宋軍營　張　娜　潘曉麗　王　琦　吳耀松　蔣時紅　張振強▲

1.河南中醫(yī)藥大學中醫(yī)藥免疫學實驗室，河南鄭州　450046；2.河南中醫(yī)藥大學，河南鄭州　450046

疏松結締組織鋪片方法在組織學與胚胎學實驗教學中應用與體會

宋軍營1，2張娜2潘曉麗2王琦2吳耀松2蔣時紅2張振強1，2▲

1.河南中醫(yī)藥大學中醫(yī)藥免疫學實驗室，河南鄭州450046；2.河南中醫(yī)藥大學，河南鄭州450046

為了提高《組織學與胚胎學》的教學質量，培養(yǎng)學生的綜合素質，在中醫(yī)院校開展了“疏松結締組織鋪片法”的實驗課教學。通過復合染色方法，可一張鋪片呈現藍、紅、紫三種顏色，使得鏡下能夠觀察到兩種纖維和三種細胞。這種方法的實施不僅增強學生動手能力，而且能很好地了解疏松結締組織中細胞的不同表型和分布，同時，既豐富組織學內容，把教學、科研連接一起，又達到提高實驗教學質量的目的。

疏松結締組織；鋪片；實驗教學；復合染色

［Abstract］To improve the teaching quality of histology and embryology，meet the students'desire for knowledge and train their overall quality，the experiment teaching methods of"loose connective tissue"was carried out in Chinese medicine colleges.Three colors:blue，red，purple were present in a piece of glass，two kinds of fibers and three kinds of cells were observed by themicroscope.The implementation of themethod is not only strengthen the student beginning ability，but also is a good understanding of different phenotypes and distribution of cells in loose connective tissue. Meanwhile，the contents of the histology are enriched，teaching and scientific research are connected together，and the goal of the experiment teaching quality is improved.

［Key words］Loose connective tissue；Stretched preparation；Experimental teaching；Compound staining

《組織學與胚胎學》這門課程是中醫(yī)院校醫(yī)學生較早接觸的主要基礎課之一，對于奠定相近基礎學科的作用具有重要意義［1］。中醫(yī)院?！督M織學與胚胎學》教學模式是在理論教學的基礎上，再通過實驗教學著重對相應理論進行驗證，實驗教學中則一般采用理論教學結合切片示教型實驗教學，即通過教師指導學生利用光學顯微鏡，觀察切片標本的細胞、組織和器官等，并簡單描繪出400倍下觀察的部分標本圖像。這對于研究微觀形態(tài)結構、具有龐大的專業(yè)名詞和概念及抽象三維立體結構的驗證性學科來說，學生要想理解和掌握所學內容是遠遠不夠的，所以加強實驗課教學手段，使學生在實驗課上獲得形象化、具體化的感性認識。因此，實驗課的教學質量對培養(yǎng)學生的學習興趣和提高教學效果具有重要意義，直接影響后續(xù)課程的教學質量［2］。

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通訊作者

為了提高中醫(yī)院校醫(yī)學生的綜合素質，響應學校最新提出的教學方法改革提案，我們對實驗教學的內容和講述方式進行創(chuàng)新：即在實驗教學中開展制作疏松結締組織鋪片實驗，由教師示范操作后劃分成組的學生自己獨立操作完成。疏松結締組織鋪片方法是比較常用的組織學技術，通過不同方法著色使其各種細胞和纖維顯現出來，有助于對疏松結締組織成份的認識。通過復合染色方法可一張鋪片呈現藍、紅、紫三種顏色，使得鏡下能夠觀察到兩種纖維和三種細胞［3，4］。這種方法的實施不僅增強學生動手能力，而且能很好地了解疏松結締組織中細胞的不同表型和分布，既豐富組織學內容，把教學、科研連接一起，又達到提高實驗教學質量的目的，由此也改變了學生被動接受性學習和不利的創(chuàng)新能力培養(yǎng)，充分體現學生的主體作用，給學生提供多動手多動腦及進行創(chuàng)造性思維的機會［5］。

1　實驗教學方法

根據2014年3月的預實驗結果，4月完善實驗設計。取健康日本大耳白兔（批準號：DWLL201403015）1只，體重2 kg，連續(xù)腹腔注射1%臺盼藍（美國sigma公司）3 d，然后第5天和第7天再注射，共注射5 d，每天1次；兔緣靜脈注射20%烏拉糖溶液（美國sigma公司）麻醉（5 mL/kg），打開腹腔取皮下腸系膜鋪于蠟盤上，用蛙釘固定；用20%福爾馬林固定液（國藥集團化學試劑有限公司）固定10～15 min（用時新配）；然后用蒸餾水水洗3次；用解剖剪剪成小塊，分給學生（1塊/人），用解剖針輕輕展開腸系膜薄層，借助于組織液黏附于載玻片上，使腸系膜展平完全鋪開，盡量不要有重疊的部分；滴加堿性復紅（北京索萊寶科技有限公司）溶液，放入40℃溫箱內染15 min；出恒溫箱（上海精密儀器公司）用蒸餾水水洗，再用95%酒精（國藥集團化學試劑有限公司）分色1～2 min；分色后再次蒸餾水水洗，滴加偶氮卡紅（北京索萊寶科技有限公司）溶液，在60℃溫箱內復染1～2 min；出恒溫箱后，直接入95%酒精液分色1～2 min；用無水乙醇脫水，用二甲苯（國藥集團化學試劑有限公司）透明，最后滴加中性樹膠封片，鏡下觀察。

2　學生實驗結果分析

實驗做的比較成功的鋪片學生可在顯微鏡（日本Nikon）下觀察到：巨噬細胞形態(tài)大小不一，但外形比較清楚，在纖維中間分布，細胞核較小而染色較深，主要呈圓形或橢圓形，在胞質中可以觀察到粗大的藍色吞噬顆粒；成纖維細胞相對數量較多，而且胞體呈梭形或星形，細胞核大，呈卵圓形，染色后呈淺紅色，但胞質內無藍色顆粒；肥大細胞呈橢圓形，胞質有大量細小顆粒呈淺紫紅色；鏡下看到數量較多呈紅色的膠原纖維，有分支且粗細不等；而呈紫紅色的彈力纖維數量較少，多數彈力纖維單根走行呈細絲狀，在其斷端卷曲成波浪形。根據數量和著色情況能夠清晰分辨出彈力纖維和膠原纖維（染色時間短時膠原纖維較清晰，染色時間長時彈性纖維較清晰），這樣的片子可以作為教學示片（封三圖12）。

實驗做的不成功的鋪片會出現組織塊重疊、時間把握不好（染色過度或染色過短），有的同學會在中間環(huán)節(jié)缺少個別步驟，使分色效果不好等，這些結果都不能很好地在顯微鏡下觀察到實驗要求的三種細胞和兩種纖維。

3　討論

3.1“疏松結締組織鋪片的實驗制作”的教學心得

“疏松結締組織鋪片的實驗制作”是一項常用的組織學技術，其各種細胞和纖維的清晰程度對疏松結締組織成分的認識具有重要作用，而制作良好的標本是培養(yǎng)學生觀察能力、提高學習興趣和教學效果的必備條件，選擇適當的實驗材料和染色方法是提高制片質量的前提。一張理想的教學用疏松結締組織鋪片應具備達到以下幾點：①所有要觀察的細胞核清楚，著色清晰；巨噬細胞吞噬顆粒清晰，均勻分布于胞漿中，成纖維細胞數量明顯很多，胞內無顆粒；肥大細胞形態(tài)明顯，胞質有細小顆粒；②膠原纖維、彈力纖維示清晰且著色不同顯。臺盼藍的注射量、配制濃度和注射時間要適當。濃度低、量少、時間短則巨噬細胞中吞噬顆粒不明顯，過多則會造成吞噬顆粒堆積，鋪片過程中易破裂，同時肥大細胞和成纖維細胞中也有少量藍色顆粒，使三種細胞不易區(qū)別［5］。

本次實驗根據預實驗結果采用1%臺盼藍，連續(xù)腹腔注射3 d，然后第5天和第7天再注射，共注射5 d，每天1次，這樣操作有利于組織間隙中多余染料被巨噬細胞充分吸收，同時也有利于清除掉成纖維細胞胞質內吸入的染料顆粒，從而使組織鋪片背景清晰。采用活體取材，即將大白兔麻醉后進行取材，保證在活體狀態(tài)下取材，避免細胞和組織發(fā)生死后變化，能夠將細胞完好的保存下來，特別是巨噬細胞和肥大細胞，同時也避免取材時間過長導致材料浪費，能夠盡可能保持細胞和組織在活體狀態(tài)下被取下，制作更多的高質量切片。為了在同一張鋪片中同時觀察到膠原纖維、彈性纖維、成纖維細胞、巨噬細胞、肥大細胞等多種成分組成的疏松結締組織，需要采用多色染色法［6，7］。由于此次實驗室采用復合染色方法，染色時間的長短與染色后的結果有很大關系，學生在染色時間上掌握的不夠準確，加上展片的技術不夠熟練，使染色結果呈現多色多樣。不過，大多數學生還是能夠掌握基本的原理和方法，嚴格按照實驗步驟制作片子，最后成功觀察到組織中的細胞和纖維（圖1）。但也有一小部分同學，由于不足夠細心，染色時間把握不好，或者鋪片不到位，有重疊現象，使結果呈現不理想。

在實驗課時，很多同學都表現出積極的態(tài)度參與到實驗中。從一開始飼養(yǎng)動物到給予染色劑注射及實驗課時的解剖工作，學生都自愿參與積極配合。通過這次實驗教學培養(yǎng)了學生的動手能力、觀察能力、思維能力、創(chuàng)新能力，提高了學生學習組織學與胚胎學的興趣和鞏固學生所學的相關基礎理論知識，同時，也培養(yǎng)學生的團結協作能力，使學生在短時間內熟練掌握相關理論和操作技能。

3.2開展“疏松結締組織鋪片實驗”的意義

疏松結締組織是重要的基本組織，在人體中分布廣泛。“疏松結締組織鋪片的實驗制作”是一項綜合性實驗，此項實驗不僅能讓學生通過觀察結締組織的多種組成成分（包括細胞和纖維），從而認識和掌握疏松結締組織的結構特點，而且能把所學理論知識與相關外圍知識聯系起來，同時拓寬學生的知識面，也能夠讓學生初步掌握實驗動物的基本喂養(yǎng)、解剖、取材方法和疏松結締組織鋪片的制備過程及觀察組織切片的方法［8］。在疏松結締組織鋪片的整個制作過程中，要以學生操作為主體，教師給予示范操作后，在一旁適當指導，以使每個學生盡可能發(fā)揮潛能，達到培養(yǎng)和鍛煉學生的多種能力［9，10］。學生完成實驗后可以把自己做好的鋪片放在顯微鏡下觀察，這種自己制作自己觀察描述的學習方式給學生留下深刻的印象，也會使學生對這部分知識掌握更牢固，取得更好的學習效果；同時，綜合性實驗的開設活躍了課堂氣氛，學生觀察能力、動手能力、分析及思維能力的培養(yǎng)及團隊合作意識也得到了鍛煉，也為其他學科（病理學、微生物免疫學等）的實驗技能打下基礎［11］。這樣也達到了理論與實驗一體化教學的目的，使學生把所學的理論知識及時強化、印證，向實踐轉化；將空洞的授課變得具體，抽象的內容變得形象，感性認識與理性認識高度統一，學生的學習興趣和能力都得到提高［12］。

“疏松結締組織鋪片的制作”需要用到多方面的基本實驗技能，也需要醫(yī)學生了解和掌握這些基本的實驗技能。而且，這項實驗也可能是后續(xù)的實驗或科研中的重要環(huán)節(jié)，所以教師通過示范關鍵操作步驟并且在實驗過程中隨時指導，讓學生嚴格按照實驗步驟親自動手操作，從而培養(yǎng)學生的嚴謹科研態(tài)度，認真練習和掌握基本的實驗操作技能。通過這次實驗教學的開展，讓我們對實驗課的教學改革增加信心。我們可以在以后的實驗教學當中引入更多的實驗操作課程，如血液章節(jié)制作“血涂片”實驗，呼吸系統實驗課“觀察纖毛擺動”，生殖系統實驗課開展“精子運動”實驗課等，給學生更多的機會親自動手做實驗，直接觀察實驗結果，充分體現學生的主體作用，給學生提供多動手、多動腦、進行創(chuàng)造性思維的機會［12］。通過這次實驗教學改革，培養(yǎng)了學生對實驗技能的學習和認識，提高了分析問題和解決問題的能力，激發(fā)了學生學習組織學與胚胎學的興趣，并且對鞏固學生所學的相關基礎理論知識具有重要意義。但是，也讓我們得到一個提示：在教學實踐過程中存在著一些不足之處，需要不斷的改進教學方法，即可以通過成立科研興趣小組，培養(yǎng)學生的創(chuàng)新能力：讓學生參與教研室老師的科研課題，接觸并學習一些基本的實驗技術，如石蠟切片的制作、HE染色、免疫組化等，開闊學生的視野，培養(yǎng)學生的科研思維；定期開放實驗室，并配備相關教師對學生進行輔導和幫助，鼓勵學生在業(yè)余時間多去實驗室，通過觀察切片和模型，加深對理論知識的理解和記憶［13，14］，使學生能夠很好地將理論學習與基礎訓練結合起來，激發(fā)學生發(fā)揮主觀能動性，在教學過程中培養(yǎng)學生的獨立性和自主性，通過實驗或病例分析引導學生質疑、討論、探究，在學習中主動思考等［15］，只有這樣才能夠提高組織學實驗教學質量，培養(yǎng)醫(yī)學生綜合素質，促進學生的個性發(fā)展。

［1］尹洪萍.教學用疏松結締組織鋪片技術的改良［J］.杭州師范學院學報（醫(yī)學版），2006，10（3）：277-279.

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［3］王新成，李亞魯，高慧英.疏松結締組織鋪片制作方法的改良和體會［J］.泰山醫(yī)學院學報，2003，24（2）：192.

［4］陳菁，江澍.疏松結締組織鋪片染色法的經驗［J］.解剖科學進展，2001，7（3）：285.

［5］單智焱，孫瑞珍，李秋明，等.組織學與胚胎學教學模式的改革［J］.現代生物醫(yī)學進展，2010，15（10）：2968-2970.

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［15］李徽徽，關宿東，卓煜婭．PBL教學法在組織學與胚胎學教學中的應用初探［J］.蚌埠醫(yī)學院學報，2010，35（1）：79-80.

The application and experience of the stretched preparation method of loose connective tissue in experiment teaching

SONG Junying1，2ZHANG Na2PAN Xiaoli2WANG Qi2WU Yaosong2JIANG Shihong2ZHANG Zhenqiang1，2
1.Laboratory of Medical Immunology，He'nan University of Traditional Chinese Medicine，Zhengzhou 450046，China；2.He'nan University of Traditional Chinese Medicine，Zhengzhou 450046，China

R4

C

1673-9701（2016）15-0130-03

河南省教育科學“十二五”規(guī)劃重點課題（［2013］-JKGHB-0034）；河南中醫(yī)學院校級科研課題（2012JX15）；河南中醫(yī)學院博士科研基金項目（BSJJ2012-07）

2016-03-31）