林鑫子，　黃晨玲子，　羅　新，　帥翰林

(暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院婦產(chǎn)科,廣東 廣州 510632)

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人早孕蛻膜間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療大鼠宮腔粘連*

林鑫子，黃晨玲子，羅新△，帥翰林△

(暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院婦產(chǎn)科,廣東 廣州 510632)

[摘要]目的： 探討人早孕蛻膜間充質(zhì)干細(xì)胞(hDMSCs)治療大鼠宮腔粘連(IUA)的可行性和有效性。方法: 體外分離、培養(yǎng)、純化、鑒定hDMSCs。將30只雌性SD大鼠隨機(jī)分為3組：蛻膜間充質(zhì)干細(xì)胞治療組(IUA+hDMSCs)、IUA模型組和假手術(shù)(sham)組，每組各10只。IUA+hDMSCs組和IUA組復(fù)制IUA模型后10 min內(nèi)，IUA+hDMSCs組經(jīng)尾靜脈注射2×106個(gè)Dio標(biāo)記的hDMSCs，每3天補(bǔ)充1次，連續(xù)注射3次；IUA組經(jīng)尾靜脈注射相同容量的PBS；sham組僅行開腹手術(shù)。3個(gè)動(dòng)情周期后取子宮行HE染色和Masson染色，測(cè)量子宮內(nèi)膜厚度、子宮內(nèi)膜腺體數(shù)目、子宮內(nèi)膜小血管數(shù)目和纖維化面積比率，并行免疫組化檢測(cè)子宮內(nèi)膜組織細(xì)胞角蛋白、波形蛋白、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)-β1及整合素αγβ3的表達(dá)量，qPCR檢測(cè)IUA相關(guān)基因含量，免疫熒光觀察hDMSCs在內(nèi)膜中的分布情況，并評(píng)估大鼠的生育能力。結(jié)果:IUA組部分子宮腔閉鎖，內(nèi)膜萎縮，腺體減少，大量纖維化改變。IUA+hDMSCs組與IUA組相比子宮間質(zhì)厚度明顯增加(P<0.05)，大量腺體增生和小血管新生(P<0.05)，纖維化程度減小(P<0.05)，與sham組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。IUA+hDMSCs組細(xì)胞角蛋白、波形蛋白和整合素αγβ3表達(dá)量明顯高于IUA組(P<0.05)，而TGF-β1表達(dá)量低于IUA組(P<0.05)。qPCR結(jié)果顯示與IUA組相比，除TNF-α和結(jié)締組織生長(zhǎng)因子下調(diào)外，IUA+hDMSCs組的干細(xì)胞因子、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子和thrombospondin-1均明顯上調(diào)。免疫熒光結(jié)果顯示Dio-hDMSCs主要分布于腔上皮層，部分位于間質(zhì)。IUA+hDMSCs組大鼠雙側(cè)子宮均妊娠，平均胎鼠數(shù)量與IUA組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。結(jié)論:hDMSCs可在受損的大鼠子宮內(nèi)膜中存活、增殖，有效修復(fù)大鼠的子宮內(nèi)膜，抑制IUA。

[關(guān)鍵詞]人早孕蛻膜間充質(zhì)干細(xì)胞； 宮腔粘連; 大鼠

宮腔粘連(intrauterine adhesions，IUA)是由各種因素導(dǎo)致子宮內(nèi)膜基底層損傷和感染引起的子宮頸管、子宮內(nèi)膜和子宮肌層粘連，主要表現(xiàn)為宮腔變形、月經(jīng)失調(diào)和不孕綜合征[1]。子宮內(nèi)膜生理性修復(fù)是由位于子宮內(nèi)膜基底層的干細(xì)胞不斷地增殖分化，形成新的功能層，因此宮腔粘連等子宮內(nèi)膜修復(fù)障礙性疾病是由基底層干細(xì)胞源枯竭所致。目前治療宮腔粘連的方法如宮腔鏡下分離粘連組織、人工周期促內(nèi)膜生長(zhǎng)、放置宮腔屏障支架等均不能促使已經(jīng)損傷枯竭的子宮內(nèi)膜基底層干細(xì)胞再生。人早孕蛻膜間充質(zhì)干細(xì)胞具有自我更新、多項(xiàng)分化能力等特征，可作為治療IUA的種子細(xì)胞。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)具有干細(xì)胞特性的人早孕蛻膜間充質(zhì)干細(xì)胞(human decidual mesenchymal stem cells, hDMSCs)在生理狀態(tài)下參與修復(fù)受損的子宮內(nèi)膜，并可在體外誘導(dǎo)分化為子宮內(nèi)膜組織[2]。本研究擬通過建立IUA動(dòng)物模型，探討hDMSCs修復(fù)子宮內(nèi)膜的可行性和有效性，以期為治療IUA提供新方法。

材料和方法

1實(shí)驗(yàn)材料

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級(jí)健康雌性SD大鼠40只，鼠齡8～10 周，體重200～230 g，由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，飼養(yǎng)于暨南大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理中心SPF級(jí)動(dòng)物房。飼養(yǎng)條件：5只/籠，自由進(jìn)食水，室溫21 ℃～22 ℃，相對(duì)濕度(體積分?jǐn)?shù))40%～70%，噪音低于85 db，通風(fēng)換氣每小時(shí)8～12次。

1.2hDMSCs標(biāo)本來(lái)源實(shí)驗(yàn)所用蛻膜標(biāo)本取材于暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院婦產(chǎn)科門診首次妊娠需要行人工流產(chǎn)術(shù)的健康女性，孕期為45～60 d，年齡在20～28歲。既往無(wú)乙肝、梅毒等傳染性疾病，術(shù)前未服用米非司酮及其它藥物。經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)和孕早期人工流產(chǎn)患者知情同意。在施行人流手術(shù)時(shí)無(wú)菌條件下刮取蛻膜組織，立即放入預(yù)冷的含有青霉素和鏈霉素的PBS緩沖液中，4 ℃保存。

1.3主要實(shí)驗(yàn)試劑及儀器小鼠抗人波形蛋白(vimentin)單克隆抗體和小鼠抗人細(xì)胞角蛋白18(cytokeratin-18)單克隆抗體購(gòu)自武漢博士德;兔抗鼠泛細(xì)胞角蛋白(pan-cytokeratin)單克隆抗體(Santa Cruz);兔抗鼠轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(transforming growth factor β1，TGF-β1)多克隆抗體(沈陽(yáng)萬(wàn)類);兔抗鼠整合素αγβ3(integrin αγβ3)多克隆抗體(Affinity)；濃縮型SABC-CY3 (小鼠IgG)試劑盒(武漢博士德)；DAPI(Sigma)；CM-Dio綠色熒光探針(碧云天)；qPCR引物(上海生工)；熒光倒置相差顯微鏡(Zeiss)。

2實(shí)驗(yàn)方法

2.1hDMSCs的分離和培養(yǎng)以膠原酶聯(lián)合機(jī)械研磨法分離提取hDMSCs[2〗。應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)hDMSCs表面標(biāo)志物CD29、CD34、CD44、CD45、CD73、CD105和W5C5的表達(dá)。成骨成脂誘導(dǎo)分化檢測(cè)hDMSCs多向分化能力。細(xì)胞免疫組織化學(xué)法檢測(cè)hDMSCs波形蛋白和cytokeratin-18表達(dá)情況，鑒定其細(xì)胞來(lái)源。

2.2hDMSCs的CM-Dio標(biāo)記取25 mg CM-Dio綠色熒光探針粉末溶于5 mL DMSO中，配置成CM-Dio標(biāo)記液。取貼壁融合80%的細(xì)胞，以5 μL/mL的比例加入標(biāo)記液，避光于培養(yǎng)箱中孵育30 min，吸棄標(biāo)記液，更換3次新鮮37 ℃的完全培養(yǎng)基后繼續(xù)培養(yǎng)。

2.3實(shí)驗(yàn)分組及hDMSCs移植將30只大鼠隨機(jī)分為3組，每組各10只：IUA+hDMSCs組、IUA組和sham組。麻醉大鼠后，常規(guī)消毒開腹，挑出雙側(cè)宮角，用止血鉗夾閉宮角兩端，于近卵巢端以4.5號(hào)注射器針頭將預(yù)溫至100 ℃的無(wú)菌生理鹽水注射至宮腔，使宮腔充分膨脹10 s。松開遠(yuǎn)端止血鉗，再以冷的生理鹽水沖洗宮腔，關(guān)腹。造模成功后10 min內(nèi)，IUA+hDMSCs組行尾靜脈注射2×106個(gè)Dio-hDMSCs細(xì)胞懸液，此后每隔3天補(bǔ)充1次，連續(xù)3次；IUA組行尾靜脈注射相同容量的PBS；sham組行開腹手術(shù)。

2.4hDMSCs移植后評(píng)價(jià)hDMSCs移植3個(gè)動(dòng)情周期后處死，行大體觀察, 收集雙側(cè)子宮組織，部分至于-80 ℃保存。取雙側(cè)子宮石蠟包埋, 作子宮橫斷面切片，行HE染色、Masson染色和免疫組化染色，每張切片隨機(jī)選擇5個(gè)高倍視野進(jìn)行拍照。以Image-Pro Plus 6.0軟件對(duì)照片進(jìn)行數(shù)據(jù)測(cè)量：HE染色切片測(cè)量各組子宮內(nèi)膜厚度、子宮內(nèi)膜小血管數(shù)目及子宮內(nèi)膜腺體數(shù)目，取其平均值；Masson染色切片可見藍(lán)綠色子宮內(nèi)膜間質(zhì)膠原纖維，測(cè)量子宮內(nèi)膜纖維化面積與子宮內(nèi)膜間質(zhì)總面積的比值，取平均值；同時(shí)取子宮中段橫切面作冰凍切片，熒光顯微鏡觀察移植Dio-hDMSCs在大鼠子宮的存活及分布情況。

2.5免疫組化半定量評(píng)估免疫組織化學(xué)法行pan-cytokeratin、vimentin、TGF-β1和integrin αγβ3染色，觀察范圍為包括子宮內(nèi)膜間質(zhì)層和上皮層在內(nèi)的子宮內(nèi)膜全層，染色陽(yáng)性為棕黃色顆粒。參考文獻(xiàn)[3]方法，在HSI模式下，測(cè)定每高倍視野選定某區(qū)域的總面積(area)、陽(yáng)性產(chǎn)物的總積分吸光度值(integrated absorbance,IA)，計(jì)算該區(qū)域中陽(yáng)性顆粒的平均光密度值(mean density, MD)，公式為MD=IA/area，每個(gè)視野選取5個(gè)區(qū)域，取平均值。

2.6宮腔粘連相關(guān)mRNA表達(dá)水平檢測(cè)將宮腔組織在液氮中進(jìn)行研磨，提取總RNA；按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，采用熒光定量PCR(quantitive PCR, qPCR)測(cè)定相關(guān)因子如: 干細(xì)胞因子(stem cell factor,SCF)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor α, TNF-α)、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)、血小板反應(yīng)蛋白-1(thrombospondin-1,TSP-1)、結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(connective tissue growth factor,CTGF)和胰島素生長(zhǎng)因子-1(insulin-like growth factors-1,IGF-1) 等mRNA的含量，反應(yīng)體系為：反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2.5 μL，7.5 μmol/L的上、下游基因引物各2.0 μL，qPCR Mix 12.5 μL，加8.0 μL的H2O。PCR擴(kuò)增條件為：95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，40個(gè)循環(huán)。qPCR采用2-ΔΔCt法統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果。引物序列如表1。

2.7生育力評(píng)估取10只雌鼠行右側(cè)宮腔造模，造模后隨機(jī)分為IUA+hDMSCs組(尾靜脈注射hDMSCs，n=5)和IUA組(尾靜脈注射PBS，n=5)2組，每只大鼠的左側(cè)宮腔設(shè)為自身對(duì)照(n=10)。3個(gè)動(dòng)情周期后雌鼠與雄性SD大鼠3∶1合籠，合籠當(dāng)日記為孕0.5 d，合籠3 d后分離雌雄鼠，單獨(dú)飼養(yǎng)孕鼠13 d后處死，觀察各組大鼠受孕情況和各組胎鼠的數(shù)量。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用SPSS 16.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，兩組間比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1hDMSCs的細(xì)胞形態(tài)及鑒定

hDMSCs形態(tài)呈短桿狀或長(zhǎng)梭狀(圖1)。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，hDMSCs不表達(dá)造血干細(xì)胞表面標(biāo)志物 CD34和CD45，強(qiáng)表達(dá) CD29、CD44、CD73和CD105，部分表達(dá)W5C5(圖2)。hDMSCs可向成骨、成脂方向分化。免疫組化檢測(cè)hDMSCs表達(dá)vimentin，不表達(dá)cytokeratin。

Figure 1.The cellular morphology of hDMSCs(×100).

圖1 hDMSCs的細(xì)胞形態(tài)

2各組大鼠子宮大體及組織病理學(xué)結(jié)果比較

術(shù)后各組大鼠均健康活躍，IUA組大體可見子宮形態(tài)萎縮硬化，部分子宮上段積水，被大網(wǎng)膜或腸管包裹；HE染色可見宮腔縮窄，子宮內(nèi)膜腺體減少，部分宮腔閉鎖，無(wú)正常皺褶結(jié)構(gòu)；Masson染色顯示間質(zhì)組織大量纖維化，符合宮腔粘連病理改變。IUA+hDMSCs組可見子宮與周圍組織粘連減輕，HE和Masson染色見子宮內(nèi)膜較IUA組有大量新生基質(zhì)細(xì)胞和上皮細(xì)胞，肌層結(jié)構(gòu)有序，間質(zhì)層纖維化減輕，厚度近似正常組織，間質(zhì)內(nèi)大量新生腺體，與sham組相似，見圖3。

Figure 2.The flow cytometry results of hDMSCs.

圖2hDMSCs的流式細(xì)胞結(jié)果

Figure 3.The histopathological examination of endometrium in each group (Masson staining,×40). A: IUA group; B： sham group; C: IUA+hDMSCs group.

圖3各組大鼠子宮組織病理學(xué)檢查結(jié)果

3各組大鼠子宮內(nèi)膜厚度、子宮內(nèi)膜腺體數(shù)量、子宮內(nèi)膜小血管數(shù)量及子宮內(nèi)膜纖維化程度比較

IUA+hDMSCs組大鼠子宮內(nèi)膜厚度為(650.33±170.99) μm，略低于sham組， IUA組的子宮內(nèi)膜厚度為(363.51±235.17) μm，IUA+hDMSCs組及sham組與IUA組的子宮內(nèi)膜厚度比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。IUA+hDMSCs組大鼠子宮內(nèi)膜腺體個(gè)數(shù)為3.42±0.88，IUA+hDMSCs組與sham組的子宮內(nèi)膜腺體數(shù)量比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，均高于IUA組(P<0.05)。IUA+hDMSCs組大鼠子宮內(nèi)膜小血管數(shù)目為21.90±6.32，近似sham組，前二者均多于IUA組(P<0.05)。IUA+hDMSCs組子宮內(nèi)膜纖維化面積比率與sham組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，二者均小于IUA組(P<0.05)，見表2。

*P<0.05vsIUA.

4熒光顯微鏡下移植細(xì)胞在大鼠子宮中的存活及分布

hDMSCs移植3個(gè)動(dòng)情周期后，處死動(dòng)物，橫向包埋并沿長(zhǎng)軸切取子宮組織，DAPI染核，制作冰凍切片，于熒光顯微鏡下觀察。子宮中可見綠色熒光hDMSCs，主要分布于子宮腔上皮層，見圖4。

Figure 4.CM-Dio labeled hDMSCs in endometrium (immunofluorescence staining,×400).

圖4CM-Dio標(biāo)記hDMSCs在大鼠子宮中的存活及分布

5各組免疫組化4種蛋白水平表達(dá)結(jié)果比較

Cytokeratin免疫組化結(jié)果顯示：IUA+hDMSCs組可見大量棕黃色顆粒沉積于柱狀上皮細(xì)胞胞漿中；IUA組子宮內(nèi)膜雜亂，棕黃色顆粒沉積于上皮細(xì)胞胞漿中，分布不均勻。Vimentin免疫組化結(jié)果顯示：IUA+hDMSCs組可見棕黃色顆粒沉積于基質(zhì)細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞中，腺上皮細(xì)胞中未見沉積；IUA組見淡棕黃色顆粒分布于間質(zhì)中。TGF-β1免疫組化結(jié)果顯示：IUA+hDMSCs組可見棕黃色顆粒沉積于上皮細(xì)胞中，IUA組見大量棕黃色顆粒分布于上皮細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞中。Integrin αγβ3免疫組化結(jié)果顯示：IUA+hDMSCs組integrin αγβ3主要沉積于上皮細(xì)胞中，間質(zhì)中亦有少量分布；而IUA組中見少量棕黃色顆粒散布于上皮細(xì)胞中。IUA+hDMSCs組cytokeratin、vimentin和integrin αγβ3的表達(dá)量顯著高于IUA組(P<0.05)，但仍不及sham組，而IUA組TGF-β1表達(dá)量均高于IUA+hDMSCs組及IUA組(P<0.05)，見表3。

6宮腔粘連相關(guān)mRNA表達(dá)水平檢測(cè)

qPCR結(jié)果顯示，與IUA組相比，除TNF-α、CTGF下調(diào)外，IUA+hDMSCs組的SCF、VEGF、bFGF和TSP-1均明顯上調(diào)(P<0.05)，見圖5。

#P<0.05vsIUA；*P<0.05vssham.

Figure 5.Relative mRNA expression. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsIUA.

圖5宮腔粘連mRNA表達(dá)水平檢測(cè)

7生育力實(shí)驗(yàn)評(píng)估

處死孕16.5 d的大鼠，開腹分離子宮，觀察各組孕鼠的數(shù)量和每側(cè)子宮胎鼠個(gè)數(shù)。IUA+hDMSCs組和IUA組的左側(cè)宮腔均有胎鼠，且胎鼠數(shù)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。IUA+hDMSCs組右側(cè)宮腔均妊娠(n=5)，IUA組右側(cè)宮腔妊娠孕鼠數(shù)為4只，平均胎鼠數(shù)量分別為(6±1)只和(1±1)只，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

討論

子宮內(nèi)膜是高度再生的組織，其再生基礎(chǔ)是基底層完整。創(chuàng)傷、感染等因素?fù)p傷子宮內(nèi)膜基底層，使基底層部分或完全缺失，喪失周期性功能修復(fù)，進(jìn)而啟動(dòng)纖維性修復(fù)導(dǎo)致IUA[1]。目前宮腔鏡下粘連分離術(shù)是診療IUA的金標(biāo)準(zhǔn)，但此法不適用于致密的中、重度IUA，且術(shù)后粘連復(fù)發(fā)率高，尤其對(duì)于重度粘連的復(fù)發(fā)率可達(dá)60%[1]。而宮腔支撐物、防粘連生物材料、應(yīng)用雌激素等方法雖然能在一定程度上預(yù)防粘連的復(fù)發(fā)，但無(wú)法促進(jìn)受損的基底層再生[4]。隨著干細(xì)胞治療相關(guān)基礎(chǔ)理論與臨床應(yīng)用研究的進(jìn)展，干細(xì)胞應(yīng)用對(duì)于此類難治性宮腔粘連具有不可估量的治療前景[5]。再生醫(yī)學(xué)修復(fù)子宮內(nèi)膜的候選細(xì)胞有骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞以及口腔上皮細(xì)胞等[6]。目前已有將自體干細(xì)胞移植至重度宮腔粘連患者體內(nèi)，作為替代療法后行IVF-ET使患者成功受孕的報(bào)道[7]，提示自體干細(xì)胞可用于治療IUA 等子宮內(nèi)膜修復(fù)障礙性疾病。

本研究采用的蛻膜間充質(zhì)干細(xì)胞在胎盤胎膜發(fā)育過程中可分泌多種蛋白，并隨著孕周增大與絨毛膜細(xì)胞共同發(fā)育為胎盤，具有強(qiáng)大的增殖能力[8]。本研究采用膠原酶和機(jī)械研磨法分離出hDMSCs，流式細(xì)胞檢測(cè)可表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志物CD29、CD44、CD73和CD105，不表達(dá)造血干細(xì)胞表面標(biāo)志物CD34和CD45。W5C5是子宮內(nèi)膜間充質(zhì)干細(xì)胞特異性的表面抗原，該抗原陽(yáng)性的細(xì)胞相比陰性細(xì)胞集落形成能力強(qiáng)，能在體內(nèi)分化成子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞[9]。本研究分離的hDMSCs表面抗原W5C5陽(yáng)性細(xì)胞約為25.23%，提示該類hDMSCs來(lái)源于子宮內(nèi)膜，亦可能具有以上能力，可進(jìn)一步使用磁珠分選法進(jìn)行驗(yàn)證。細(xì)胞免疫組化結(jié)果顯示其表達(dá)波形蛋白，而不表達(dá)角蛋白，進(jìn)一步提示其來(lái)源于子宮內(nèi)膜。

本研究模擬子宮內(nèi)膜消融術(shù)，采用熱水灌注在高溫的作用下持續(xù)損傷子宮內(nèi)膜，使組織細(xì)胞蛋白凝固壞死，大量上皮細(xì)胞脫落于宮腔，以致間質(zhì)甚至肌層組織裸露，進(jìn)而產(chǎn)生一系列炎癥反應(yīng)。在內(nèi)膜修復(fù)過程中間質(zhì)結(jié)締組織異常增生、纖維化，纖維化的間質(zhì)組織由于缺乏腔上皮的保護(hù)作用而相互粘連[10]，從而模擬宮腔粘連。在此條件下，將hDMSCs移植入宮腔粘連模型大鼠體內(nèi)，3個(gè)動(dòng)情周后觀察到IUA+hDMSCs組大鼠子宮與周圍組織粘連減輕，形態(tài)恢復(fù)。HE染色見子宮內(nèi)膜間質(zhì)厚度增加，上皮組織覆蓋，較IUA組大鼠子宮內(nèi)膜明顯增厚，且小血管數(shù)量和腺體數(shù)量明顯增加。同時(shí)hDMSCs通過分泌VEGF促進(jìn)子宮內(nèi)膜小血管再生，IGF-1促進(jìn)上皮細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞再生,逆轉(zhuǎn)IUA無(wú)血管化，促進(jìn)腺體再生。免疫組化結(jié)果顯示IUA+hDMSCs組vimentin和cytokeratin兩種子宮內(nèi)膜標(biāo)志蛋白表達(dá)量均比IUA組高，SCF上調(diào)亦證實(shí)了hDMSCs促進(jìn)子宮內(nèi)膜細(xì)胞增生，修復(fù)損傷的子宮內(nèi)膜組織。

TGF-β與多種器官組織的纖維化密切相關(guān)，在IUA的發(fā)生發(fā)展過程中起著重要作用。研究表明IUA患者的子宮內(nèi)膜組織中TGF-β表達(dá)升高，其表達(dá)水平與IUA嚴(yán)重程度呈正相關(guān)性[11]。其中TGF-β1是TGF-β家族中比例最大、活性最強(qiáng)的一個(gè)亞型，其持續(xù)高濃度狀態(tài)是子宮內(nèi)膜損傷修復(fù)過程中纖維化的主要原因[12]。本研究中免疫組化結(jié)果顯示IUA+hDMSCs組TGF-β1表達(dá)比IUA組低，提示hDMSCs可能通過下調(diào)TGF-β1起抗纖維化作用。研究表明TSP-1有活化TGF-β1、抑制血管新生的作用[13]，但本研究中TSP-1上調(diào)，可能作為一種調(diào)控免疫反應(yīng)的補(bǔ)償機(jī)制，使組織免受過度損傷[14]。

治療IUA的目的不僅是促進(jìn)受損的子宮內(nèi)膜修復(fù)，恢復(fù)正常月經(jīng)周期，逆轉(zhuǎn)纖維化，其最重要的目的是改善患者的生育能力。子宮內(nèi)膜容受性是子宮內(nèi)膜允許胚胎著床的重要指標(biāo)，integrin αγβ3是子宮內(nèi)膜容受性的標(biāo)志物之一，在維持胚胎著床和發(fā)育中起重要作用。IUA患者integrin αγβ3表達(dá)異常，子宮內(nèi)膜容受性降低，影響囊胚著床，進(jìn)而導(dǎo)致不孕或流產(chǎn)[15]。本研究中IUA+hDMSCs組integrin αγβ3表達(dá)高于IUA組，生育力評(píng)估中也驗(yàn)證hDMSCs治療能提高子宮內(nèi)膜容受性，穩(wěn)定囊胚定位、黏附、著床。綜上所述，hDMSCs通過分泌相關(guān)因子減輕子宮內(nèi)膜纖維化程度，同時(shí)補(bǔ)充枯竭的基底層細(xì)胞，增加integrin αγβ3提高子宮內(nèi)膜容受性，從形態(tài)上、功能上參與受損子宮內(nèi)膜的修復(fù)。

熱水灌注法建立的宮腔粘連模型并不能確切模擬臨床所致的IUA是本研究的不足之處。考慮目前現(xiàn)有研究建立的幾乎均為非妊娠期子宮損傷模型[16]，本課題組將進(jìn)一步改善IUA模型，建立貼近臨床實(shí)際的妊娠子宮損傷模型，從不同移植途徑、體內(nèi)示蹤和分化潛能探索hDMSCs修復(fù)子宮內(nèi)膜的具體作用機(jī)制。

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(責(zé)任編輯： 林白霜， 羅森)

Therapeutic effect of first-trimester human decidual mesenchymal stem cell transplantation on intrauterine adhesions in rats

LIN Xin-zi, HUANG Chen-ling-zi, LUO Xin, SHUAI Han-lin

(DepartmentofObstetricsandGynecology,TheFirstAffiliatedHospitalofJinanUniversity,Guangzhou510632,China.E-mail:tluox@126.com;piaoshuai2003@163.com)

[KEY WORDS]First-trimester human decidual mesenchymal stem cells; Intrauterine adhesions; Rats

[ABSTRACT]AIM: To investigate the feasibility and therapeutic effect of transplantation with first-trimester human decidual mesenchymal stem cells (hDMSCs) on intrauterine adhesions (IUA) in rats. METHODS: The hDMSCs were isolated, cultured, purified and identifiedinvitro. Female SD rats were randomly divided into IUA+hDMSCs group, IUA group and sham group. The rats in IUA group were injected with 1 mL PBS via the tail vein, while the rats in IUA+hDMSCs group were injected with 2×106hDMSCs with 3 consecutive injections at every 3-day intervals. The rats in sham group only received laparotomy. The general, histological, and immunohistochemical observations were performed 3 estrous cycles postoperatively. The expression of IUA-related genes was analyzed by quantitative PCR. Immunofluorescence and pregnancy test were also performed. RESULTS: The modeled uteri were of partial atresia and fibrosis, the endometrium was atrophic and the numbers of gland decreased. The endometrium was significantly thicker, the numbers of gland and small vessels increased, and the fibrosis decreased in IUA+hDMSCs group compared with IUA group (P<0.05). The expression of cytokeratin, vimentin and integrin αγβ3 was significantly stronger in IUA+hDMSCs group than that in IUA group, whereas the expression of TGF-β1 was weaker than that in IUA group (P<0.05). The average number of litters in right horns of IUA+hDMSCs group was more than that in IUA group (P<0.05). Except for down-regulation of TNF-α and CTGF, compared with IUA group, the mRNA expression levels of SCF, VEGF, bFGF, IGF-1 and TSP-1 were increased in IUA+hDMSCs group. Dio-labeled hDMSCs mainly located in endometrial epithelium.CONCLUSION: The first-trimester human decidual mesenchymal stem cells survive and proliferate in the rat endometrium and regenerate the endometrium. hDMSC transplantation is a potential novel treatment for IUA and may also be useful to prevent IUA after uterine injury.

[文章編號(hào)]1000- 4718(2016)06- 1099- 07

[收稿日期]2015- 11- 17[修回日期] 2016- 04- 25

*[基金項(xiàng)目]浙江省科技廳科技計(jì)劃重大科技專項(xiàng)重大社會(huì)發(fā)展項(xiàng)目(No. 2012C13015-2)

通訊作者△羅新 Tel: 020-38688857； E-mail： tluox@126.com； 帥翰林 Tel： 020-38688769； E-mail： piaoshuai2003@163.com

[中圖分類號(hào)]R363； R711.74

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.06.023