李國(guó)新，童 武，鄭 浩，童光志（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241）

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疫苗研究豬偽狂犬病毒變異毒株的特性及其疫苗的研究現(xiàn)狀

李國(guó)新，童 武，鄭 浩，童光志*
（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241）

豬偽狂犬病是由偽狂犬病毒引起的高死亡率的急性傳染病。該病在我國(guó)發(fā)生較為嚴(yán)重，是嚴(yán)重危害我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)的疫病之一。我國(guó)于20世紀(jì)70 年代從匈牙利引進(jìn)了偽狂犬疫苗Bartha-k61株，自20世紀(jì)90 年代以來(lái)國(guó)內(nèi)規(guī)?；i場(chǎng)普遍使用該基因缺失疫苗，使豬偽狂犬病得到了很好的控制。但是，自2011年以來(lái)，一種由偽狂犬病毒變異毒株引起的豬偽狂犬病在我國(guó)暴發(fā)，造成母豬繁殖障礙和初生乳豬死亡，給我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1-4]。針對(duì)新出現(xiàn)的偽狂犬病毒變異毒株，國(guó)內(nèi)多家研究機(jī)構(gòu)對(duì)其基因特征、抗原性和致病性等進(jìn)行了一系列的研究，并在此基礎(chǔ)上，開(kāi)展了疫苗的研制工作。

1 偽狂犬病毒變異毒株的基因特征

通過(guò)對(duì)偽狂犬病毒的全基因組以及各基因序列進(jìn)行比較分析，發(fā)現(xiàn)我國(guó)分離的偽狂犬病毒基因序列與國(guó)外（主要是歐洲及美洲）分離的毒株序列存在顯著的差異，系統(tǒng)發(fā)育分析進(jìn)一步表明中國(guó)的分離株與國(guó)外的分離株進(jìn)化關(guān)系較遠(yuǎn)，形成兩個(gè)不同的基因型。病毒毒力相關(guān)基因比較分析顯示，我國(guó)新出現(xiàn)的變異毒株與國(guó)內(nèi)早期經(jīng)典毒株Ea株和Fa株存在一定的遺傳差異，不過(guò)這些差異對(duì)病毒毒力和感染特性的影響還需要進(jìn)一步研究[5]。

2 偽狂犬病毒變異毒株致病性分析

與經(jīng)典的偽狂犬病毒強(qiáng)毒株相比，偽狂犬病毒變異毒株對(duì)小鼠和豬的致病力明顯增強(qiáng)。我們的研究進(jìn)一步證實(shí)，對(duì)于15日齡、30日齡和60日齡的豬，偽狂犬病毒變異毒株感染豬發(fā)病更快，臨床癥狀和病理變化更嚴(yán)重，死亡率也更高。而且，感染豬的臨床表現(xiàn)與豬的日齡、毒株的毒力以及接種劑量密切相關(guān)[6]。

3 偽狂犬病活疫苗（Bartha-K61株）和變異毒株的抗原性差異

Bartha-k61株誘導(dǎo)的中和抗體對(duì)變異毒株的中和能力遠(yuǎn)低于對(duì)Bartha-k61 株或經(jīng)典強(qiáng)毒株的中和能力。而變異毒株誘導(dǎo)的中和抗體對(duì)變異毒株和Bartha-k61株都具有較高的中和能力。表明偽狂犬病毒變異毒株與傳統(tǒng)疫苗株及經(jīng)典強(qiáng)毒株的抗原性存在一定的差異。對(duì)于偽狂犬病毒變異毒株的攻擊，豬偽狂犬病活疫苗（Bartha-K61株）對(duì)接種羊只能提供50%的保護(hù)；而對(duì)于經(jīng)典偽狂犬病毒強(qiáng)毒株的攻擊，則提供了100%的保護(hù)。同樣，對(duì)于偽狂犬病毒變異毒株的攻擊，Bartha-K61株對(duì)接種豬只能提供部分保護(hù)[7]。偽狂犬病毒變異毒株增強(qiáng)的毒力與抗原性變化可能是導(dǎo)致疫苗免疫豬場(chǎng)發(fā)生豬偽狂犬病的重要原因。

4 豬偽狂犬病疫苗研制現(xiàn)狀

對(duì)于新出現(xiàn)的偽狂犬病毒變異毒株的侵襲，傳統(tǒng)的偽狂犬病疫苗已不能提供完全的保護(hù)。感染豬場(chǎng)偽狂犬病毒gE 抗體陽(yáng)性率顯著升高，并伴有母豬繁殖障礙和初生乳豬死亡。因此，針對(duì)偽狂犬病毒變異毒株，國(guó)內(nèi)多家研究機(jī)構(gòu)開(kāi)展了疫苗的研制工作。

4.1 豬偽狂犬病基因缺失活疫苗的研制

4.1.1 豬偽狂犬病雙基因缺失疫苗候選毒株 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所利用同源重組技術(shù)把偽狂犬病毒變異毒株（JS-2012株）進(jìn)行基因缺失，構(gòu)建了gE和gI雙基因缺失的偽狂犬病毒（JS-2012-△gI/gE株）。該毒株接種11日齡仔豬不引起任何臨床癥狀，而且該毒株不能水平傳播和垂直傳播，安全性良好。用105.0TCID50的JS-2012-△gI/gE株肌肉注射或鼻腔接種4周齡仔豬，能誘導(dǎo)高水平的中和抗體，并能使接種豬完全抵抗偽狂犬病毒變異毒株（JS-2012株）的攻擊。中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所利用同源重組技術(shù)把偽狂犬病毒變異毒株（TJ株）進(jìn)行基因缺失，構(gòu)建了gE和gI雙基因缺失的偽狂犬病毒（rPRVTJ-delgE株）。該毒株在PK-15細(xì)胞上的增殖滴度低于其母源毒株（TJ株），但與疫苗株（Bartha-K61株）無(wú)明顯差別。用103、104和105TCID50的rPRVTJ-delgE分別接種6周齡仔豬，7天內(nèi)沒(méi)有觀察到臨床反應(yīng)，也沒(méi)有檢測(cè)到病毒排出。接種后第7天用偽狂犬病毒變異毒株（TJ株）攻擊，所有的接種豬都得到了保護(hù)。在攻毒前，即使沒(méi)有檢測(cè)到中和抗體的仔豬，也能抵抗強(qiáng)毒的攻擊[7]。這提示，偽狂犬病毒雙基因缺失毒株可以快速激發(fā)機(jī)體免疫應(yīng)答，使接種豬能抵抗強(qiáng)毒的攻擊，而這種保護(hù)與中和抗體水平并無(wú)必然的聯(lián)系。

4.1.2 豬偽狂犬病三基因缺失疫苗候選毒株 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所在雙基因缺失毒株（rPRVTJ-delgE株）的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步缺失了TK基因，構(gòu)建了三基因缺失的偽狂犬病毒（ rPRVTJ-delgE/ gI/TK 株）。實(shí)驗(yàn)證明，該毒株安全性與免疫原性良好[8]。國(guó)家獸用藥品工程技術(shù)研究中心利用細(xì)菌人工染色體技術(shù)（BAC）把偽狂犬病毒變異毒株（HN1201株）進(jìn)行了基因缺失，構(gòu)建了TK、gE和gI三基因缺失的偽狂犬病毒（vPRV HN1201TK-/gE-/gI-株）。與母源毒株（HN1201株）相比，三基因缺失毒株（vPRV HN1201TK-/gE-/ gI-株）在Vero細(xì)胞上有相似的生長(zhǎng)特性，基因缺失對(duì)病毒在Vero細(xì)胞上的增殖沒(méi)有產(chǎn)生大的影響。用107TCID50的vPRV HN1201 TK-/gE-/gI-鼻腔接種9日齡仔豬，沒(méi)有觀察到臨床反應(yīng)。4周后，用107TCID50的偽狂犬病毒變異毒株（HN1201株）攻擊，對(duì)照組豬全部死亡，而免疫組豬除了個(gè)別豬有一過(guò)性的發(fā)熱外，沒(méi)有表現(xiàn)出其他任何臨床癥狀[9]。華中農(nóng)業(yè)大學(xué)利用同源重組技術(shù)把偽狂犬病毒變異毒株（SMX株）進(jìn)行基因缺失，構(gòu)建了TK、gE和gI三基因缺失的偽狂犬病毒（rSMX△gI/ gE△TK株）。該毒株接種1日齡仔豬不引起任何臨床癥狀，哨兵豬也一直保持偽狂犬病毒抗體陰性。用106.0TCID50的rSMX△gI/gE△TK肌肉注射接種3周齡仔豬，能誘導(dǎo)高水平的中和抗體，并能使接種豬完全抵抗偽狂犬病毒變異毒株（SMX株）的攻擊[10]。

4.2 豬偽狂犬病基因缺失滅活疫苗的研制

4.2.1 豬偽狂犬病單基因缺失滅活疫苗候選毒株 國(guó)家獸用藥品工程技術(shù)研究中心利用同源重組技術(shù)把偽狂犬病毒變異毒株（HN1201株）進(jìn)行了基因缺失，構(gòu)建了gE基因缺失的偽狂犬病毒（HN1201△gE株）。該毒株在PK-15上的生長(zhǎng)特性與母源毒株（HN1201株）沒(méi)有明顯差別。利用該毒株制備的滅活疫苗免疫3周齡仔豬，免疫后1周檢測(cè)到了中和抗體。4周后，用107TCID50的偽狂犬病毒變異毒株（HN1201株）攻擊，對(duì)照組豬全部發(fā)病并死亡，而免疫組豬只是在攻毒后4天內(nèi)有一過(guò)性的發(fā)熱，沒(méi)有表現(xiàn)出其他任何明顯的臨床癥狀[11]。

4.2.2 豬偽狂犬病雙基因缺失滅活疫苗候選毒株 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所利用構(gòu)建的gE 和gI雙基因缺失毒株（JS-2012-△gI/gE株）進(jìn)行了豬偽狂犬病滅活疫苗的研制。該滅活疫苗高劑量接種2周齡仔豬，不引起任何臨床不良反應(yīng)，不影響仔豬的生長(zhǎng)。用該滅活疫苗高劑量接種妊娠約45日左右的母豬，不引起任何臨床不良反應(yīng)，也不影響母豬的生產(chǎn)性能。該滅活疫苗免疫仔豬能產(chǎn)生高水平的中和抗體，并能抵抗偽狂犬病毒變異毒株（JS-2012株）的攻擊。該滅活疫苗免疫妊娠母豬，可以使初生仔豬獲得被動(dòng)免疫保護(hù)。南京農(nóng)業(yè)大學(xué)利用細(xì)菌人工染色體技術(shù)（BAC）把偽狂犬病毒變異毒株（ZJ01株）進(jìn)行了基因缺失，構(gòu)建了gE和gI基因缺失的偽狂犬病毒（vZJ01△gE/gI株）。把偽狂犬病毒（vZJ01△gE/gI株）滅活后制備成滅活疫苗，免疫4周齡仔豬，能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生針對(duì)變異株的中和抗體。第二次免疫后3周用106TCID50的偽狂犬病毒變異毒株（ZJ01株）攻擊，對(duì)照組豬全部死亡，而免疫組全部保持健康[12]。

總之，對(duì)于新出現(xiàn)的偽狂犬病毒變異毒株，國(guó)內(nèi)的研究機(jī)構(gòu)做了大量的工作。對(duì)偽狂犬變異毒株的基因特征、抗原性以及毒力等生物學(xué)特性有了初步的認(rèn)識(shí)，這對(duì)疫苗的研制提供了良好的基礎(chǔ)。無(wú)論是活疫苗還是滅活疫苗，豬偽狂犬病疫苗的研究策略都以基因缺失毒株作為疫苗候選毒株，這樣既降低了疫苗候選毒株的毒力，還有利于利用血清學(xué)方法對(duì)疫苗接種豬和野毒感染豬進(jìn)行鑒別診斷。目前，針對(duì)新出現(xiàn)的偽狂犬病毒變異毒株，國(guó)內(nèi)的研究機(jī)構(gòu)正在加緊研制豬偽狂犬病基因缺失活疫苗或滅活疫苗，并進(jìn)展順利。在不久的將來(lái)，一批優(yōu)良的疫苗就會(huì)從實(shí)驗(yàn)室走向市場(chǎng)，為偽狂犬病的控制甚至根除做出貢獻(xiàn)。

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收稿日期：（2016-01-07）

*通訊作者，gztong@shvri.ac.cn

基金項(xiàng)目：上海市青年自然科學(xué)基金（14ZR1448900)和上海市農(nóng)委科技興農(nóng)項(xiàng)目資助（滬農(nóng)科攻字（2015）第1-7號(hào)）