陶云霞　蔡　磊　沈　輝　朱玉強(qiáng)　邱玉華　顧巧麗　耿德春　施　勤

(蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院骨科，蘇州215006)

[摘　要]　目的：利用降植烷構(gòu)建一種模擬人類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎發(fā)病過(guò)程的小鼠模型。方法：6~8周雌性BALB/c小鼠30只，隨機(jī)分為模型組和對(duì)照組，每組15只。模型組于0周、9周、18周時(shí)經(jīng)腹腔注射0.5 ml降植烷；對(duì)照組注射0.5 ml生理鹽水。觀察各組小鼠后足足掌厚度變化，并對(duì)關(guān)節(jié)炎的腫脹程度進(jìn)行評(píng)分；H&E染色評(píng)估滑膜增生和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)程度；流式細(xì)胞術(shù)方法檢測(cè)小鼠脾臟中巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、T細(xì)胞和B細(xì)胞的亞群變化。結(jié)果：21周時(shí)，模型組有11只小鼠出現(xiàn)足爪紅腫，足掌平均厚度為(2.90±0.51)mm，與對(duì)照組(1.29±0.47)mm比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；關(guān)節(jié)炎評(píng)分為9.55±2.80。H&E染色結(jié)果顯示模型組脛骨遠(yuǎn)端骨小梁吸收破壞，累及骨皮質(zhì)，關(guān)節(jié)軟骨可見(jiàn)壞死脫落、纖維化，呈現(xiàn)出明顯的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎病理改變。流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果顯示，造模21周時(shí)，脾臟細(xì)胞中CD11b、CD11c和GR1表達(dá)明顯增加，提示巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和中性粒細(xì)胞亞群數(shù)量增加；同時(shí)，CD4、CD8、CD154的分子表達(dá)也明顯上調(diào)，與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論：經(jīng)腹腔注射降植烷能夠成功誘導(dǎo)小鼠關(guān)節(jié)炎，并產(chǎn)生與RA患者類似的組織病理和免疫學(xué)改變。降植烷誘導(dǎo)的小鼠關(guān)節(jié)炎模型，能夠較為準(zhǔn)確地模擬臨床類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的發(fā)病過(guò)程。

[關(guān)鍵詞]　降植烷；類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎；小鼠模型

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2015.11.012

降植烷誘導(dǎo)小鼠類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的模型①

陶云霞蔡磊②沈輝②朱玉強(qiáng)②邱玉華②顧巧麗耿德春施勤

(蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院骨科，蘇州215006)

[摘要]目的：利用降植烷構(gòu)建一種模擬人類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎發(fā)病過(guò)程的小鼠模型。方法：6~8周雌性BALB/c小鼠30只，隨機(jī)分為模型組和對(duì)照組，每組15只。模型組于0周、9周、18周時(shí)經(jīng)腹腔注射0.5 ml降植烷；對(duì)照組注射0.5 ml生理鹽水。觀察各組小鼠后足足掌厚度變化，并對(duì)關(guān)節(jié)炎的腫脹程度進(jìn)行評(píng)分；H&E染色評(píng)估滑膜增生和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)程度；流式細(xì)胞術(shù)方法檢測(cè)小鼠脾臟中巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、T細(xì)胞和B細(xì)胞的亞群變化。結(jié)果：21周時(shí)，模型組有11只小鼠出現(xiàn)足爪紅腫，足掌平均厚度為(2.90±0.51)mm，與對(duì)照組(1.29±0.47)mm比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；關(guān)節(jié)炎評(píng)分為9.55±2.80。H&E染色結(jié)果顯示模型組脛骨遠(yuǎn)端骨小梁吸收破壞，累及骨皮質(zhì)，關(guān)節(jié)軟骨可見(jiàn)壞死脫落、纖維化，呈現(xiàn)出明顯的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎病理改變。流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果顯示，造模21周時(shí)，脾臟細(xì)胞中CD11b、CD11c和GR1表達(dá)明顯增加，提示巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和中性粒細(xì)胞亞群數(shù)量增加；同時(shí)，CD4、CD8、CD154的分子表達(dá)也明顯上調(diào)，與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論：經(jīng)腹腔注射降植烷能夠成功誘導(dǎo)小鼠關(guān)節(jié)炎，并產(chǎn)生與RA患者類似的組織病理和免疫學(xué)改變。降植烷誘導(dǎo)的小鼠關(guān)節(jié)炎模型，能夠較為準(zhǔn)確地模擬臨床類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的發(fā)病過(guò)程。

[關(guān)鍵詞]降植烷；類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎；小鼠模型

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2015.11.012

中圖分類號(hào)①本文受國(guó)家自然科學(xué)基金(No.81373236)和江蘇省骨科臨床醫(yī)學(xué)研究中心(BL2012004)資助。;②蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)部免疫系，蘇州215123。

作者簡(jiǎn)介：陶云霞(1983年-)，女,主管技師，主要從事免疫學(xué)及醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)方面的研究，E-mail: taoyx8493@163.com。

通訊作者及指導(dǎo)教師：施勤(1971年-),女，博士，副教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事免疫學(xué)研究， E-mail: qshisz@126.com。

[Abstract]Objective:To establish a pristine-induced rheumatoid arthritis model in mice,and to evaluate its histological and immunological distinction.Methods: Thirty female BALB/c mice,6-8 weeks old,were randomly divided into 2 groups,a control group and pristine group.The mice in pristine group were injected intraperitoneally with 0.5 ml pristine three times at 0,9,and 18 weeks,while mice in the control group receiving saline at the same time.Arthritis score and paw thickness were measured and histopathological assessment of joint sections was performed.The expression of phagocytes,dendritic,neutrophils,T and B cells markers in spleen were determined by flow cytometry.Results: In model-marking group,11 mice were presented with macroscopic evidence of arthritis such as erythema or swelling.The paw thickness in pristine-induced mice was significant higher than that in the control groups[(2.90±0.51)mm vs(1.29±0.47 mm),P<0.05].In addition,arthritis score in pristine-induced mice was 9.55±2.80 at 21 weeks after first injection with 0.5 ml pristine.H&E staining revealed a significant increase of synovial inflammation,cartilage and bone destruction after stimulated with pristine.Meanwhile,the expression levels of CD11b,CD11c,GR1,CD4,CD8 and CD154 were obviously increased in model-marking group when compared with that in control group.Conclusion: The pristine-induced model presents the similar histological and immunological distinctions with human rheumatism arthritis,which can mimic the pathogenesis of rheumatism arthritis.

Pristine-induced rheumatoid arthritis model in mice

TAOYun-Xia,CAILei,SHENHui,ZHUYu-Qiang,QIUYu-Hua,GUQiao-Li,GENGDe-Chun,SHIQin.DepartmentofOrthopedics,theFirstAffiliatedHospitalofSoochowUniversity,Suzhou215006,China

[Key words]Pristine；Rheumatoid arthritis；Mouse model

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid arthritis,RA)是一種以進(jìn)行性、侵蝕性關(guān)節(jié)破壞為特征性病理改變的全身性自身免疫病。其基本病理改變主要是滑膜慢性炎癥及關(guān)節(jié)軟骨和骨質(zhì)的破壞，臨床特征為關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)的炎癥和腫脹、慢性進(jìn)行性病程，并可致多個(gè)關(guān)節(jié)完全強(qiáng)直，最終導(dǎo)致功能的喪失，致殘率高[1]。因此，為臨床發(fā)病機(jī)制的研究及尋找新的診療手段，建立一種能準(zhǔn)確模擬RA發(fā)病過(guò)程的動(dòng)物模型尤為重要。目前，最為常用的RA模型為Ⅱ型膠原誘導(dǎo)的小鼠或大鼠模型，但其建模過(guò)程需要通過(guò)尾靜脈注射Ⅱ型膠原和佐劑的混合物，操作難度大[2]。降植烷是一種常用的致炎劑，有文獻(xiàn)報(bào)道其能不依賴于T或B細(xì)胞激活免疫系統(tǒng)引起免疫反應(yīng)[3,4]。本文以BALB/c小鼠為研究對(duì)象，擬制備降植烷誘導(dǎo)的RA小鼠模型并對(duì)其免疫病理變化進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組6~8周雌性BALB/c小鼠30只，體質(zhì)量25~30 g，由蘇州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。采用隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組及對(duì)照組，每組15只。SPF級(jí)動(dòng)物房常規(guī)飼養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)方案得到蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2主要試劑降植烷，即2,6,10,14-四甲基十五烷，購(gòu)于美國(guó)Sigma公司 。PE標(biāo)記抗小鼠抗體CD11b、CD11c、Gr1，F(xiàn)ITC標(biāo)記CD4、CD8、CD21、CD23、CD80、CD86、CD154(CD40L)，APC標(biāo)記抗小鼠抗體B220均購(gòu)置美國(guó)eBioscience公司。

1.3降植烷誘導(dǎo)RA小鼠模型的制備小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，造模組于0周、9周、18周時(shí)腹腔各注射0.5 ml降植烷；對(duì)照組于相同時(shí)間腹腔注射0.5 ml生理鹽水。第21周時(shí)，采用頸椎脫臼法處死小鼠，保留小鼠脾臟及雙側(cè)后肢關(guān)節(jié)，分別行免疫學(xué)及組織病理學(xué)檢測(cè)。

1.4小鼠足趾厚度的測(cè)定從第18周起，使用游標(biāo)卡尺對(duì)小鼠同側(cè)的后足跗跖關(guān)節(jié)肉厚處進(jìn)行測(cè)量，每周測(cè)量2次，每次重復(fù)測(cè)量3次，取平均值。所有測(cè)量由兩名實(shí)驗(yàn)者獨(dú)立完成。

1.5關(guān)節(jié)炎指數(shù)評(píng)分(Arthritis index,AI)從第18周起，對(duì)各組小鼠關(guān)節(jié)腫脹程度進(jìn)行評(píng)分，每周評(píng)測(cè)2次，每次重復(fù)測(cè)量3次，取平均值。采用關(guān)節(jié)炎評(píng)分法(0~4分)[5]，0分：無(wú)關(guān)節(jié)炎；1分：有紅色斑點(diǎn)或輕度腫脹；2分：關(guān)節(jié)部位中度腫脹；3分：嚴(yán)重腫脹；4分：嚴(yán)重腫脹且不能負(fù)重，四肢評(píng)分的和即為關(guān)節(jié)炎指數(shù)(最大分?jǐn)?shù)16)。

1.6流式細(xì)胞檢測(cè)脾細(xì)胞免疫分子表達(dá)變化取小鼠脾臟制成單細(xì)胞懸液，5×105個(gè)細(xì)胞加入各流式分析管，分別加入PE標(biāo)記抗小鼠抗體CD11b、CD11c、Gr1，F(xiàn)ITC標(biāo)記CD4、CD8、CD21、CD23、CD80、CD86、CD154(CD40L)，APC標(biāo)記抗小鼠抗體B220 4℃避光孵育1 h，經(jīng)洗滌，1%多聚甲醛固定，流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞的免疫分子在脾臟細(xì)胞中的表達(dá)情況。

1.7組織學(xué)觀察小鼠處死后切取后肢膝關(guān)節(jié)，剔除皮毛和肌肉浸泡于4%甲醛溶液固定3 d，而后放入10%EDTA液中脫鈣30 d，常規(guī)石蠟包埋，4 μm切片，H&E染色，普通光鏡觀察。

2結(jié)果

2.1小鼠一般情況造模期間，小鼠無(wú)死亡。正常組小鼠精神狀態(tài)好，能正常爬行，關(guān)節(jié)活動(dòng)自如，無(wú)紅腫；第三次注射免疫(18周)后，造模組有11只小鼠出現(xiàn)癥狀(成模率73.3%)，具體表現(xiàn)為足爪紅腫，體型消瘦，毛色雜亂稀疏，步態(tài)異常，倦怠易激惹；足部存在不同程度腫脹，關(guān)節(jié)增粗，黏膜紅腫滲出。見(jiàn)圖1。小鼠足掌厚度測(cè)量結(jié)果顯示，21周時(shí)模型組小鼠后足腫脹最為明顯，厚度為(2.90±0.51)mm，與對(duì)照組(1.29±0.47)mm比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-6.097；P<0.05)；關(guān)節(jié)炎評(píng)分結(jié)果顯示21周時(shí)11只成模小鼠中，有4只癥狀較輕，7只發(fā)病嚴(yán)重，關(guān)節(jié)炎指數(shù)為9.55±2.80。

2.2組織病理學(xué)觀察正常小鼠膝關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)完整無(wú)損，無(wú)骨小梁吸收，關(guān)節(jié)軟骨光滑平整(圖2A)。模型組小鼠膝關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)被破壞，有骨小梁吸收，關(guān)節(jié)軟骨可見(jiàn)壞死脫落，纖維化，關(guān)節(jié)腔狹窄。炎細(xì)胞大量浸潤(rùn)，伴有程度不同的軟組織水腫(圖2B)。

圖1　21周時(shí)，小鼠右后肢大體改變Fig.1　Representative photographs of right hind paws of mice on week 21Note: A.Control group；B.Model-making group.

圖2　小鼠右后肢膝關(guān)節(jié)H&E染色結(jié)果(×20)Fig.2　Right ankle joints of mice obtained on week 21 were stained with haematoxylin and eosin(×20)Note: A.Control group;B.Model-making group.

表1　小鼠脾臟中巨噬細(xì)胞(CD11b+)、樹突狀細(xì)胞(CD11c+)和中性粒細(xì)胞(GR1+)的陽(yáng)性率(%，±s，n=15)Tab.1　Expression level of phagocytes(CD11b+),dendritic(CD11c+)and neutrophils(GR1+)in spleen(%，±s，n=15)

表1　小鼠脾臟中巨噬細(xì)胞(CD11b+)、樹突狀細(xì)胞(CD11c+)和中性粒細(xì)胞(GR1+)的陽(yáng)性率(%，±s，n=15)Tab.1　Expression level of phagocytes(CD11b+),dendritic(CD11c+)and neutrophils(GR1+)in spleen(%，±s，n=15)

GroupsCD11bCD11cGR1Controlgroup12.11±5.879.20±2.6410.08±5.014Model-makinggroup18.71±11.781)11.81±6.172)15.15±9.302)

Note：Compared to model-making group，1)P<0.05，2)P<0.01.

表2　脾臟T細(xì)胞中CD4、CD8a和CD154的表達(dá)(%，±s，n=15)Tab.2　Expression of CD4,CD8a and CD154 on T cell in spleen(%，±s，n=15)

表2　脾臟T細(xì)胞中CD4、CD8a和CD154的表達(dá)(%，±s，n=15)Tab.2　Expression of CD4,CD8a and CD154 on T cell in spleen(%，±s，n=15)

GroupsCD4CD8aCD154Controlgroup2.25±0.970.04±0.031.14±0.12Model-makinggroup21.5375±4.552)0.13±0.991)1.44±0.481)

Note：Compared to model-making group，1)P<0.05，2)P<0.01.

2.3小鼠脾細(xì)胞流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果21周時(shí)取脾臟制成單細(xì)胞懸液，熒光抗體標(biāo)記后經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)，結(jié)果顯示，模型組脾臟細(xì)胞中CD11b、CD11c和GR1表達(dá)明顯增加，提示吞噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和中性粒細(xì)胞亞群數(shù)量增加(表1，P<0.05)。模型組中T細(xì)胞表面的表面標(biāo)志CD4、CD8、CD154均有不同程度的增高，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表2，P<0.05)。模型組和對(duì)照組脾臟細(xì)胞中B220及CD21、CD23、CD80、CD86的表達(dá)未有明顯差異(P>0.05，結(jié)果未列出)。

3討論

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎是一種累及全身關(guān)節(jié)的自身免疫性疾病，其病理特征是慢性炎細(xì)胞浸潤(rùn)和滑膜增生，最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨和骨質(zhì)破壞[1]。迄今為止，RA發(fā)生的確切機(jī)制尚不清楚，還沒(méi)有有效的預(yù)防和治療方法，所以，建立一種能夠準(zhǔn)確模擬人類RA發(fā)病過(guò)程的動(dòng)物模型對(duì)研究RA病因及藥物治療至關(guān)重要。

降植烷，即2,6,10,14-四甲基十五烷，是葉綠素分解后的產(chǎn)物。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)降植烷能促進(jìn)小鼠B淋巴細(xì)胞瘤的發(fā)生[6]，而將降植烷經(jīng)腹腔注射后能誘導(dǎo)產(chǎn)生狼瘡特異性抗體，實(shí)驗(yàn)小鼠表現(xiàn)出明顯的系統(tǒng)性紅斑狼瘡的特征[7-9]。在本研究中，筆者將0.5 ml降植烷經(jīng)腹腔注射給BALB/c小鼠，并在9周和18周時(shí)各補(bǔ)注1次，21周時(shí)實(shí)驗(yàn)小鼠表現(xiàn)出明顯的關(guān)節(jié)炎癥狀，發(fā)病率為73.7%，與Potter等[10]報(bào)道一致。組織學(xué)染色發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)小鼠關(guān)節(jié)滑膜增生明顯，有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，以中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞為主，軟骨和骨組織破壞明顯，有血管翳形成，與人類RA患者病變關(guān)節(jié)組織病理改變類似。汪婷婷等[4]在降植烷誘導(dǎo)的大鼠關(guān)節(jié)炎模型中也發(fā)現(xiàn)了類似的病理改變。上述結(jié)果提示經(jīng)腹腔注射降植烷能夠誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生關(guān)節(jié)炎病理改變。

有研究表明，T細(xì)胞尤其是CD4+T細(xì)胞在RA發(fā)病過(guò)程中起重要作用[11]。在RA滑膜浸潤(rùn)的單核細(xì)胞中，30%～50%為T細(xì)胞，而且這些細(xì)胞多處于活化狀態(tài)，并且通過(guò)與巨噬細(xì)胞相互作用，引起軟骨和骨組織破壞[11-13]。筆者研究發(fā)現(xiàn)，降植烷免疫后的小鼠脾臟中CD4、CD8和CD154+T細(xì)胞數(shù)量明顯增多，提示降植烷可能通過(guò)調(diào)節(jié)T細(xì)胞引起小鼠關(guān)節(jié)炎病理改變。Holmberg等[3]的研究表明降植烷是一種非免疫原性的佐劑，不能被T細(xì)胞或B細(xì)胞特異性識(shí)別，降植烷致關(guān)節(jié)炎的能力也就取決于其對(duì)免疫系統(tǒng)的非特異性刺激引起的自身反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞活化，引起關(guān)節(jié)急性炎癥，隨后進(jìn)入慢性進(jìn)展和反復(fù)發(fā)作階段。因此，在免疫學(xué)特征方面，降植烷誘導(dǎo)的RA模型可能更類似于RA患者，更適于RA病理機(jī)制的研究。

B細(xì)胞在RA關(guān)節(jié)滑膜中的數(shù)量較少，但近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)B細(xì)胞在RA發(fā)病機(jī)制中起重要作用[14]。Takemura等[15]證實(shí)RA滑膜中T細(xì)胞的激活和作用是B細(xì)胞依賴性的；B細(xì)胞作為一種抗原遞呈細(xì)胞，向T細(xì)胞提供共刺激信號(hào)；B細(xì)胞還能通過(guò)分泌TNF-α等炎癥因子、趨化因子以及類風(fēng)濕因子等進(jìn)一步加重RA關(guān)節(jié)破壞[16,17]。我們的結(jié)果顯示在降植烷誘導(dǎo)小鼠狼瘡性腎炎的起始階段可引起B(yǎng)細(xì)胞功能活化[7]，但是，在本研究中流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果表明，降植烷免疫后的小鼠脾臟內(nèi)B細(xì)胞表面標(biāo)志CD21、CD23、CD80、CD86的表達(dá)未有明顯差異，我們推測(cè)B細(xì)胞功能在降植烷引起的后期免疫反應(yīng)趨于穩(wěn)定。

綜上所述，經(jīng)腹腔注射降植烷能夠成功誘導(dǎo)小鼠關(guān)節(jié)炎，并產(chǎn)生與RA患者類似的免疫學(xué)改變，是一種可靠的RA動(dòng)物模型，為探討RA的發(fā)病機(jī)制及尋找RA的診療的新技術(shù)新方法提供研究工具和物質(zhì)基礎(chǔ)。

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[收稿2015-07-11修回2015-08-26]

(編輯張曉舟)