盒進(jìn)行新城疫病毒核酸檢測(cè)。對(duì)將核酸檢測(cè)陽性的樣品接種9日齡雞胚，共接種5個(gè)雞胚，每個(gè)接種0.1ml，24～72h后收集尿囊液，按照ND診斷技術(shù)國家標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行HA和HI試驗(yàn)。

1.3 F基因和HN基因的擴(kuò)增及序列測(cè)定

取分離株病毒的尿囊液200μl，按照Invitrogen公司Trizol說明書操作，提取病毒RNA，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，PCR產(chǎn)物送大連寶生物工程公司測(cè)序。

1.4 F基因、HN基因系統(tǒng)進(jìn)化樹及同源性分析

從GeneBank下載32株NDV的F基因和19株NDV的HN基因，利用Lasergene7.0軟件中的MegAlign將其與該毒株的F基因和HN基因的序列一起進(jìn)行同源性分析，并繪制基因進(jìn)化樹。

2 結(jié)果

2.1 病毒檢測(cè)及鑒定結(jié)果

所接SPF雞胚在72h內(nèi)全部死亡，死亡雞胚全身水腫、充血。收獲尿囊液進(jìn)行HA和HI試驗(yàn)。HA和HI試驗(yàn)結(jié)果表明，該毒株的尿囊液可凝集雞紅細(xì)胞，HA凝集效價(jià)均在26以上，可被ND標(biāo)準(zhǔn)血清所抑制，但不能被禽流感H5、H7、H9亞型的標(biāo)準(zhǔn)血清和EDS-76血清所抑制，新城疫病毒核酸熒光RT-PCR試劑盒進(jìn)行ND病毒核酸熒光RT-PCR檢測(cè)均為陽性。將這個(gè)毒株命名為CK/JL1/2013，簡稱為JL1株。

2.2 F基因系統(tǒng)進(jìn)化樹及同源性分析結(jié)果

應(yīng)用Lasergene7.0軟件中MegAlign程序中的Clustal W方法進(jìn)行各序列的同源性比對(duì)，并繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹；可知，NDV共劃分為9個(gè)基因型，JL1株歸屬于基因VII型。

由F基因序列所翻譯的氨基酸序列可知，F(xiàn)0蛋白的裂解位點(diǎn)序列為112RRQKRF117，具有強(qiáng)毒株裂解位點(diǎn)特征。JL1株與taiwan95株 （VII型NDV代表毒株）、js02株、La-Sota株和Queensland V4株的F基因的同源性分別為98.3%、98.9%、95.9%和96.6%。

2.3 HN基因系統(tǒng)進(jìn)化樹及序列相似性分析結(jié)果

以HN基因ORF序列繪制的進(jìn)化樹顯示，JL1株為基因Ⅶ型。同源性分析顯示分離株JL1株與Ⅶ型js02株親緣關(guān)系最近，HN基因同源性為99.5%；JL1株與F48E9、Mukteswar、LaSota、Queensland V4間HN基因的核苷酸同源性分別為94.4%、90.6%、89.0%、83.7%。

3 討論

F蛋白裂解位點(diǎn)是NDV毒力的主要決定因素，但因長期大劑量、高頻次的ND疫苗免疫所形成的高免疫壓力及RNA病毒自身易變異的特性，NDV在進(jìn)化過程中容易發(fā)生點(diǎn)突變，因此，在NDV的分子流行病學(xué)研究中首選對(duì)F基因進(jìn)行分析，同時(shí)有大量研究對(duì)HN基因進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析。在本研究中，采用HN基因序列進(jìn)行基因型劃分的結(jié)果與采用F基因序列進(jìn)行基因型劃分的結(jié)果相同，這也與相關(guān)研究結(jié)果相似。通過裂解位點(diǎn)分析與常用疫苗株LaSota、Queensland V4之間的親緣關(guān)系表明，本次所分離的毒株JL1株屬于Ⅶ型，其與目前在養(yǎng)禽業(yè)中流行的Ⅶ型ZJ1株的親緣關(guān)系非常近，其與當(dāng)前所應(yīng)用的疫苗株LaSota、Queensland V4親緣關(guān)系均較遠(yuǎn)。

根據(jù)毒力的不同，可將NDV分為3類：強(qiáng)毒株、中強(qiáng)毒株和弱毒株。同時(shí)，依據(jù)致病性分子基礎(chǔ)的F蛋白裂解位點(diǎn)的不同進(jìn)行分類，中強(qiáng)毒株、強(qiáng)毒株裂解位點(diǎn)氨基酸序列多為112R/K-R-Q/K-K/R-R-F117，弱毒株裂解位點(diǎn)氨基酸序列則多為112G/E-K/R-Q-G/E-R-L117。但目前已經(jīng)有報(bào)道F蛋白的裂解位點(diǎn)處的氨基酸基序可能不一定是NDV毒力的必要因子。本研究對(duì)分離到的新城疫毒株的F基因和HN基因進(jìn)行序列測(cè)定與分析，與現(xiàn)行國內(nèi)外流行毒株的同源性及遺傳演化進(jìn)行了分析，為制定防控新城疫流行的有效對(duì)策提供重要的科學(xué)依據(jù)。

*通訊作者：徐鵬，副教授，研究方向?yàn)閯?dòng)物傳染病及獸醫(yī)寄生蟲學(xué)。