李 旻，李 華，汪溪潔，馬 璟

（國(guó)家上海新藥安全評(píng)價(jià)研究中心，上海201203）

蟾酥心臟毒性研究進(jìn)展

李 旻，李 華，汪溪潔，馬 璟

（國(guó)家上海新藥安全評(píng)價(jià)研究中心，上海201203）

近年來(lái)，人們對(duì)中藥的不良反應(yīng)日趨重視。蟾酥作為臨床廣泛應(yīng)用和已知的具有心臟毒性的名貴中藥，人們迫切希望明確其毒性機(jī)制以及與血藥濃度的關(guān)系。蟾酥中主成分之一蟾蜍甾烯類物質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)與地高辛類似，也屬于強(qiáng)心苷類化合物。它具有興奮和抑制心臟的雙重效果，在低劑量時(shí)可興奮心肌導(dǎo)致心動(dòng)過(guò)速和快速心律失常，而在高劑量時(shí)可抑制心肌導(dǎo)致傳導(dǎo)阻滯和緩慢心律失常。Na+-K+-ATP酶作為調(diào)節(jié)心肌能量和細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的樞紐，蟾蜍甾烯類物質(zhì)通過(guò)結(jié)合酶的α亞基可產(chǎn)生抑制作用，從而導(dǎo)致心肌細(xì)胞鈣超載和能量紊亂，這可能是蟾酥心臟毒性的主要機(jī)制。本文分別從心臟毒性物質(zhì)基礎(chǔ)、整體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)、酶和離子通道、脂質(zhì)代謝和離子穩(wěn)態(tài)、藥動(dòng)學(xué)與心臟毒性的相關(guān)性等方面綜述蟾酥心臟毒性的研究進(jìn)展。

蟾酥；心臟毒性；Na+-K+-ATP酶；鈣超載

蟾酥是我國(guó)傳統(tǒng)名貴藥材之一，為蟾蜍科動(dòng)物中華大蟾蜍（Bufo gargarizans Cantor）或黑眶蟾蜍（Bufo melanostictus Schneider）耳后腺和皮膚腺分泌的白色漿液加工、干燥而成。蟾酥化學(xué)成分復(fù)雜，主要有蟾蜍甾烯類、20，21-環(huán)氧蟾蜍內(nèi)酯類、蟾毒色胺類、甾醇類以及腎上腺素、多糖、蛋白質(zhì)、氨基酸和有機(jī)酸等［1-3］。現(xiàn)代藥理和臨床應(yīng)用表明其具有強(qiáng)心、升壓、鎮(zhèn)痛以及抗腫瘤等多種藥理活性［3］。

雖然蟾酥對(duì)多種病癥有良好的療效，但其毒性較大，在中國(guó)古代多部醫(yī)經(jīng)如《本草經(jīng)疏》、《本草便讀》和《本草求真》等中均有關(guān)于“蟾酥性有毒，若欲內(nèi)服，勿過(guò)三厘，慎毋單使”的記載，現(xiàn)代臨床上也有因誤食或誤用蟾酥而致人中毒甚至死亡的報(bào)道［4］。其臨床不良反應(yīng)主要表現(xiàn)為頭暈頭痛、口唇或四肢麻木、嗜睡出汗、膝反射遲鈍或消失及驚厥等神經(jīng)系統(tǒng)癥狀；胸悶心悸、陣發(fā)性房性心動(dòng)過(guò)速、竇性心動(dòng)過(guò)緩伴竇性心律不齊、房室傳導(dǎo)阻滯及傳導(dǎo)延遲、心房纖顫、輕度發(fā)紺、四肢冰冷和血壓下降等循環(huán)系統(tǒng)癥狀，死亡患者心臟組織病理學(xué)檢查可見(jiàn)心肌輕度水腫和少量紅細(xì)胞外滲；惡心嘔吐，甚至吐出血液、腹痛腸鳴、腹瀉等消化系統(tǒng)癥狀［5-7］。隨著對(duì)藥物安全性的關(guān)注和科學(xué)技術(shù)手段的進(jìn)步，人們對(duì)其毒性機(jī)制進(jìn)行了深入研究，這對(duì)指導(dǎo)臨床用藥和開(kāi)發(fā)減毒增效的新制劑意義重大。故本文就近年來(lái)蟾酥心臟毒性研究以及藥物代謝動(dòng)力學(xué)研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 心臟毒性物質(zhì)基礎(chǔ)

已知蟾酥的心血管不良反應(yīng)發(fā)生率高，主要是由于其藥理活性成分蟾蜍甾烯類物質(zhì)化學(xué)結(jié)構(gòu)與地高辛類似，具有強(qiáng)心苷樣作用，即在小劑量時(shí)具有強(qiáng)心作用，大劑量時(shí)卻有明顯的心臟毒性。據(jù)報(bào)道，蟾酥及其蟾蜍甾烯類單體化合物蟾毒靈的強(qiáng)心作用分別是人體內(nèi)源性強(qiáng)心苷物質(zhì)喹巴因的60～500和1000倍［8］。故蟾蜍甾烯類物質(zhì)是蟾酥心血管毒副作用的物質(zhì)基礎(chǔ)［9］。蟾蜍甾烯類物質(zhì)中蟾毒靈（bufalin，BL）、華蟾酥毒基（cinobufagin，CBG）和脂蟾毒配基（resibufogenin，RBG）3種活性單體化合物占較大比重，三者含量合計(jì)為5%～10%。目前，與蟾酥心臟毒性相關(guān)的研究均集中于蟾酥或上述3個(gè)中藥單體。

2 蟾酥或其單體的心臟毒性

2.1 整體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

在對(duì)Beagle犬的毒性實(shí)驗(yàn)中，急性給予蟾酥組出現(xiàn)劑量依賴性心率減慢、S-T振幅降低和T波倒置等癥狀；連續(xù)28 d給藥，心臟和胃腸道是蟾酥組的毒性靶器官［10-11］。在對(duì)蟾蜍和豚鼠心臟的研究中得到基本相似的研究結(jié)果，即在一定濃度下，蟾酥在短時(shí)間內(nèi)可使蟾蜍或豚鼠心臟出現(xiàn)心動(dòng)過(guò)速，房室傳導(dǎo)阻滯，室性心律失常；長(zhǎng)時(shí)間則導(dǎo)致心律減慢，心功能損傷等癥狀［12-13］。

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果與臨床結(jié)果有一定程度的相似性，但是動(dòng)物實(shí)驗(yàn)外推到人的過(guò)程中仍存在諸多問(wèn)題，如種屬間的差異、遺傳背景差異及費(fèi)用高等，同時(shí)也缺乏深入的藥物毒性機(jī)制研究。

2.2 酶和離子通道

2.2.1 心肌細(xì)胞膜ATP酶

有研究顯示，蟾酥和強(qiáng)心苷類物質(zhì)類似，可以通過(guò)與心肌Na+-K+-ATP酶α亞基結(jié)合抑制其活性［8，14］，從而導(dǎo)致Na+濃度升高，細(xì)胞內(nèi)Na+超載可刺激反向Na+/Ca2+交換電流（Na+/Ca2+exchange current，INCX）的增強(qiáng)而致細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載，Ca2+超載可誘發(fā)鈣致鈣釋放（calcium-induced calcium release，CICR），進(jìn)而導(dǎo)致心室動(dòng)作電位異常、心律失常［15］和心肌收縮功能紊亂、細(xì)胞損傷或死亡等［16］。其中致心律失常的原因可能如地高辛相似，激活鈣調(diào)蛋白激酶Ⅱ途徑［17-18］。還有研究顯示，蟾酥對(duì)Ca2+-ATP酶和對(duì)Mg2+-Ca2+-ATP酶也有抑制作用，從而進(jìn)一步促進(jìn)心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載［19］。此外，通過(guò)計(jì)算機(jī)模擬技術(shù)顯示，強(qiáng)心苷類物質(zhì)抑制Na+-K+-ATP酶可以導(dǎo)致豚鼠心肌細(xì)胞線粒體損傷，氧自由基清除減弱，產(chǎn)量增加，從而產(chǎn)生氧化應(yīng)激損傷［20］。

2.2.2 L型電壓依賴性鈣通道

早在2002年就有研究報(bào)道，推測(cè)蟾毒靈對(duì)心肌Ca2+濃度的影響不僅僅與抑制Na+-K+-ATP酶有關(guān)，還可能與對(duì)L型電壓依賴性鈣通道的作用有關(guān)［13］，但是一直未能證實(shí)。直到最近有研究顯示，華蟾酥毒基能夠濃度依賴的抑制大鼠心室肌L型鈣電流（L-type Ca2+current，ICa-L），上移ICa-L電流-電壓曲線，左移ICa-L激活曲線和失活曲線，其半數(shù)抑制濃度（the half maximal inhibitory concentration，IC50）為納摩爾級(jí)。同時(shí)，ICa-L電流-電壓曲線上移，而其激活、峰值、反轉(zhuǎn)電位未改變，提示華蟾酥毒基在不同電位時(shí)對(duì)ICa-L具有均勻一致的阻斷作用［21］。

L型鈣通道是竇房結(jié)和房室結(jié)細(xì)胞的除極電流，也是房、室和浦肯野纖維的平臺(tái)期電流。治療劑量下的L型鈣通道抑制劑可以減少細(xì)胞外Ca2+內(nèi)流，延長(zhǎng)有效不應(yīng)期，降低心肌自律性，從而起到抗心律失常的作用，并且抑制Ca2+超載起到保護(hù)缺血心肌的作用。而對(duì)正常心肌細(xì)胞L型鈣通道過(guò)度抑制，則Ca2+內(nèi)流受抑制使竇房結(jié)和房室結(jié)的自律性降低，傳導(dǎo)減慢，導(dǎo)致房室傳導(dǎo)阻滯甚至心臟停搏。

有趣的是，已知Ca2+進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)主要途徑有2條，分別是L型Ca2+通道和反向Na+/Ca2+交換電流（Na+/Ca2+exchange current，INCX）。故而在蟾酥對(duì)心臟的不同細(xì)胞（如心室肌、心房肌、房結(jié)和房室結(jié)）的影響中，究竟是L型Ca2+通道的影響還是反向INCX占有主導(dǎo)地位仍然有待于進(jìn)一步研究。

2.3 脂質(zhì)代謝和離子穩(wěn)態(tài)

磷脂和脂肪酸廣泛參與和調(diào)控人體多種生理活動(dòng)。應(yīng)用代謝組學(xué)技術(shù)研究推測(cè)［22］，蟾酥導(dǎo)致心臟損傷的途徑可能有2條：一是通過(guò)阻礙自由脂肪酸再?；M(jìn)而導(dǎo)致磷脂合成減少和花生四烯酸含量增加；二是通過(guò)激活PKC通路可引起磷脂酶A2活性增強(qiáng)，進(jìn)而加速磷脂水解并產(chǎn)生大量游離花生四烯酸。2條通路都干擾了脂質(zhì)代謝，產(chǎn)生大量游離的花生四烯酸，從而影響心肌正常功能，嚴(yán)重時(shí)可致心肌梗塞和心絞痛。應(yīng)用基因芯片技術(shù)研究結(jié)果顯示，蟾酥對(duì)心臟的影響主要涉及以下內(nèi)容：抑制與離子穩(wěn)態(tài)有關(guān)的基因Fxyd3，影響Na+-K+-ATP酶活性，續(xù)而增強(qiáng)心肌收縮力；激活與肌動(dòng)蛋白構(gòu)建有關(guān)的基因Rnd1，促進(jìn)肌動(dòng)蛋白絲的分解和細(xì)胞黏附性的喪失，進(jìn)而破環(huán)心肌細(xì)胞骨架；抑制抗氧化劑血漿銅藍(lán)蛋白基因的表達(dá)，而銅藍(lán)蛋白可以將Fe2+氧化為Fe3+，防止脂肪、DNA和蛋白質(zhì)的氧化破壞，銅藍(lán)蛋白被抑制則導(dǎo)致鐵離子穩(wěn)態(tài)失衡，最終導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡［23］。上述實(shí)驗(yàn)取樣時(shí)間均為蟾酥給藥后2 h，雖然無(wú)法據(jù)此判斷蟾酥對(duì)基因的影響是直接還是間接作用，但以上結(jié)果為研究蟾酥的心臟毒性提供了新的視野，有助于探索蟾酥心臟毒性的生物標(biāo)志物。

3 藥動(dòng)學(xué)與心臟毒性的相關(guān)性

藥物代謝動(dòng)力學(xué)研究有助于尋找中藥毒性的物質(zhì)基礎(chǔ)。有研究顯示，大鼠單次口服蟾毒靈吸收迅速，2 min即可檢測(cè)出該物質(zhì)，血藥濃度10～30 min可達(dá)峰［24］；大鼠單次靜脈注射蟾酥提取物，測(cè)得蟾毒靈、華蟾酥毒基和脂蟾毒配基3種蟾蜍甾烯類成分代謝迅速，給藥30 min時(shí)，血藥濃度均降至cmax的1/5以下［25］。

新西蘭兔單次靜脈注射蟾酥提取物（蟾毒靈、華蟾酥毒基和脂蟾毒配基所占含量大于95%），其中華蟾酥毒基代謝非常迅速，5 min時(shí)幾乎檢測(cè)不到。蟾毒靈和脂蟾毒配基90 min后基本檢測(cè)不到［26］，且半衰期與大鼠靜脈注射結(jié)果相似，均在24 min左右。

Beagle犬單次靜脈注射給予蟾酥提取物（蟾毒靈、華蟾酥毒基和脂蟾毒配基所占含量大于95%），蟾毒靈、華蟾酥毒基和脂蟾毒配基同大鼠和兔相似，代謝迅速，90 min后血漿中幾乎檢測(cè)不到，且半衰期也與大鼠和兔接近［27］。還有研究進(jìn)行了Beagle犬單次口服給藥和重復(fù)給藥毒性實(shí)驗(yàn)的藥代動(dòng)力學(xué)和毒物效應(yīng)動(dòng)力學(xué)相關(guān)性分析。結(jié)果顯示，單次給藥實(shí)驗(yàn)中，脂蟾毒配基和蟾毒靈在血漿中的濃度與心律下降相關(guān)［28］，提示脂蟾毒配基和蟾毒靈是心臟毒性物質(zhì)基礎(chǔ)。同時(shí)，該實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，重復(fù)給藥未見(jiàn)脂蟾毒配基和蟾毒靈等蟾酥成分蓄積。

上述研究結(jié)果有助于了解蟾酥的代謝特性，提示蟾酥吸收和代謝快，持續(xù)時(shí)間短暫，長(zhǎng)期服用不會(huì)產(chǎn)生藥物蓄積。如果能在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步研究蟾酥或其有效單體的主要代謝產(chǎn)物、組織分布、血漿蛋白結(jié)合率以及與肝藥酶的相互作用等代謝參數(shù)，將更加有益于指導(dǎo)臨床用藥。

4 解毒劑

有研究顯示，哇巴因可能通過(guò)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路減輕蟾毒靈的心臟毒性［29］；苯妥英鈉、利多卡因（鈉通道阻滯藥）和普萘洛爾（β腎上腺素受體拮抗藥）能對(duì)抗蟾酥致心律失常作用［30］；而維拉帕米（鈣通道阻滯藥）雖然在早期能抑制蟾酥所致心律失常，但是會(huì)加重晚期的心臟傳導(dǎo)阻滯［30-31］；胺碘酮（延長(zhǎng)動(dòng)作電位時(shí)程藥）對(duì)減輕蟾酥所致心臟毒性無(wú)效［30］。一些中藥有效成分也具有對(duì)抗蟾酥心臟毒性的作用，如黃芪甲苷、人參總皂苷和西洋參總皂苷，推測(cè)其機(jī)制可能與改善心肌Na+-K+-ATP酶活性和降低細(xì)胞Ca2+濃度有關(guān)［32］。而牛黃及其衍生物膽紅素和?；撬峥赡苁峭ㄟ^(guò)直接或間接調(diào)節(jié)Ca2+、鈉離子通道來(lái)減輕蟾酥的心臟毒性［35-36］。中藥復(fù)方制劑麝香保心丸［22］、丹羚心舒［33］和六神丸［34］等中均含有蟾酥，然而其心臟毒性并不明顯，可能與上述復(fù)方制劑中同時(shí)含有牛黃或人參有關(guān)。

尋找蟾酥的解毒劑，既有助于從側(cè)面驗(yàn)證蟾酥的毒性機(jī)制，也有助于指導(dǎo)臨床用藥。目前多從原有復(fù)方制劑成分或抗心律失常的大框架中尋找可能的解毒劑，期望隨著科技的進(jìn)步，明確蟾酥的心臟毒性機(jī)制，從而尋求更有針對(duì)性的解毒藥物。

5 展望

現(xiàn)有研究結(jié)果很好地揭示了蟾酥心臟毒性的物質(zhì)基礎(chǔ)，但是缺乏應(yīng)用人源性細(xì)胞的研究，與人體的相關(guān)性仍然欠缺。同時(shí)，已有研究應(yīng)用膜片鉗技術(shù)顯示蟾酥和華蟾酥毒基對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)鈉、鉀離子通道有顯著影響，而對(duì)鈣通道無(wú)影響［37-38］，提示將該技術(shù)應(yīng)用于分析蟾酥對(duì)人源化心臟鉀、鈉和鈣離子通道的毒性特點(diǎn)以及與離子通道的結(jié)合位點(diǎn)將是未來(lái)主要的突破口之一。另有研究通過(guò)X-ray晶體結(jié)構(gòu)在分子水平來(lái)闡釋強(qiáng)心苷與Na+-K+-ATP酶的結(jié)合［39］，若運(yùn)用此技術(shù)分析人源化心肌細(xì)胞上Na+-K+-ATP酶與蟾酥的結(jié)合特點(diǎn)，也將是比較有意義的研究方向。此外，可以推定蟾蜍應(yīng)對(duì)心肌細(xì)胞的多個(gè)離子通道均有作用，故而其對(duì)心臟的作用應(yīng)為對(duì)離子通道的綜合效果。最新的科技手段已經(jīng)可運(yùn)用計(jì)算機(jī)模型模擬人體軀干二維模型［40］同時(shí)評(píng)價(jià)對(duì)人體鉀和L型鈣通道的綜合作用，預(yù)期不久的將來(lái)此技術(shù)也可用于評(píng)價(jià)蟾酥的心臟毒性。

《中國(guó)藥典》中要求以華蟾酥毒基和脂蟾毒配基的含量作為蟾酥的質(zhì)控指標(biāo)，而忽略了另外1個(gè)主要成分蟾毒靈。最新的研究顯示，各產(chǎn)地的蟾酥上述3種成分的含量和之間的比例差別巨大［41］，故而待明確蟾酥的心臟毒性機(jī)制后，比較三者之間的毒性大小，既可完善蟾酥的質(zhì)量控制體系，保證其用藥的安全性和有效性，亦可能開(kāi)發(fā)出新的中藥單體。

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Progress of experimentalresearch on cardiotoxicity of Chansu

LIMin，LIHua，WANG Xi-jie，MA Jing
（NationalShanghaiCenter for New Drug Safety Evaluation and Research，Shanghai201203，China）

AS a result of a better understanding，people pay increasing attention to the adverse effectof traditional Chinese medicine.Chansu as a rare Chinese traditionalmedicine has been widely used in clinical treatment and known to have cardiotoxicity.The mechanism and relationships with blood drug concentrations need to be elucidated urgently.Bufadienolides，whose chemicalstructure is similar to that of digoxigenin，are the major component of Chansu and also belong to cardiac glycosides. They show both excitation and inhibition effects on the heart.Myocardialcells can not only be excitedto trigger tachycardia and rapid arrhythmias ata low dose，butinhibited to induce heartblock and slow arrhythmias ata high dose.As the key regulator ofintracellular energy and calcium ion concentration，Na+/K+ATPase can be inhibited by bufadienolides through a combination ofalpha subunits ofthe enzyme，resulting in calcium overload and energy disorders in myocardialcells.This mightbe the main mechanism of cardiotoxicity.In this paper，the progress in experimental research of substances of cardiotoxicity，animal tests，enzyme and ion channel，lipid metabolism and ion homeostasis，correlations between pharma?cokinetics and cardiotoxicity are reviewed.

Chansu；cardiotoxicity；Na+/K+ATPase；calcium overload

The projectsupported by NationalScience and Technology Major Projectof China（2015ZX09501004-002-006）；and ShanghaiR&D Public Service Platform Project（13DZ2290100）

MA Jing，E-mail：jma@ncdser.com

R285.1

A

1000-3002-（2016）05-0605-06

10.3867/j.issn.1000-3002.2016.05.019

2015-05-02接受日期：2016-03-18）

（本文編輯：齊春會(huì)）

國(guó)家重大科技專項(xiàng)（2015ZX09501004-002-006）；上海市研發(fā)公共服務(wù)平臺(tái)專項(xiàng)（13DZ2290100）

李旻，博士研究生，主要從事心臟毒理學(xué)研究，E-mail：mli@ncdser.com

馬璟，E-mail：jma@ncdser.com