IκB-α、MMP-9在食管癌中的表達及其生物學意義

劉　亮，王　莉，倪曉辰，武中林，王光大，趙　陽，左　靜，王　靜，左連富

[作者單位]　050011 石家莊，河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院腫瘤研究所流式細胞室

?

IκB-α、MMP-9在食管癌中的表達及其生物學意義

劉亮，王莉，倪曉辰，武中林，王光大，趙陽，左靜，王靜，左連富

[作者單位]050011 石家莊，河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院腫瘤研究所流式細胞室

[摘要]目的檢測核因子κB(NF-κB)的抑制蛋白α(inhibitor of NF-κB α, IκB-α)及基質金屬蛋白酶9(matrix metalloprotein-9,MMP-9)在不同食管病變組織中的表達，探討IκB-α、MMP-9與食管癌發(fā)生、發(fā)展及轉移的關系。方法通過免疫組織化學檢測食管鱗癌、食管不典型增生組織及食管正常黏膜組織中IκB-α、MMP-9蛋白的表達；分析食管鱗癌組織中IκB-α、MMP-9蛋白表達與不同臨床病理特征的關系，并對食管鱗癌組織中IκB-α與MMP-9蛋白表達相關性進行分析。結果食管鱗癌組織中IκB-α蛋白的表達(80.0%)明顯高于食管不典型增生組織(52.3%)及食管正常組織(8.3%)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，且與淋巴結轉移及浸潤深度有關。MMP-9蛋白在食管鱗癌組織中的表達(73.3%)明顯高于食管不典型增生組織(71.4%)及食管正常組織(16.7%)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，且與細胞分化程度、淋巴結轉移及浸潤深度有關。食管癌組織中IκB-α與MMP-9蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。結論IκB-α、MMP-9蛋白在食管癌組織中異常表達，參與了食管癌浸潤、轉移的發(fā)生。

[關鍵詞]食管鱗狀細胞癌；免疫組織化學；基質金屬蛋白酶；浸潤，轉移

食管癌是較常見的惡性腫瘤，發(fā)病率及病死率高[1]，全世界每年約有30萬人死于食管癌，我國是世界上食管癌高發(fā)地區(qū)，每年平均病死約15萬人，食管癌已嚴重危害了人們的生命健康，多數(shù)患者就診時已是中晚期，有了遠處轉移，失去手術治療機會，影響生存期及生活質量。浸潤轉移是食管癌臨床治療中的一大難題，也是影響食管癌臨床治療效果的主要因素。因此，探尋食管癌的發(fā)生、發(fā)展和浸潤轉移的分子機制顯得格外重要。文獻報道，細胞外基質降解和再塑形對惡性腫瘤遠處轉移起著非常重要的作用。核因子κB是重要的核轉錄因子，在信號轉導途徑中起著樞紐的作用，調節(jié)機體免疫、腫瘤的發(fā)生發(fā)展[2-4]及細胞的凋亡過程。其抑制蛋白α(inhibitor of NF-κB α, IκB-α)可以抑制NF-κB作用，NF-κB基質金屬蛋白酶9(matrix metalloprotein-9,MMP-9)屬于MMP家族，主要功能是降解和重塑細胞外基質的動態(tài)平衡[5]。本課題利用免疫組織化學的方法研究食管鱗癌組織中IκB-α及MMP-9蛋白表達，探討其與食管癌發(fā)生發(fā)展及浸潤、轉移的關系。

1資料與方法

1.1一般資料45例經(jīng)病理檢查證實為食管癌臨床標本均取自河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院病理科，所取標本來源的食管癌患者術前均未接受過放療、化療及免疫治療，其中男30例，女15例，年齡35~78歲，中位年齡56.5歲。取距腫瘤邊緣2 cm的癌旁不典型增生組織21例，距腫瘤邊緣5 cm的正常食管黏膜組織24例作對照。以4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，用于免疫組織化學檢測。

1.2主要試劑兔抗人IκB-α抗體(C-21)及鼠抗人MMP-9抗體(2C3)(購自美國Santa Cruze公司)；即用型SP-9000試劑盒及DAB顯色試劑盒(購自北京中杉生物技術有限公司)。

1.3免疫組織化學方法檢測IκB-α及MMP-9蛋白表達4%多聚甲醛固定的組織標本經(jīng)石蠟包埋后，4 μm切片2張，分別進行IκB-α及MMP-9蛋白的免疫組織化學染色。常規(guī)鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結法(streptavidin-perosidase， SP)方法進行免疫組織化學染色，依據(jù)參考文獻[6-7]報告的方法，免疫組織化學結果以細胞漿和/或細胞核中呈現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性細胞(IκB-α蛋白)，或以細胞漿呈現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性細胞(MMP-9蛋白)。對每張切片隨機選取5個高倍視野，每個視野計數(shù)200個細胞，共計1000個，計數(shù)陽性細胞并計算其所占比例：陽性細胞<5%，判定為陰性表達，陽性細胞≥5%，判定為陽性表達。

1.4統(tǒng)計學方法應用SPSS11.5統(tǒng)計學軟件完成實驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計，計數(shù)資料以率(%)表示，采用χ2檢驗，以α=0.05為檢驗水準。

2結果

2.1不同食管病變組織中IκB-α及MMP-9蛋白表達IκB-α蛋白在食管鱗癌組織中陽性表達率(80.0%，36/45)顯著高于不典型增生及正常組織中的表達(52.3%，11/21及8.3%，2/24)(P<0.01)，見圖1A。MMP-9在食管鱗癌、不典型增生及正常組織中陽性表達率分別為73.3%(33/45)、71.4%(15/21)及16.7%(4/24)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖1B。

圖1　食管鱗癌組織中IκB-α及MMP-9蛋白表達(SP ×200)A為核因子κB抑制蛋白α；B為基質金屬蛋白酶-9

2.2食管鱗癌組織中IκB-α及MMP-9蛋白表達與不同臨床病理特征的關系如表1所示，IκB-α蛋白在食管鱗癌組織中陽性表達，有淋巴結轉移者表達率為(92.0%，23/25)顯著高于無淋巴結轉移者(65.0%，13/20)(P<0.05)，浸潤纖維膜者(89.7%，26/29)顯著高于無纖維膜浸潤者(62.5%，10/16)(P<0.05)，而與年齡、性別及細胞分化程度無關(P>0.05)。MMP-9蛋白在食管鱗癌細胞高中低分化組織中陽性表達率分別為50.0%(9/18)、85.7%(12/14)及(92.3%12/13)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；有淋巴結轉移的組織中表達為88.0%(22/25)顯著高于無淋巴結轉移者55.0%(11/20)(P<0.05)；浸潤纖維膜者表達率為86.2%(25/29)顯著高于無纖維膜浸潤者50.0%(8/16)(P<0.05)；MMP-9與患者年齡及性別無關(P>0.05)。

2.3食管鱗癌組織中IκB-α及MMP-9蛋白表達相關性分析食管鱗癌組織中IκB-α蛋白表達與MMP-9蛋白差異無統(tǒng)計學意義，spearman相關系數(shù)γ=0.201，P=0.185。

表1　45例食管癌組織中IκB-α與MMP-9蛋白表達與不同臨床病理特征的關系

3討論

食管癌是我國較常見的惡性腫瘤，河北磁縣及河南林州是食管癌高發(fā)區(qū)，發(fā)病率及病死率均較高，嚴重威脅了人們的生命健康[8-10]。多數(shù)患者就診時已是中晚期，治療效果不佳，探尋食管癌發(fā)生、發(fā)展及轉移機制，有利于臨床上提高食管癌的治療效果及生存期。核轉錄因子NF-κB廣泛存在于真核生物中，是一個由復雜的多肽亞單位組成的蛋白家族，在信號轉導途徑中起著樞紐的作用，調節(jié)機體免疫、腫瘤的發(fā)生發(fā)展及細胞的凋亡過程[11-15]。與NF-κB密切相關的是在細胞漿中存在另一蛋白質家族-IκB，它的主要作用是與NF-κB/Rel蛋白在胞漿中結合并使后者保持靜息狀態(tài)。IκB家族包括IκBα、IκBβ、Bcl-3、IκBγ、P105、P100等，其中IκBα通過其錨蛋白與位于NF-κB的RHD區(qū)域末端的核定位信號(NLS)結合，并遮蔽NLS使NF-κB滯留在胞漿中呈非活性狀態(tài)。IκBα可調控NF-κB生理功能，有研究顯示，IκBα參與多種腫瘤發(fā)展及轉移[16-19]。高黎等[20]研究顯示，IκBα蛋白在口腔鱗癌組織中的陽性表達率顯著高于正?？谇火つそM織中的陽性表達率。尉坤等[21]研究顯示，大腸癌組織中IκBα蛋白表達水平明顯低于正常組織，且與大腸癌侵襲和轉移有關。郭紅娟等[22]研究發(fā)現(xiàn)，IκBα基因及蛋白在非小細胞肺癌中的表達顯著低于癌旁肺組織。在本實驗中，利用免疫組化的方法檢測了不同食管病變組織中的IκBα蛋白的表達水平，食管癌組織中的表達水平顯著高于不典型增生及正常組織，且在食管癌的淋巴結轉移及浸潤深度密切相關，提示IκBα參與了食管癌的淋巴結轉移過程。本實驗研究的IκBα在癌組織中的表達趨勢與高黎及郭紅娟等研究結果不一致，可能是IκBα在不同癌組織中參與浸潤及轉移的機制不同，因此需要進一步研究IκBα參與癌組織浸潤及轉移機制。

惡性腫瘤細胞從原發(fā)部位經(jīng)淋巴道、血管等途徑到達其他部位繼續(xù)生長形成的腫瘤轉移，嚴重影響了患者的治療效果及生存期，但目前腫瘤浸潤轉移機制仍未闡明，研究顯示，浸潤和轉移主要依賴于細胞外基質的降解，基質金屬蛋白酶(matrix metall oproteinases，MMPs)能夠水解基底膜和細胞外基質, 從而促進腫瘤細胞的浸潤轉移。其中MMP-9可水解基底膜和細胞外基質中的Ⅳ型膠原等多種成分，在腫瘤細胞的浸潤及轉移中起著重要作用[23-25]。有研究顯示，在乳腺癌中 MMP-2、MMP-9表達與癌組織浸潤轉移及預后有關[26]。本課題利用免疫組化檢測不同食管病變組織中MMP-9蛋白表達水平，并分析其與食管癌不同臨床病理特征關系，發(fā)現(xiàn)MMP-9蛋白在食管癌組織表達水平顯著高于食管正常組織的表達，且與食管癌細胞分化程度、淋巴結轉移及浸潤深度有關。提示MMP-9蛋白參與了食管癌浸潤轉移過程。統(tǒng)計分析食管癌組織中IκBα與MMP-9蛋白表達無顯著相關性。

IκBα與MMP-9蛋白在食管組織中的異常表達，參與了食管癌的發(fā)生、發(fā)展、浸潤及轉移過程，但兩者表達水平無顯著相關性，可能是通過不同機制參與了食管癌的浸潤轉移過程。

[參考文獻]

[1]Gamliel Z. Incidence epidemiology and etiology of esophageal cancer[J].Chest Surg Clin N Am, 2000,10(3):441-450.

[2]Yang F, Li J, Zhu J,etal. Hydroxysafflor yellow A inhibits angiogenesis of hepatocellular carcinoma via blocking ERK/MAPK and NF-κB signaling pathway in H22 tumor-bearing mice[J].Eur J Pharmacol， 2015,75(4):105-114.

[3]劉林,劉修恒,王磊.氟伐他汀對大鼠腎臟缺血再灌注損傷 NF-κB 表達的影響[J].臨床誤診誤治,2013,26(9):86-88.

[4]楊改生,張國榮,張晉東,等.心肌缺血再灌注損傷中核因子 κB活性的變化[J].空軍總醫(yī)院學報,2006,22(2):80-82.

[5]Uloza V, Liutkevicius V, Pangonyte D,etal. Characteristics of expression of matrix metalloproteinases (MMP-2 and MMP-9) in glottic squamous cell carcinoma and benign vocal fold lesions[J].Clin Exp Otorhinolaryngol， 2015,8(1):57-64.

[6]姜倩.人口腔白斑及鱗狀細胞癌中NF-κB/p65,cyclin D1及CD105表達的研究[J].鄭州大學學報，2009,24(2):78-81.

[7]鐘崇,郭榮平,石明,等.VEGF與MMP-9在肝癌組織中的表達及其臨床意義[J].癌癥，2006,25(5):599-603.

[8]宿涌濤,夏麗傳,尹素鳳.淄博市 2010-2012年居民惡性腫瘤死因分析[J].中國醫(yī)藥導報, 2014 , 11 ( 8 ):108-111.

[9]赫捷,邵康.中國食管癌流行病學現(xiàn)狀、診療現(xiàn)狀及未來對策[J].中國癌癥雜志，2011,21(7):501-504.

[10]孫健.食管癌微創(chuàng)治療進展[J].中國煤炭工業(yè)醫(yī)學雜志,2014,17(1):166-170.

[11]方興保 殷正豐,楊之斌.NF-κB與結直腸癌[J].中國腫瘤生物治療雜志，2013,20(3):356-359.

[12]Tsubaki M, Takeda T, Kino T,etal. Mangiferin suppresses CIA by suppressing the expression of TNF-α, IL-6, IL-1β, and RANKL through inhibiting the activation of NF-κB and ERK1/2[J].Am J Transl Res, 2015,7(8):1371-1381.

[13]Sui X, Zhu J, Tang H,etal. p53 controls colorectal cancer cell invasion by inhibiting the NF-κB-mediated activation of Fascin[J].Oncotarget, 2015,6(26):22869-22879.

[14]賈麗超,周明學,張 蕾,等.當歸芍藥散對代謝性炎性反應小鼠血脂和血清炎性反應因子IL-6、MCP-1 及 NF-κB、PPARγmRNA 表達的影響[J].首都醫(yī)科大學學報，2014,35(6):25-29.

[15]Cho S C, Choi B Y. Acetylshikonin Inhibits Human Pancreatic PANC-1 Cancer Cell Proliferation by Suppressing the NF-κB Activity[J].Biomol Ther (Seoul), 2015,23(5):428-433.

[16]張建,徐永健,熊維寧,等.轉染IκBα基因抑制NF-κB活性對A549細胞侵襲行為的影響[J].癌癥，2008,27(7):710-715.

[17]周文鵬.NF-κB對大腸癌轉移相關基因的調節(jié)及意義[D].浙江大學，2005.

[18]Wang F, Ma J, Wang K S,etal. Blockade of TNF-α-induced NF-κB signaling pathway and anti-cancer therapeutic response of dihydrotanshinone I[J].Int Immunopharmacol, 2015,28(1):764-772.

[19]Müller-Edenborn K, Léger K, Glaus Garzon J F,etal. Hypoxia attenuates the proinflammatory response in colon cancer cells by regulating IκB[J].Oncotarget, 2015,6(24):20288-20301.

[20]高黎,張彥喜,石愛梅.核因子-κBp65與IκBα在口腔白斑及鱗癌中的表達[J].實用口腔醫(yī)學雜志,2009,25(1):58-61.

[21]尉坤,孫偉,李秉慧,等.NF-κB及其抑制蛋白I-κBα與大腸癌侵襲和轉移的相關性[J].中國老年學雜志,2009,29(15):1870-1872.

[22]郭紅娟,朱光發(fā),吳春婷,等.NF-κBp65/IκBα在非小細胞肺癌組織中的表達[J].臨床肺科雜志,2014,19(2):267-271.

[23]江忠清,朱鳳川,曲軍英,等.宮頸癌MMP-9表達與腫瘤血管生成、癌細胞增殖及侵襲轉移的關系[J].癌癥,2003,22(2):178-184.

[24]周少飛,毛偉征,苗蕾,等.基質金屬蛋白酶-9及其抑制劑與甲狀腺乳頭狀癌的關系[J].疑難病雜志,2014,11(9):676-678.

[25]高艷章,談宗明.胃癌患者促血管生成相關因子與 MMPs對病情進展的判斷意義[J].解放軍預防醫(yī)學雜志,2015,33(2):185-186.

[26]袁蓮香,何偉民,張斌,等.乳腺癌組織MMP-2、MMP-9和TIMP-2蛋白表達與腫瘤的轉移及預后[J].腫瘤,2002,22(4):294-296.

(收稿時間：2015-09-21修回時間：2015-10-22)

·論著·

Expressions of IκB-α and MMP-9 in Esophageal Cancer and Its Biological Significance

LIU Liang, WANG Li, NI Xiao-chen, WU Zhong-lin, WANG Guang-da, ZHAO Yang, ZUO Jing, WANG Jing, ZUO Lian-fu (Department of FCM Analysis, Tumor Institute, the Fourth Hospital of Hebei Medical University, Shijiazhuang 050011, China)

[Abstract]ObjectiveTo detect the expressions of inhibitor of NF-κB α (IκB-α) and matrix metalloprotein-9 (MMP-9) protein of nuclear factor kappa B (NF-κB) in different esophageal lesion tissues and to explore the relationship between IκB-α and MMP-9 expressions and pathogenesy, development and metastasis of esophageal cancer. MethodsThe IκB-α and MMP-9 protein expressions in esophagus squamous cell carcinoma, esophageal atypical hyperplasia and normal esophageal tunica mucosa tissues were detected using immunohistochemistry method; the relationship between the IκB-α and MMP-9 protein expressions in tissues of esophagus squamous cell carcinoma and different clinicopathological features were analyzed as well as the relationship between IκB-α and MMP-9 expressions in tissues of esophagus squamous cell carcinoma. ResultsThe IκB-α protein expression in tissues of esophagus squamous cell carcinoma (80.0%) was significantly higher than 52.3% in tissues of esophageal atypical hyperplasia and 8.3% in normal esophageal tissues, and the differences were statistically significant (P<0.05), and the differences were related to lymph node metastasis and invasion depth. The MMP-9 protein expression in tissues of esophagus squamous cell carcinoma (73.3%) was significantly higher than 71.4% in tissues of esophageal atypical hyperplasia and 16.7% in normal esophageal tissues, and the differences were statistically significant (P<0.05), and the differences were related to cell differentiation degree, lymph node metastasis and invasion depth. IκB-α and MMP-9 protein expressions in esophageal cancer tissues did not have significant correlation (P>0.05). ConclusionThe abnormal expressions of IκB-α and MMP-9 protein in esophageal cancer is involved in the invasion and metastasis of esophageal cancer.

[Key words]Esophagus squamous cell carcinoma; immunohistochemistry; Matrix metalloproteinases; Invasion, metastasis

[DOI]10.3969/j.issn.2095-140X.2015.12.007

[文獻標志碼][中國圖書資料分類號]R735.1A

[文章編號]2095-140X(2015)12-0032-04

[通訊作者]左連富，E-mail:zuolianfu4909@sina.com