劉 靜

( 青島農業(yè)大學 中心實驗室，山東 青島 266109 )

雙殼貝類免疫系統(tǒng)屬于非特異性免疫，由細胞免疫和體液免疫兩部分組成，血細胞可通過吞噬、包裹、形成結節(jié)等作用清除外源入侵物和病原生物，同時血細胞通過分泌一些抗菌肽、溶酶體酶等體液因子進入血淋巴來完成體液免疫[1]，所以說雙殼貝類的血細胞既是細胞免疫的承擔者，也是體液免疫的提供者，在貝類免疫防御體系中占很重要的地位。體外研究血細胞的形態(tài)、功能是了解其免疫活性的重要途徑，但雙殼貝類血細胞離體后往往會出現(xiàn)凝集、甚至破裂，嚴重影響后續(xù)血細胞形態(tài)和功能的研究，因此適宜抗凝劑的篩選是研究雙殼貝類血細胞免疫學的必要保障。

菲律賓蛤仔(Ruditapesphilippinarum)廣泛分布于我國南北沿海，且是較為重要的灘涂貝類，目前關于菲律賓蛤仔血細胞的研究較少，已有文獻中各學者在獲取菲律賓蛤仔血細胞的描述中未提到使用抗凝劑[2-5]，但筆者在試驗中發(fā)現(xiàn)菲律賓蛤仔血細胞離體后凝集嚴重，而目前尚無關于菲律賓蛤仔血淋巴抗凝劑的報道。理想的抗凝劑不僅能使血細胞不產生凝集現(xiàn)象, 而且能較好地保持細胞的形態(tài)完整和良好的功能[6]，筆者選取了10種不同抗凝劑配方，以菲律賓蛤仔血細胞的細胞形態(tài)、凝集程度作為衡量抗凝劑抗凝效果的評價指標，初步找出抗凝效果好的抗凝劑，之后進一步研究這些抗凝效果好的抗凝劑對菲律賓蛤仔血細胞存活率、血細胞組成、細胞凋亡率以及超微結構的影響，進而篩選出適合菲律賓蛤仔血細胞的抗凝劑，為今后開展菲律賓蛤仔血細胞的相關研究提供基礎數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗動物

菲律賓蛤仔購自青島城陽水產品批發(fā)市場，殼長(3.52±1.97) cm，體質量(8.23±0.197) g。買回的試驗蛤仔暫養(yǎng)于塑料水箱中，水溫約16 ℃，每日早晚各換新鮮海水1次，暫養(yǎng)3 d后進行試驗。

1.1.2 血淋巴抗凝劑的種類

根據(jù)現(xiàn)有文獻，筆者選取了貝類常用的幾種抗凝劑來篩選適合菲律賓蛤仔血細胞的抗凝劑，配方見表1。

表1 10種不同抗凝劑的配方

注：以上緩沖液均使用超純水配置, 并用0.22 μm醋酸纖維素膜過濾除菌, 于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆? 所有溶液均新鮮配制, 且低溫保存.0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液: NaCl 28 g/L, KH2PO4 0.2 g/L，KCl 0.2 g/L，Na2HPO4·12H2O 2.9 g/L，pH 7.4.

1.2 試驗方法

1.2.1 血淋巴的抽取

用無菌海水沖洗菲律賓蛤仔，用1 mL的無菌注射器先吸取0.3 mL上述不同的抗凝劑, 再從菲律賓蛤仔閉殼肌處抽取0.3 mL血淋巴, 混合均勻后, 注入離心管中, 同時以不加抗凝劑的血淋巴為對照組，抽取的血淋巴放在冰上保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 抗凝劑作用下血細胞凝集團個數(shù)及凝集細胞數(shù)的統(tǒng)計

獲取血淋巴后，分別于0、2、6 h在光鏡下觀察血細胞形態(tài)及凝集狀況，并隨機記錄0 h時有血細胞的40個視野中血細胞團數(shù)和每團的血細胞數(shù)量，每組抗凝劑重復3次試驗。

1.2.3 抗凝劑對血細胞存活率的影響

選取抗凝效果較好的抗凝劑，檢測血細胞在各抗凝劑中6 h后細胞存活率。參照司徒鎮(zhèn)強等[17]的方法，取9滴血細胞懸液，加1滴0.4%臺盼藍染料，混勻，取10 μL血淋巴，滴在載玻片上，蓋上蓋玻片，在3 min內顯微鏡下隨機記錄100個細胞中活細胞和死細胞數(shù)(藍色細胞為死亡細胞，成團的細胞不計死亡率)，并根據(jù)下列公式求出細胞存活率。

血細胞存活率/%=活細胞數(shù)量/(活細胞數(shù)量+死細胞數(shù)量)×100%

1.2.4 抗凝劑對血細胞組成影響

根據(jù)細胞中顆粒的有無，可將菲律賓蛤仔血細胞分為顆粒細胞和透明細胞，在比較不同抗凝劑對血細胞組成影響時，以固定液(4%甲醛，2%NaCl，1%CaCl2)抽取的血細胞為對照組，光學顯微鏡下(Lecia DM500)隨機計數(shù)每個樣品中100個血細胞，計算出顆粒細胞和透明細胞所占比例。

顆粒細胞占比/%=顆粒細胞數(shù)/計數(shù)血細胞總數(shù)×100%

透明細胞占比/%=透明細胞數(shù)/計數(shù)血細胞總數(shù)×100%

1.2.5 抗凝劑對血細胞凋亡率的影響

采用吖啶橙/溴化乙啶法觀察血細胞凋亡，取50 μL細胞懸液，加入6 μL吖啶橙/溴化乙啶(100 μg/mL)熒光染色，混勻后，將細胞懸液滴加到載玻片上，加蓋玻片后于熒光顯微鏡下觀察。正常細胞的核質著綠色，熒光深淺不一；凋亡早期血細胞，核內染色質發(fā)生不規(guī)則凝集、固縮和周邊化，可形成綠色致密濃染的顆粒狀、團塊狀或半月狀；凋亡后期細胞，染色質塊固縮或碎裂形成凋亡小體，呈橘紅色；壞死的細胞核染色質正常，被E·B染成橘紅色。每個樣品隨機計數(shù)100個細胞。

血細胞凋亡率/%=凋亡細胞數(shù)/計數(shù)的總血細胞數(shù)×100%

1.2.6 透射電鏡樣品制備[11-12]

用抗凝效果較好的抗凝劑抽取血細胞，6 h后用醛類固定液(2%多聚甲醛-2.5%戊二醛，2%NaCl，2 mmol/L CaCl2，pH 7.4)4 ℃固定過夜，3000 r/min離心10 min，血細胞沉淀用2.5%的瓊脂預包埋后，0.1 mol/L二甲胂酸鈉緩沖液清洗血細胞，再用1%鋨酸后固定血細胞2 h，0.1 mol/L二甲胂酸鈉緩沖液清洗血細胞后，進行丙酮梯度脫水，Spi-pon812環(huán)氧樹脂樹脂浸透包埋以及聚合，Leica UC7超薄切片機切片，切片厚70 nm，超薄切片經(jīng)醋酸鈾和檸檬酸鉛染液雙染色，日立HT7700型透射電鏡觀察并拍照，加速電壓80 kV。

1.2.7 掃描電鏡樣品制備

用抗凝效果較好的抗凝劑抽取血細胞，6 h時用醛類固定液(2%多聚甲醛-2.5%戊二醛，2% NaCl，2 mmol/L CaCl2，pH 7.4)4 ℃固定過夜，取20 μL血細胞平鋪于蓋玻片上，之后鋨酸固定2 h，0.1 mol/L二甲胂酸鈉緩沖液清洗血細胞后，進行丙酮梯度脫水，醋酸異戊酯置換、臨界點干燥(EmitechK850)、噴金處理，最后用JEOL 7500F掃描電鏡觀察并拍照。

1.2.8 數(shù)據(jù)的處理和分析

所有數(shù)據(jù)均以3個平行組數(shù)據(jù)的平均值±標準差表示，并采用單因素方差分析和Duncan檢驗法統(tǒng)計分析。

2 試驗結果

2.1 無抗凝劑條件下菲律賓蛤仔血細胞形態(tài)及凝集狀況

菲律賓蛤仔血細胞在無抗凝劑條件下伸出的微絲較多(圖1a)，細胞凝集嚴重(圖1b)；細胞貼壁能力強，20 min內細胞快速貼壁，貼壁細胞微絲減少，逐漸形成偽足，細胞變大、成不規(guī)則狀(圖1c)。在無抗凝劑條件下，2 h后細胞均凝集加重，形成30～100 μm的較大凝集團，6 h時細胞凝集越發(fā)嚴重，最大可形成270 μm的細胞團(圖1d)。

2.2 不同抗凝劑對菲律賓蛤仔血細胞形態(tài)和凝集狀況的影響

抗凝劑1對菲律賓蛤仔血細胞具有較強的抗凝效果，血細胞分散較好，伸出的微絲較少(圖2a)，細胞凝集較輕，團聚的血細胞松散而不緊密(圖2b)，但血細胞的貼壁能力變差；2 h內凝集程度變化不是很大，但6 h后細胞凝集稍加重，形成少量30～60 μm的細胞凝集團。

抗凝劑2中的血細胞凝集程度亦相對較低，但血細胞伸出的微絲較多(圖2c)，2 h后即形成30～90 μm不等的細胞團，6 h即形成大至280 μm的細胞團，并且100 μm以上的細胞團占多數(shù)。

抗凝劑3對血細胞的抗凝效果稍差，多數(shù)細胞凝集成緊密的立體團狀 (圖2d)，抗凝劑4抗凝效果稍好于抗凝劑3，但與抗凝劑3類似，散在血細胞變形大，呈現(xiàn)出長條形、多邊形、8字型等不規(guī)則形態(tài)(圖2e)。

抗凝劑5中血細胞伸出的微絲亦較多；抗凝劑6、7中的血細胞凝集成團緊密，散在的細胞能快速貼壁，伸出偽足(圖2f)，2 h后細胞凝集形成30～200 μm的細胞團，6 h后最大凝集團直徑約達340 μm；抗凝劑8中血細胞凝集團較多，最大的細胞凝集團約105 μm，隨時間的延長，凝集程度增加，2 h后最大的凝集團的長軸直徑約達255 μm。

抗凝劑9和抗凝劑10對菲律賓蛤仔血細胞的抗凝作用較好，6 h內血細胞細胞分散，無凝集?？鼓齽?中的血細胞呈圓形，基本無微絲伸出，抗凝劑10中的血細胞周邊有泡狀結構伸出。

圖1 無抗凝劑條件下菲律賓蛤仔血細胞形態(tài)及凝集狀況的觀察a、b放大倍數(shù)為40倍；c放大倍數(shù)為100倍；d放大倍數(shù)為10倍.

圖2 不同抗凝劑對菲律賓蛤仔血細胞形態(tài)及凝集程度的影響a～f放大倍數(shù)為40倍.

對無抗凝劑組與抗凝劑組中血細胞凝集團個數(shù)進行統(tǒng)計，抗凝劑1、抗凝劑2、抗凝劑9及抗凝劑10處理組血細胞成團的數(shù)目顯著低于無抗凝劑組(P<0.05)(圖3)；從各抗凝劑組細胞團中凝集細胞個數(shù)來看，抗凝劑1、抗凝劑9與抗凝劑10中凝集團中含2～5個細胞的凝集團占90%以上，表現(xiàn)出較好的抗凝效果(表2)。綜合凝集團個數(shù)、凝集團中血細胞的個數(shù)、凝集細胞間的緊密度及細胞形態(tài)，筆者選取的10種抗凝劑抗凝效果表現(xiàn)為抗凝劑9>抗凝劑10>抗凝劑1>抗凝劑2>抗凝4>抗凝劑7>抗凝劑3>抗凝劑8>抗凝劑6>抗凝劑5。

2.3 菲律賓蛤仔血細胞在抗凝劑1、抗凝劑9和抗凝劑10中6 h后成活率的研究

臺盼藍排斥法研究了菲律賓蛤仔血細胞在抗凝劑1、抗凝劑9以及抗凝劑10中6 h時的存活率，菲律賓蛤仔血細胞在3種抗凝劑中6 h內存活率均在94.5%以上，并且各組之間無顯著性差異(P>0.05)(圖4)。

2.4 抗凝劑1、抗凝劑9、抗凝劑10對菲律賓蛤仔血細胞顆粒細胞和透明細胞數(shù)量的影響

為比較不同抗凝劑對血細胞組成的影響，選擇固定液組為對照組，試驗結果見圖5，2 h內抗凝劑1、抗凝劑9和抗凝劑10中顆粒細胞與透明細胞占比與對照組均無顯著差異(P>0.05)；6 h時抗凝劑1中顆粒細胞占比顯著增高(P<0.05)，而抗凝劑9和抗凝劑10中血細胞的顆粒細胞顯著下降(P<0.05)，相對應抗凝劑1中透明細胞占比顯著降低，抗凝劑9與抗凝劑10中透明細胞占比顯著上升(P<0.05)。

圖3 無抗凝劑組和抗凝劑組中血細胞凝集團個數(shù)的比較

圖4 菲律賓蛤仔血細胞在抗凝劑1、抗凝劑9與抗凝劑10中6 h時的存活率

圖5 抗凝劑1、抗凝劑9、抗凝劑10對菲律賓蛤仔血細胞顆粒細胞和透明細胞數(shù)量的影響

2.5 抗凝劑1、抗凝劑9、抗凝劑10對菲律賓蛤仔血細胞凋亡率的影響

用3種抗凝劑剛抽出的血細胞凋亡率無顯著差異(P>0.05)；2 h時抗凝劑1、抗凝劑9中血細胞凋亡率無明顯變化，而抗凝劑10中的血細胞凋亡率顯著上升(P<0.05)；6 h時抗凝劑1中血細胞凋亡率無顯著變化(P>0.05)，而抗凝劑9和抗凝劑10中的凋亡率顯著增加(P<0.05)，并且抗凝劑10中血細胞凋亡率顯著高于抗凝劑9中的凋亡率(P<0.05)(圖6)。

圖6 抗凝劑1、抗凝劑9、抗凝劑10對菲律賓蛤仔血細胞凋亡率的影響

2.6 透射電鏡和掃描電鏡下觀察血細胞形態(tài)結構

掃描電鏡顯示無抗凝劑組菲律賓蛤仔血細胞易伸出大量微絲(圖7a)和偽足(圖7b)，而抗凝劑1中的血細胞表面結構完整，伸出的微絲和偽足顯著減少(圖7c、7d)。透射電鏡顯示抗凝劑1中的血細胞整體結構完好(圖7e)，線粒體、高爾基體等細胞器超微結構保存較好(圖7f)。

圖7 掃描電鏡和透射電鏡下觀察血細胞形態(tài)結構a、b：無抗凝劑組血細胞掃描電鏡圖；M：微絲；P：偽足；c、d：抗凝劑1中的血細胞的掃描電鏡圖；e、f：抗凝劑1中血細胞透射電鏡圖；N：細胞核；Mi：線粒體；G：高爾基體.

3 討 論

無脊椎動物血液中的凝集素是免疫防御的重要體液因子之一，其在血細胞凝集、調理細胞吞噬、宿主與病原相互識別等方面發(fā)揮著重大的作用[18]。血細胞的凝集素已在多種貝類血淋巴中提取，其中包括菲律賓蛤仔[19]。由于凝集素的凝集作用，菲律賓蛤仔血細胞在體外易發(fā)生凝集反應, 即使是低溫狀態(tài)也會在短時間內形成凝集團，類似的現(xiàn)象在其他貝類中已有報道[20], 故在抽取菲律賓蛤仔血淋巴時要立即加入抗凝劑。本試驗選取的抗凝劑1～8以及抗凝劑10是目前有文獻報道的用于貝類血細胞的抗凝劑，抗凝劑9是筆者根據(jù)其他抗凝劑的抗凝效果調整后的配方。試驗結果表明，本試驗所選10種抗凝劑對菲律賓蛤仔血細胞均具有一定的抗凝作用，其中抗凝效果較好的為抗凝劑1、抗凝劑9和抗凝劑10，這些抗凝劑在櫛孔扇貝(Chlamysfarreri)[7]、文蛤(Meretrixmeretrix)[21]和近江牡蠣(Crassostreaariakensis)[16]血細胞上也表現(xiàn)出理想的抗凝效果。

抗凝劑中檸檬酸鹽和乙二胺四乙酸均能與血液中的鈣離子結合，前者形成可溶性復合物，后者形成穩(wěn)定的螯合物，從而阻止血液凝固。比較抗凝劑6和抗凝劑7，抗凝劑7配方是抗凝劑6的基礎上加入了0.38%的檸檬酸鈉，而抗凝劑7的抗凝效果好于抗凝劑6，說明檸檬酸鈉在一定程度上能抑制菲律賓蛤仔血細胞的凝集，但抗凝效果不顯著；抗凝劑2中檸檬酸鈉質量濃度升至8.0 mg/mL時，抗凝效果顯著提高，但達不到完全抗凝的作用，這與張峰[6]發(fā)現(xiàn)低質量濃度的檸檬酸鈉(3.8～5.4 mg/mL)對仿刺參(Apostichopusjaponicus)體腔細胞的抗凝效果不顯著，高質量濃度檸檬酸鈉(7.6～11.4 mg/mL)則對體腔細胞的抗凝效果明顯的的結果相類似。

比較抗凝劑2、抗凝劑3、抗凝劑4和抗凝劑9，其配方的差異主要在于乙二胺四乙酸含量的不同，其抗凝效果表現(xiàn)為抗凝劑9>抗凝劑2>抗凝劑4>抗凝劑3，說明在檸檬酸鈉含量相同的條件下，乙二胺四乙酸含量升高，抗凝效果會提高。有學者發(fā)現(xiàn)當乙二胺四乙酸的質量濃度為2.0～3.0 mg/mL時, 會減輕刺參體腔細胞凝集程度, 但細胞形態(tài)保持較差, 存活率降低[6]，而本試驗選取抗凝劑1和抗凝劑9中乙二胺四乙酸的質量濃度達到了5.845 mg/mL，6 h內對菲律賓蛤仔血細胞的形態(tài)以及血細胞存活率均無影響，這可能跟物種差異有關。比較抗凝劑1、抗凝劑2與抗凝劑9的配方，抗凝劑1中不含有檸檬酸鈉，但乙二胺四乙酸的含量高于抗凝劑2，抗凝劑9是在抗凝劑2的基礎上，提高了乙二胺四乙酸的含量達到抗凝劑1的水平，抗凝效果表現(xiàn)為抗凝劑9>抗凝劑1>抗凝劑2，此結果說明乙二胺四乙酸在菲律賓蛤仔血細胞抗凝作用中起著重要的作用，但乙二胺四乙酸含量也不是越高越好，抗凝劑10中乙二胺四乙酸的質量濃度達到了15 mg/mL，雖然6 h內細胞存活率無變化，但是2 h時就導致血細胞凋亡顯著升高，6 h時血細胞中顆粒細胞占比嚴重下降，說明乙二胺四乙酸含量要控制在合適的范圍內。

筆者通過比較血細胞在不同抗凝劑中的形態(tài)以及凝集程度，發(fā)現(xiàn)抗凝劑1、抗凝劑9和抗凝劑10的抗凝效果比其他抗凝劑好，比較這3種抗凝劑中血細胞在6 h內的存活率、細胞組成比例以及凋亡率，結果表明，6 h內3種抗凝劑對血細胞存活率均無顯著影響，但抗凝劑9、抗凝劑10在6 h時顯著降低了顆粒細胞的數(shù)量，并且顯著提高了血細胞的凋亡率，而抗凝劑1中血細胞除6 h顆粒細胞占比稍升高外，其余指標6 h內均無明顯變化。筆者發(fā)現(xiàn)6 h時抗凝劑1中血細胞有輕微凝集現(xiàn)象，并且凝集團中透明細胞較多，故可認為這是導致6 h時抗凝劑1中顆粒細胞占比升高的原因。利用掃描和透射電鏡對無抗凝劑組和抗凝劑1中6 h時的血細胞進行表面和內部超微結構觀察，結果顯示無抗凝劑組的菲律賓蛤仔血細胞表面會放射出大量微絲，繼而變形形成偽足，這與孫虎山[22]利用掃面電鏡觀察櫛孔扇貝血細胞的表面結構時得到的結果相類似，而用抗凝劑1抽取的血細胞，細胞圓形，伸出的微絲和偽足顯著降低，并且血細胞內部的超微結構保存完好。

綜上所述，雖然抗凝劑1不是抗凝效果最好的抗凝劑，但綜合抗凝劑中血細胞形態(tài)、血細胞組成比例、細胞凋亡率以及血細胞的超微結構等指標，筆者認為在選取的10種抗凝劑中，抗凝劑1是最適合作為菲律賓蛤仔血細胞的抗凝劑。此研究結果為今后利用菲律賓蛤仔血細胞開展免疫學、毒理學等研究提供基本的技術支持和理論依據(jù)。

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