劉 棟，李 晴，楊寶江，陳招榮

(天津農(nóng)學(xué)院 園藝園林學(xué)院，天津 300384)

春季棗瘋病植原體在樹體內(nèi)的分布及對葉片組織發(fā)育的影響

劉 棟，李 晴，楊寶江，陳招榮*

(天津農(nóng)學(xué)院 園藝園林學(xué)院，天津 300384)

為明確棗瘋病植原體早春在棗樹植株體內(nèi)的移動(dòng)和分布，揭示棗瘋病植原體的致病機(jī)制，利用nested-PCR法檢測春季棗樹新生枝葉中棗瘋病植原體的積累情況，結(jié)果顯示，發(fā)病叢枝春季可以部分萌發(fā)，初期即含有植原體。輕度發(fā)病植株植原體分布不均勻，主要分布在發(fā)病枝和相鄰部位；重度發(fā)病植株各部位枝條均可帶毒，植原體檢出時(shí)間與距離發(fā)病枝條遠(yuǎn)近相關(guān)。用石蠟切片法比較分析葉片組織結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示，棗瘋病植原體侵染導(dǎo)致葉片結(jié)構(gòu)發(fā)育受到抑制，葉片厚度減小，角質(zhì)層和表皮細(xì)胞變薄，薄壁細(xì)胞顯著減少，葉脈組織結(jié)構(gòu)排列紊亂，形成層和薄壁細(xì)胞明顯變形和減少，厚角細(xì)胞和晶體分泌細(xì)胞明顯減少。

棗瘋病； 植原體； 巢式PCR； 分布； 組織結(jié)構(gòu)

棗(ZiziphusjujubaMill.)原產(chǎn)于我國黃河流域，栽培歷史悠久，是我國特有干果和經(jīng)濟(jì)林樹種[1]。由于棗樹具有抗寒、抗旱、耐澇、耐鹽堿等特點(diǎn)并產(chǎn)生較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，近年來在天津地區(qū)種植面積不斷擴(kuò)大，成為發(fā)展最快的經(jīng)濟(jì)林樹種,目前天津靜?？h種植棗樹超過1.4萬hm2，且呈逐年平穩(wěn)增長趨勢，被譽(yù)為中國金絲小棗之鄉(xiāng)[2]。在棗生產(chǎn)過程中，由植原體引起的一類系統(tǒng)性病害——棗瘋病(jujube witches’ broom)對棗樹具有毀滅性，遍布于我國各大棗區(qū)，嚴(yán)重阻礙了棗樹產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

棗瘋病的主要癥狀為花器返祖和枝芽不正常萌發(fā)生長，1 a多次連續(xù)萌生細(xì)小枝葉，形成叢枝，葉色黃綠，冬季不落，植株發(fā)病初期只在局部枝條上顯癥，然后擴(kuò)散到全株，無法正常結(jié)果[3]。通過電子顯微鏡觀察發(fā)病組織超薄切片可以發(fā)現(xiàn)，在寄主韌皮部篩管細(xì)胞中有無細(xì)胞壁的植原體粒子存在[3]。DAPI染色技術(shù)及顯微觀察發(fā)現(xiàn)，植原體主要聚集在韌皮部組織中[3-4]。植原體的侵染影響了植物體的基因表達(dá)[5-6]，干擾了植物的正常生理代謝，降低植株葉片葉綠素含量,影響光合作用[6-8]，同時(shí)使各種蛋白質(zhì)[6]、激素[9]、酶類[10-12]及其他活性物質(zhì)和次生代謝物質(zhì)[13]都發(fā)生改變。一般來說病害產(chǎn)生首先發(fā)生生理上的病變，然后引起組織結(jié)構(gòu)病變，最后導(dǎo)致形態(tài)上的病變。已有大量研究針對棗瘋病的生理病變和形態(tài)病變開展，對闡明棗瘋病植原體侵染和發(fā)病機(jī)制提供了大量的證據(jù)，但是關(guān)于組織結(jié)構(gòu)病變的研究較少。為此，以春季萌芽的枝條作為研究對象，分析發(fā)病程度不同的植株中枝條萌動(dòng)和植原體分布情況，利用石蠟切片法觀察發(fā)病和健康葉片結(jié)構(gòu)差異，分析棗瘋病癥狀表現(xiàn)及生理生化變化相關(guān)的植物組織結(jié)構(gòu)變化，進(jìn)一步解釋棗瘋病植原體的致病機(jī)制，為棗瘋病的防治提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

春季新生葉采集于天津農(nóng)學(xué)院院內(nèi)及院外綠化帶內(nèi)種植棗樹。院內(nèi)棗樹表現(xiàn)為局部叢枝，根據(jù)劉孟軍等[4]提出的棗瘋病分級標(biāo)準(zhǔn)，將其瘋枝病情定為Ⅱ級；院外棗樹表現(xiàn)為整株全瘋，瘋枝病情定為Ⅳ級。每棵樹分別采樣,設(shè)3次重復(fù)。

1.2 方法

1.2.1 棗瘋病植原體PCR檢測 4月20日、5月10日和5月30日上午9:00—10:00分別從不同棗樹上采集相同部位完全展開葉，其中“瘋枝”為枝條萌發(fā)后呈叢枝癥狀的枝條，“瘋枝旁健枝”為離瘋枝最近的健康枝條，“遠(yuǎn)端健枝”為離瘋枝最遠(yuǎn)端的健康枝條。樣品總DNA提取參照天根公司植物基因組DNA提取試劑盒(DP305-02)說明書。植原體16S rRNA基因擴(kuò)增采用Lee等[14]報(bào)道的通用引物 R16mF2/R16mR1(5′-CTAGCAAGTCAAGTCGAAC-

GGA-3′，5′-CTTAACCCCAATCATCGAC-3′；退火溫度60 ℃)，反應(yīng)體系為20 μL，PCR產(chǎn)物于4 ℃保存?zhèn)溆?。nested-PCR擴(kuò)增根據(jù) Gunderson等[15]的方法合成 nested-PCR引物，分別為R16F2n(5′-GAAACGACTGCTAAGACTGG-3′)和R16R2n(5′-TGACGGGCGGTGTGTACAAACCCCG-3′)。將前一步獲得的PCR產(chǎn)物稀釋30倍后分別作為DNA模板，進(jìn)行nested-PCR反應(yīng)，退火溫度為57 ℃。取5 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%的瓊脂糖凝膠電泳，經(jīng)EB染色后在紫外檢測儀254 nm波長下觀察并拍照記錄數(shù)據(jù)。

1.2.2 石蠟切片制作及分析 5月30日9:00—10:00從不同棗樹上采集相同部位完全展開葉，分別制作健康葉片和發(fā)病葉片的石蠟切片，具體流程如下：FAA (38%甲醛、冰醋酸和70%酒精按1∶1∶18體積比混合)固定24 h以上，經(jīng)洗滌、酒精脫水、二甲苯透明、浸蠟、包埋、切片、貼片、二甲苯脫蠟、酒精復(fù)水、1%番紅12 h和1%固綠30 s染色、洗滌和脫水、中性樹膠封片干燥后,采用Leica_DM4000B顯微觀察、Leica DFC450 CCD相機(jī)拍照。顯微照片用圖像分析軟件LAS V4.2處理,測量角質(zhì)層、上表皮、下表皮、柵欄組織和海綿組織厚度及葉厚等指標(biāo)，比較葉片主葉脈的維管束、薄壁組織、厚角組織、分泌細(xì)胞等結(jié)構(gòu)差異。每個(gè)處理制作5片以上封片，經(jīng)鏡檢拍照后的每個(gè)顯微圖片各指標(biāo)測量計(jì)算不少于12次，再進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 春季棗瘋病植原體在樹體組織中的分布情況

在林間觀察發(fā)現(xiàn)，4月中旬棗樹陸續(xù)開始萌動(dòng)，4月20日健康植株和枝條萌發(fā)出新枝和新葉，而發(fā)病枝條比健康枝條推遲10～15 d萌發(fā)。本研究通過nested-PCR法對所采集樣品進(jìn)行植原體檢測，結(jié)果表明，不同瘋枝級別的植株春季新萌發(fā)的瘋枝中(5月10日)均檢測到植原體存在，而且隨著時(shí)間的推移，植原體含量在逐步增加(表1)。在瘋枝級別為Ⅱ級植株中“瘋枝旁健枝”萌發(fā)較瘋枝級別為Ⅳ級的植株更早，4月20日和5月10日采集“瘋枝旁健枝”上的葉片未能檢測到植原體，直至5月30日第3次采集時(shí)檢測到了植原體。而在瘋枝級別為Ⅳ級的植株中，4月20日 “瘋枝旁健枝”尚未萌芽，5月10日采集的“瘋枝旁健枝”上的葉片中檢測到了植原體。在瘋枝級別為Ⅱ級植株中，“遠(yuǎn)端健枝”從萌芽開始直至本研究檢測結(jié)束均未檢測到植原體，說明在輕度發(fā)病的植株中遠(yuǎn)離發(fā)病部位的組織不帶毒。在瘋枝級別為Ⅳ級的植株中， “遠(yuǎn)端健枝”剛萌發(fā)枝葉未被植原體感染，但是從5月10日開始均檢測到植原體的存在，說明植原體幾乎遍布了發(fā)病嚴(yán)重的Ⅳ級植株各個(gè)組織。

表1 春季棗瘋病植原體在樹體組織中的檢測結(jié)果

注：“-”表示nested-PCR檢測為陰性；“+” 表示nested-PCR檢測為陽性。

2.2 棗瘋病植原體侵染對植株葉部組織結(jié)構(gòu)的影響

2.2.1 葉片組織結(jié)構(gòu) 健康葉片與發(fā)病小葉組織結(jié)構(gòu)比較結(jié)果見圖1和表2。棗屬于耐旱植物，其角質(zhì)層(A)較厚，健康葉片角質(zhì)層為(6.91±0.59) μm，而被植原體侵染后角質(zhì)層(a)厚度顯著降低，僅為(1.93±1.02) μm。棗健康葉片的柵欄組織(C)發(fā)達(dá)，海綿組織(D)少且不典型，具有海綿組織向柵欄組織過渡的特征，一般由5～6層細(xì)胞組成，柵欄組織厚度為(49.47±0.92) μm，海綿組織厚度為(65.40±2.09) μm;發(fā)病瘋枝小葉葉肉組織細(xì)胞明顯減少為4～5層，且第2層以下細(xì)胞排列松散，由長柱形變化為近球形松散海綿組織細(xì)胞(d)，細(xì)胞間隙明顯增大，柵欄組織(c)厚度為(47.09±1.22) μm，海綿組織厚度(43.90±4.22) μm，柵欄組織和海綿組織厚度與健康葉片相比差異顯著。植原體侵染后小葉的上表皮(b)和下表皮(e)厚度分別為(17.60±1.00) μm和(7.81±1.11) μm，與健康葉片[B、E分別為(20.58±1.19)μm和(11.83±0.98) μm]相比也顯著減小。整體上發(fā)病小葉的葉片厚度明顯小于健康葉片，葉片細(xì)胞發(fā)育受到抑制。在健康葉片的葉肉細(xì)胞及近維管束組織周圍存在著許多晶體和分泌細(xì)胞(F)，但是發(fā)病小葉中的這些細(xì)胞(f)明顯減少。

A、a為角質(zhì)層； B、b為上表皮； C、c為柵欄組織； D、d為海綿組織； E、e為下表皮； F、f為分泌細(xì)胞。標(biāo)尺為100 μm圖1 健康葉片與發(fā)病小葉組織結(jié)構(gòu)比較

μm

注：同列數(shù)據(jù)后標(biāo)注不同小寫字母代表差異顯著(P<0.05)。

2.2.2 葉脈結(jié)構(gòu) 棗瘋病植原體主要存在于寄主植物維管束組織中，所以本研究比較分析了植原體侵染前后棗葉脈的結(jié)構(gòu)變化情況，結(jié)果見圖2。棗具三出脈,主脈由維管束和厚角組織組成，木質(zhì)部在近軸面,韌皮部在遠(yuǎn)軸面,為外韌維管束。由圖2可以看出，健康葉片葉脈各部分排列緊密整齊，木質(zhì)部導(dǎo)管(A)依次發(fā)散型排列，緊接著是2～3層扁平細(xì)胞組成的形成層(B)，韌皮部細(xì)胞(C)排列其后，然后是由4～5層薄壁細(xì)胞(D)和5～6層厚角細(xì)胞(F)組成的維管束鞘，在薄壁細(xì)胞和韌皮部細(xì)胞中存在著大量體積大、染色深的晶體和分泌細(xì)胞(E)。而發(fā)病小葉葉脈中各結(jié)構(gòu)排列較為松散，其中形成層(b)細(xì)胞變形，與韌皮部細(xì)胞(c)無明顯界線，薄壁細(xì)胞(d)嚴(yán)重變形、大小不均，厚角細(xì)胞(f)明顯減少，平均只有3～5層。晶體和分泌細(xì)胞(e)也明顯減少，這與葉片組織結(jié)構(gòu)比較結(jié)果一致。

A、a為導(dǎo)管細(xì)胞； B、b為形成層； C、c為韌皮部細(xì)胞； D、d為薄壁細(xì)胞； E、e為晶體和分泌細(xì)胞； F、f為厚角細(xì)胞。標(biāo)尺為100 μm圖2 健康葉片葉脈與發(fā)病小葉葉脈組織結(jié)構(gòu)比較

3 結(jié)論與討論

植原體為專性寄生物，僅寄生于韌皮部有功能的篩管中，由于受到活動(dòng)范圍或植物抗病性的限制，會呈現(xiàn)出長時(shí)間局限分布在植株的某些部位，通過病原檢測和癥狀觀察,人們發(fā)現(xiàn)棗瘋病癥狀與病原的存在具有高度相關(guān)性[16-17]。本研究利用nested-PCR法檢測春季萌芽后不同瘋枝等級棗樹上不同部位新萌芽枝條中植原體的存在情況，結(jié)果表明，個(gè)別瘋枝可以萌發(fā)新芽，萌發(fā)時(shí)間明顯晚于健康枝條，而且萌芽伊始即可檢測到植原體。健康枝條的新芽中開始未能檢測到植原體，但隨著時(shí)間推移病原分布與枝條離瘋枝的距離呈一定相關(guān)性，與石小玉等[17]研究結(jié)果一致，其認(rèn)為植原體的分布與癥狀出現(xiàn)的部位具有較高的相關(guān)性，在無癥狀的枝條中檢測不到植原體或離發(fā)病部位越遠(yuǎn)，病原數(shù)量越少。在新發(fā)病植株中植原體呈不均勻分布，主要集中在瘋枝上，而在重度發(fā)病植株中這種不均勻性減弱，在植株的各個(gè)部位包括遠(yuǎn)離發(fā)病部位的健康枝條中均可檢測到植原體，因此，對于輕度發(fā)病植株可以采用病枝萌芽前去除瘋枝的方法進(jìn)行防治，有利于減緩病情發(fā)展，但對于重度發(fā)病植株，去除瘋枝治療效果并不理想。

棗樹感染棗瘋病后通常枝條節(jié)間變短、枝葉叢生、葉片黃化并且變小,研究表明，患棗瘋病病樹的凈光合速率遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于正常樹水平，葉綠素含量明顯降低，光合能力明顯下降，光合作用受到明顯抑制[7-8]。病葉的這些異常生理現(xiàn)象必然會導(dǎo)致組織病變。為了進(jìn)一步分析棗瘋病植原體導(dǎo)致寄主植物癥狀產(chǎn)生的機(jī)制，本研究分析了植原體侵染對寄主葉片結(jié)構(gòu)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，發(fā)病小葉角質(zhì)層、柵欄組織、海綿組織、上下表皮厚度以及葉片厚度與健康葉片相比都明顯減小，特別是葉肉細(xì)胞由5～6層減少到4～5層，海綿組織細(xì)胞間隙明顯變大，細(xì)胞形態(tài)由長柱形變?yōu)榻蛐?。罹患泡桐叢枝病的病枝小葉組織結(jié)構(gòu)也出現(xiàn)類似的變化[18]。說明葉片組織發(fā)育受到抑制，導(dǎo)致光合作用效率降低，物質(zhì)合成減緩，呼吸作用和蒸騰作用增強(qiáng)，最終出現(xiàn)黃化、小葉等癥狀。植原體主要存在于寄主韌皮部細(xì)胞，而且依賴篩管細(xì)胞進(jìn)行系統(tǒng)移動(dòng)[4]，本研究發(fā)現(xiàn)植原體侵染會導(dǎo)致葉脈組織發(fā)生紊亂，木質(zhì)部和韌皮部間的形成層細(xì)胞以及韌皮部細(xì)胞變形排列雜亂，說明植原體侵染影響了導(dǎo)管和篩管等細(xì)胞的分化和形成，將造成水分的“供給”與蒸騰“消耗”平衡失調(diào),最終導(dǎo)致罹病枝條枯死。薄壁細(xì)胞是植物體貯藏物質(zhì)的主要結(jié)構(gòu)，植原體侵染導(dǎo)致葉脈和葉肉細(xì)胞中的薄壁細(xì)胞均發(fā)生變形和減少，必然會導(dǎo)致組織內(nèi)淀粉、蛋白質(zhì)以及各種酶類物質(zhì)減少。在葉肉細(xì)胞和維管束組織中發(fā)現(xiàn)大量晶體和分泌細(xì)胞，這些細(xì)胞與葉片保水率及硬度密切相關(guān)[19]，由于植原體侵染導(dǎo)致這些細(xì)胞大量減少，從癥狀上就表現(xiàn)出葉片的機(jī)械性能降低,并且改變了細(xì)胞的滲透勢,減弱葉片吸水和保水能力，從而降低了罹病部位的抗性，導(dǎo)致大部分發(fā)病叢枝耐受不了冬季低溫而死亡，春季部分萌發(fā)叢枝生長遲緩、發(fā)育不良。

本研究證明了春季棗樹發(fā)病叢枝可萌發(fā)新芽且?guī)в兄苍w，植原體的分布及擴(kuò)散與距離發(fā)病部位的遠(yuǎn)近有關(guān)。發(fā)病葉片組織結(jié)構(gòu)比較分析結(jié)果揭示了棗瘋病發(fā)病后葉片的細(xì)胞結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，如細(xì)胞數(shù)量減少、排列紊亂，甚至某些特殊結(jié)構(gòu)缺失等。這些研究結(jié)果對棗瘋病發(fā)病機(jī)制的揭示具有積極意義，值得進(jìn)一步探索和研究。

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Distribution of Jujube Witches’ Broom Phytoplasma in Plant and Leaves Microstructure of Pathogenetic Chinese Jujube in Spring

LIU Dong,LI Qing,YANG Baojiang,CHEN Zhaorong*

(College of Horticulture and Landscape,Tianjin Agricultural University,Tianjin 300384,China)

To identify the movement and distribution of jujube witches’ broom phytoplasma in the jujube plant and to reveal the disease pathogenic mechanism of phytoplasma,the distribution of jujube witches’ broom phytoplasma in germinated branches was analyzed by nested-PCR method.The results showed that part branches with jujube witches’ broom germinated in Spring and contained phytoplasma.In the plants with mild symptom phytoplasma asymmetrically distributed,which was limited in the witches’ broom and adjacent parts.In the plants with serious symptom phytoplasma existed in all tissues,and the content of phytoplasma was negatively correlated with the distance from the witches’ broom.Based on the paraffin sectioning method the microstructure of leaves was analyzed.The results showed that blade structure development was inhibited in the witches’ broom.The thickness of the leaves,cuticles and epidermal cells were significantly reduced.The number of parenchyma cells was decreased.The arrangement of leaf vain tissue was disordered.The cambium and epidermal cells deformed and reduced significantly.Collenchyma cells and secretory cells were also significantly decreased.

jujube witches’ broom; phytoplasma; nested-PCR; distribution; microstructure

2015-08-18

2014年國家級高等學(xué)校大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃(201410061006)；天津市優(yōu)秀青年教師培養(yǎng)計(jì)劃項(xiàng)目；天津市高等學(xué)?？萍及l(fā)展基金計(jì)劃項(xiàng)目(2140622)

劉 棟(1992-)，男，內(nèi)蒙古阿拉善左旗人，在讀本科生，研究方向：林學(xué)。E-mail:Liudong@tjau.edu.cn

*通訊作者：陳招榮(1980-)，女，福建三明人，講師，博士，主要從事植物保護(hù)教學(xué)與研究工作。 E-mail:chenzr@tjau.edu.cn

S436.65

A

1004-3268(2016)02-0087-05