梁春瀅 李小江 廣東省食品藥品監(jiān)督管理局審評(píng)認(rèn)證中心 （廣東 廣州 510080）

抗凝劑對(duì)體外診斷試劑檢測(cè)結(jié)果的影響及其干擾研究方法

梁春瀅 李小江 廣東省食品藥品監(jiān)督管理局審評(píng)認(rèn)證中心 （廣東 廣州 510080）

當(dāng)體外診斷試劑預(yù)期用途明確，確定檢測(cè)的臨床樣本類型為血漿或全血時(shí)，申請(qǐng)人在產(chǎn)品說明書中應(yīng)同時(shí)明確樣本添加的抗凝劑類型，并提供抗凝劑對(duì)檢測(cè)結(jié)果是否產(chǎn)生干擾的研究性資料。該文主要基于臨床樣本常用抗凝劑的作用機(jī)制，和對(duì)體外診斷試劑使用過程的影響因素等，并結(jié)合《體外診斷試劑注冊(cè)管理辦法》等相關(guān)法規(guī)的要求[1]，來探討抗凝劑在外診斷試劑的研發(fā)階段及臨床試驗(yàn)過程中的干擾研究方法。

抗凝劑影響因素 體外診斷試劑注冊(cè)審評(píng) 干擾研究方法

抗凝劑常用于臨床檢驗(yàn)中對(duì)人全血樣本或血漿樣本的處理。不同種類抗凝劑的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)差異較大，且作用機(jī)制不同，其選擇則需根據(jù)臨床檢驗(yàn)中的具體項(xiàng)目和相應(yīng)使用的檢測(cè)試劑來定。不同的抗凝劑會(huì)影響血液不同的成分，或干擾檢測(cè)試劑的主要成分，從而影響最終的檢測(cè)結(jié)果。因此，一方面為提高體外診斷試劑在臨床檢測(cè)項(xiàng)目中結(jié)果的可靠性，另一方面在體外診斷試劑注冊(cè)審評(píng)過程抗凝劑的干擾研究作為較為關(guān)鍵的環(huán)節(jié)，體外診斷試劑申請(qǐng)人應(yīng)結(jié)合整個(gè)檢測(cè)系統(tǒng)來嚴(yán)格評(píng)估抗凝劑的適用性。應(yīng)當(dāng)在體外診斷試劑研發(fā)及臨床試驗(yàn)過程，根據(jù)產(chǎn)品的實(shí)際使用情況對(duì)抗凝劑進(jìn)行干擾研究，并將干擾研究結(jié)果作為一項(xiàng)注冊(cè)申報(bào)資料提交。下面將結(jié)合抗凝劑作用機(jī)制、對(duì)體外診斷試劑檢測(cè)結(jié)果造成影響的因素等，提出注冊(cè)審評(píng)過程對(duì)抗凝劑的關(guān)注點(diǎn)和干擾研究方法，供體外診斷試劑申請(qǐng)人參考。

1.常用抗凝劑的作用機(jī)制

臨床檢測(cè)項(xiàng)目中常用抗凝劑的作用機(jī)制主要分為兩種：一是抗凝劑中相應(yīng)結(jié)構(gòu)會(huì)與抗凝血酶因子結(jié)合，提高抗凝血酶因子的活性，加速對(duì)凝血酶因子的滅活，從而抑制凝血酶原激酶的形成等達(dá)到抗凝的目的，如肝素等；二是與血液中的鈣離子結(jié)合，形成螯合物或沉淀物，導(dǎo)致凝血過程無鈣離子參與，從而阻斷血液凝固的過程，如EDTA、枸櫞酸鹽、草酸鹽等[2]。

2.抗凝劑影響檢測(cè)結(jié)果的途徑

基于常用抗凝劑的作用機(jī)制、抗凝劑的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)及體外診斷試劑的組成成分等因素，簡單總結(jié)臨床檢測(cè)項(xiàng)目中常用的抗凝劑影響體外診斷試劑使用過程的檢測(cè)結(jié)果的主要途徑。

2.1 通過影響體外診斷試劑的成分

化學(xué)發(fā)光、時(shí)間分辨熒光免疫等方法學(xué)的體外診斷試劑，通常其組成成分中含有標(biāo)記物，而抗凝劑會(huì)與標(biāo)記物相結(jié)合，影響該試劑成分的穩(wěn)定性，從而影響整個(gè)檢測(cè)系統(tǒng)的反應(yīng)體系。如EDTA抗凝劑會(huì)與試劑組分中的銪標(biāo)記物發(fā)生螯合反應(yīng)，影響帶標(biāo)記物的抗原/抗體與被測(cè)物結(jié)合，從而影響檢測(cè)結(jié)果。

2.2 通過影響血液樣本中的成分

EDTA抗凝劑作為一種螯合劑，能絡(luò)合血液成分中的陽離子，干擾血液樣本中陽離子的濃度從而影響檢測(cè)結(jié)果，故電解質(zhì)分析用的體外診斷試劑應(yīng)排除使用添加EDTA抗凝劑的樣本。EDTA也會(huì)作用于冷抗血小板自身抗體，使得血小板發(fā)生聚集作用，造成血小板假性減少[3]。另外，草酸銨、肝素銨等銨鹽類抗凝劑會(huì)增加血液樣本中氮的成分，因此尿素、血氨等測(cè)定試劑是不宜用于添加銨鹽類抗凝劑樣本的檢測(cè)。

2.3 通過影響血液樣本中酶的活性

基于肝素抗凝的作用機(jī)制，其具有影響凝血酶活性的作用，因此不能用于血凝試驗(yàn)項(xiàng)目中。另外DETA、草酸能絡(luò)合鎂離子，形成螯合物，會(huì)抑制丙酮酸氧化酶、堿性磷酸酶等的活性[2]，故而對(duì)被測(cè)物為丙酮酸氧化酶、堿性磷酸酶等的檢測(cè)結(jié)果產(chǎn)生負(fù)干擾。

2.4 通過影響檢測(cè)過程的反應(yīng)條件

基于PCR類技術(shù)的檢測(cè)試劑，檢測(cè)過程依賴于Taq聚合酶的活性進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)，而樣本中添加抗凝劑肝素，會(huì)直接抑制聚合酶的活性[4]，影響整個(gè)檢測(cè)系統(tǒng)中的反應(yīng)條件，從而影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確度。

綜上，原則上所選擇的抗凝劑帶有的離子不應(yīng)與檢測(cè)離子相同，檢測(cè)結(jié)果會(huì)直接受抗凝劑本身離子影響而造成結(jié)果的偏差。其次是避免抗凝劑直接與試劑組分中的物質(zhì)反應(yīng)，影響產(chǎn)品的反應(yīng)體系。另外，所選擇的抗凝劑也不應(yīng)影響被測(cè)物酶的活性，或者干擾血液成分的濃度、形態(tài)分布和產(chǎn)生聚集效應(yīng)等。

3.體外診斷試劑注冊(cè)審評(píng)過程對(duì)抗凝劑的干擾研究資料要求

根據(jù)二類體外診斷試劑注冊(cè)審評(píng)要求，體外診斷試劑申請(qǐng)人可通過兩種途徑進(jìn)行抗凝劑的干擾評(píng)估：一是在產(chǎn)品分析性能評(píng)估過程中參照相關(guān)干擾研究標(biāo)準(zhǔn)和指南文件，選擇人源性樣本進(jìn)行干擾試驗(yàn)研究。研究方案、研究數(shù)據(jù)及研究評(píng)估報(bào)告等將作為國家總局發(fā)布的《關(guān)于公布體外體外診斷注冊(cè)申報(bào)資料要求和批準(zhǔn)證明文件格式的公告》（2014年第44號(hào)）中第六項(xiàng)分析性能評(píng)估資料的要求來進(jìn)行提交；二是在臨床試驗(yàn)過程一并進(jìn)行研究，確定抗凝劑是否適用于相應(yīng)的樣本類型和申報(bào)產(chǎn)品的檢測(cè)系統(tǒng)中。

此外，抗凝劑干擾研究結(jié)果應(yīng)在產(chǎn)品說明書中明確，提醒用戶檢測(cè)的樣本應(yīng)添加何種抗凝劑或不宜添加何種抗凝劑。比如可在產(chǎn)品說明書中樣本的要求內(nèi)容中明確該產(chǎn)品僅適用于添加EDTA、肝素、枸櫞酸鈉的血漿樣本。

3.1 在分析性能評(píng)估中對(duì)抗凝劑的干擾研究及結(jié)果分析

抗凝劑作為一種外源性干擾物質(zhì)，注冊(cè)申請(qǐng)人在產(chǎn)品分析性能評(píng)估中樣本的處理可參考EP7-A2指南文件[5]，評(píng)估方法和結(jié)果分析可參考EP9-A2指南文件[6]，通過對(duì)比研究，從而得出添加抗凝劑的待評(píng)價(jià)系統(tǒng)與參考系統(tǒng)的檢測(cè)結(jié)果是否具有可比性。

3.1.1 研究方法

研究過程首先評(píng)估試劑的檢測(cè)樣本可用于何種樣本，若檢測(cè)項(xiàng)目可同時(shí)用于血清及血漿、全血樣本的，可通過申報(bào)試劑對(duì)至少40例同源的人血清樣本及加入要評(píng)估的抗凝劑血漿或全血樣本進(jìn)行對(duì)比研究，來驗(yàn)證兩樣本測(cè)定結(jié)果的一致性；若檢測(cè)項(xiàng)目只能用于全血單一樣本的（如糖化血紅蛋白），可參考EP9-A2指南文件，選用質(zhì)量較好的已上市試劑為參考系統(tǒng)，用申報(bào)試劑的檢測(cè)結(jié)果為待評(píng)價(jià)系統(tǒng)，分別對(duì)40例添加相同抗凝劑的樣本進(jìn)行檢測(cè)。通過方法比對(duì)，來證明兩者的差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。另外需要注意的是樣本選擇的濃度范圍盡可能涵蓋醫(yī)學(xué)決定水平，并均勻分布。而抗凝劑添加的干擾濃度應(yīng)依據(jù)臨床經(jīng)驗(yàn)的用量、參考相關(guān)臨床文獻(xiàn)和依據(jù)全國臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程提供的濃度等。

3.1.2 結(jié)果處理及數(shù)據(jù)分析

基于上述方法的檢測(cè)結(jié)果，首先需要對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)的剔除和納入統(tǒng)計(jì)原則可參考EP9-A2指南文件中的相關(guān)要求。結(jié)果的統(tǒng)計(jì)一般以申報(bào)產(chǎn)品對(duì)血清樣本的檢測(cè)結(jié)果(上市試劑對(duì)添加待評(píng)估抗凝劑的檢測(cè)結(jié)果）為x軸，添加抗凝劑血漿或全血樣本的檢測(cè)結(jié)果（申報(bào)試劑添加加待評(píng)估抗凝劑的檢測(cè)結(jié)果）為y軸，繪制散點(diǎn)圖并進(jìn)行直線回歸分析，得出擬合方程y=a+bx，計(jì)算a、b的95%置信區(qū)間（或99%置信區(qū)間），確定斜率b和截距a是否具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，同時(shí)對(duì)相關(guān)系數(shù)r進(jìn)行假設(shè)性檢驗(yàn)，確定概率P值，確定兩者直線相關(guān)是否成立。

除了上述結(jié)果的相關(guān)性分析外，還應(yīng)進(jìn)行定量的一致性分析。參考EP9-A2指南，首先找到相應(yīng)檢測(cè)項(xiàng)目的醫(yī)學(xué)決定水平，根據(jù)得出的回歸方程y=a+bx，計(jì)算在給定的醫(yī)學(xué)決定水平Xc處的預(yù)期偏倚（Bc）的估計(jì)值，即。另外根據(jù)公式求出預(yù)期偏倚的95%置信區(qū)間[6]。如果預(yù)期偏倚的可信區(qū)間包含了規(guī)定的可接受偏倚（通常以CLIA’88對(duì)室間評(píng)估的允許誤差的1/2為規(guī)定的可接受偏倚），或如果可接受偏倚大于預(yù)期偏倚可信區(qū)間的上限，則認(rèn)為兩者的測(cè)定結(jié)果具有可比性。

3.2 臨床試驗(yàn)過程對(duì)抗凝劑的干擾研究及結(jié)果分析

臨床試驗(yàn)過程對(duì)抗凝劑的干擾研究主要依據(jù)《體外診斷試劑注冊(cè)管理辦法》《體外診斷試劑臨床試驗(yàn)指導(dǎo)原則》等法規(guī)對(duì)二類體外診斷試劑臨床試驗(yàn)的要求。

3.2.1 研究方法

樣本添加抗凝劑后對(duì)檢測(cè)結(jié)果的干擾評(píng)估在臨床試驗(yàn)過程可以分為兩種情況：一是當(dāng)體外診斷試劑明確適用的樣本類型同時(shí)有血清、血漿/全血的情況時(shí)，應(yīng)當(dāng)在至少2家獲得國家食品藥品監(jiān)督管理總局認(rèn)可的臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)，對(duì)200例以上臨床樣本采用申報(bào)試劑與對(duì)比試劑進(jìn)行方法學(xué)比對(duì)及偏倚評(píng)估。在此基礎(chǔ)上，再用申報(bào)試劑對(duì)至少100例在同一受試者添加了待評(píng)估的抗凝劑血漿/全血中（若要評(píng)估多種抗凝劑，應(yīng)分別選用至少100例）進(jìn)行檢測(cè)，其結(jié)果直接與血清樣本結(jié)果進(jìn)行相關(guān)性及一致性分析。二是當(dāng)體外診斷試劑明確適用的樣本類型無血清樣本時(shí)，則需要通過至少2家臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)，采用申報(bào)試劑與對(duì)比試劑，分別對(duì)200例以上的添加抗凝劑后樣本血漿/全血樣本進(jìn)行檢測(cè)，同樣對(duì)雙份檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行對(duì)比分析。另外應(yīng)注意申報(bào)試劑的臨床樣本類型和抗凝劑的類型應(yīng)不超過對(duì)比試劑說明書中的樣本和添加的抗凝劑類型。

3.2.2 結(jié)果處理及數(shù)據(jù)分析

該部分的結(jié)果處理和數(shù)據(jù)分析方法直接參考3.1.2內(nèi)容。因臨床試驗(yàn)過程對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的統(tǒng)計(jì)分析方法較多，注冊(cè)申請(qǐng)人也可根據(jù)實(shí)際的檢測(cè)結(jié)果的數(shù)據(jù)分布規(guī)律選擇適用的統(tǒng)計(jì)方法，檢測(cè)結(jié)果應(yīng)進(jìn)行相關(guān)性及一致性分析。當(dāng)結(jié)果服從正態(tài)分布且方差齊性時(shí)，采用Pearson進(jìn)行線性相關(guān)分析，而一致性分析可采用t檢驗(yàn)、Bland-Altman分析等；當(dāng)結(jié)果為非正態(tài)分布時(shí)，相關(guān)性采用Spearman秩相關(guān)分析，一致性則可采用秩和檢驗(yàn)。另外，對(duì)分別單獨(dú)添加了不同抗凝劑（評(píng)估的抗凝劑種類較多時(shí)）的樣本進(jìn)行檢測(cè)，得到多組數(shù)據(jù)的結(jié)果時(shí)，建議采用多組數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，可采用SPSS、SAS等軟件進(jìn)行檢驗(yàn)，若總體組間存在差異可進(jìn)一步進(jìn)行兩兩比較，來判斷所有抗凝劑檢測(cè)結(jié)果組間差異是否具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

申請(qǐng)人可根據(jù)實(shí)際情況選擇上述合適評(píng)估抗凝劑對(duì)檢測(cè)結(jié)果影響的研究方法，也可用其他的方法進(jìn)行研究，但應(yīng)有科學(xué)可靠的來源依據(jù)，并建立該抗凝劑是否干擾檢測(cè)結(jié)果的評(píng)價(jià)及接受標(biāo)準(zhǔn)。最后，研究結(jié)果應(yīng)能證明添加了待評(píng)價(jià)抗凝劑的樣本不影響臨床結(jié)果的決定。

[1] 國家食品藥品監(jiān)督管理總局. 體外診斷試劑注冊(cè)管理辦法(國家食品藥品監(jiān)督管理總局令第5號(hào))[Z]. http://www.sda.gov.cn/WS01/CL0053 /103757.html, 2014.

[2] 尚紅, 王毓三, 申子瑜, 等. 全國臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程[M]. 第4版. 人民衛(wèi)生出版社, 2015.

[3] 全德勝, 楊靜, 沈國強(qiáng). 抗凝劑EDTA導(dǎo)致血小板假性減少現(xiàn)象的分析[J]. 實(shí)驗(yàn)與檢驗(yàn)醫(yī)學(xué), 2015,33(1):102-103.

[4] 李霞蓮, 苗晉華. 抗凝劑對(duì)實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果的影響[J]. 實(shí)用醫(yī)技雜志, 2015,22(6):620-621.

[5] Clinical and Laboratory Standards Institute. Interference Testing in Clinical Chemistry; Approved Guideline-Second Edition. [S]. EP7-A2,CLSI, 2005.

[6] The National Committee for Clinical Laboratory Standards. Method Comparison and Bias Estimation Using Patient Samples; Approved Guideline—Second Edition. [S]. EP9-A2,NCCLS, 2002.

Infuences of Anticoagulant on Detecting Results of IVD Use and Its Interference Studying Methods

LIANG Chun-ying LI Xiao-jiang Center for certifcation and evaluation, GDFDA (Guangdong Guangzhou 510080)

When the intended use of IVD clearly types that its testing clinical samples is plasma or whole blood, the applicant should clearly defnite the anticoagulant in the registered description and provide the interference studying results of anticoagulant. This paper mainly bases on the mechanism of clinical commonly used anticoagulants, the infuence factors of anticoagulant on detecting results of in vitro diagnostic reagents used, etc, combining with the regulations for the administration of IVD registration, and other regulations requirements, to explore the studying methods of anticoagulant interfering with IVD testing process during its studying and clinical trial period.

anticoagulant, technical review of in vitro diagnostic reagents registration, factors of infuence, interference studying methods

1006-6586(2016)11-0001-03

R197.39

A

梁春瀅，助理工程師，廣東省食品藥品監(jiān)督管理局審評(píng)認(rèn)證中心醫(yī)療器械審評(píng)員；李小江，工程師，中級(jí)職稱，醫(yī)療器械審評(píng)員