張海月，康元環(huán)，孫武文，陳龍，張冬星，安鼎杰，田佳鑫，單曉楓，錢愛東

(吉林農(nóng)業(yè)大學動物科學技術學院，長春 130118)

烏鱧源維氏氣單胞菌胞外產(chǎn)物的生物學活性分析

張海月，康元環(huán)，孫武文，陳龍，張冬星，安鼎杰，田佳鑫，單曉楓*，錢愛東*

(吉林農(nóng)業(yè)大學動物科學技術學院，長春 130118)

為研究維氏氣單胞菌胞外產(chǎn)物在烏鱧感染中的致病作用以及維氏氣單胞菌的致病機理，以烏鱧源維氏氣單胞菌WL161為研究對象，提取其胞外產(chǎn)物，采用打孔法測定其胞外產(chǎn)物的酶活性，并對與毒力密切相關的溶血活性進行進一步的溶血譜研究，同時分析其致病性。應用LC-MSMS方法對其胞外產(chǎn)物蛋白成分進行鑒定，利用Gene Ontology(GO)對已鑒定蛋白進行生物學過程、分子功能和細胞組分的分類分析。結果表明，WL161菌株具有淀粉酶活性、脂肪酶活性、蛋白酶活性和溶血活性，不具有明膠酶活性；ECP對其他多種動物紅細胞均有溶血活性，對魚類紅細胞溶血性較強，但對雞紅細胞無溶血活性。其胞外產(chǎn)物共檢測出118種蛋白，共參與40種生物學過程，主要涉及碳水化合物代謝過程、幾丁質分解代謝過程、DNA結合等；69種分子功能主要涉及ATP結合、金屬離子結合、碳水化合物結合等；19種細胞組分主要包括胞外區(qū)、細胞質、細胞外膜等。

維氏氣單胞菌；胞外產(chǎn)物；酶活；GO分類分析

維氏氣單胞菌是一種人獸魚共患病原菌[1]，該菌對多種不良環(huán)境具有耐受能力，可在4 ℃條件下緩慢生長并產(chǎn)生毒力因子[2-3]，其毒力有強弱之分，強毒菌株可能感染宿主使之發(fā)病，或者通過一定的傳播途徑感染其他動物，患病動物以出血性敗血癥和腸炎等為主要臨床表征[4]。胞外產(chǎn)物(ECP)是致病菌在生長繁殖過程中釋放出的代謝產(chǎn)物，是侵染機體的主要成分之一[5]。ECP可以抵抗宿主免疫因子的作用，分解破壞宿主機體的組織成分，有利于其他病原的進一步侵染；還可以破壞機體血淋巴中凝血系統(tǒng)的酶活性，破壞血細胞，并導致溶血現(xiàn)象的發(fā)生等等，因此ECP成為決定病原菌毒力的重要因素之一[6]。目前國內(nèi)外對維氏氣單胞菌胞外產(chǎn)物的研究鮮有報道。本試驗以烏鱧源維氏氣單胞菌胞外產(chǎn)物為研究材料，對其主要蛋白酶活性、致病性及蛋白成分進行分析。

1 材料與方法

1.1 菌種 烏鱧源維氏氣單胞菌WL161，由本實驗室分離鑒定[7]并保存。

1.2 試驗動物 試驗用斑馬魚購自長春市某花鳥魚市場，體重0.3～0.4 g，體長3.0～3.5 cm，暫養(yǎng)觀察2周無異常后進行試驗，試驗前禁食24 h。

1.3 維氏氣單胞菌胞外產(chǎn)物(ECP)的制備 在無菌條件下，用鉑耳在TSA平板上挑取單菌落接種于不含酚紅的DMEM培養(yǎng)基，28 ℃ 180 r/min振蕩培養(yǎng)36 h后收集培養(yǎng)物，4 ℃，12000 r/min離心30 min，收集上清液。經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾除菌后，加入固體硫酸銨至75%的飽和度，4 ℃靜置過夜。4 ℃，12000 r/min 離心30 min，棄上清液，用0.02 mol/L Tris-HC1 (pH 7.4)緩沖液將沉淀重懸，經(jīng)透析，聚乙二醇(PEG)10000濃縮，得到胞外產(chǎn)物，然后涂于TSA固體平板，確定無菌后分裝，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?.4 胞外產(chǎn)物的酶活性及溶血性分析 用打孔法測定維氏氣單胞菌ECP的淀粉酶、脂肪酶、蛋白酶、明膠酶酶活性以及溶血活性。分別配置含可溶性淀粉(2%)、吐溫80 (1%)、脫脂牛奶 (8%)、明膠(4%)和兔鮮血(7%)的TSA平板。用直徑為6 mm打孔器在平板上打孔并用酒精燈火焰稍微加熱封底。向孔內(nèi)加入50 μL胞外產(chǎn)物以50 μL TSA液體培養(yǎng)基為陰性對照，30 ℃培養(yǎng)24～48 h后觀察結果。

1.5 胞外產(chǎn)物溶血譜測定 參照Sahu I等[8]的方法略有改進，測定胞外產(chǎn)物對鯽魚、草魚、鯉魚、鰱魚、雞、兔、小白鼠等動物紅細胞的溶血價。胞外產(chǎn)物用無菌生理鹽水在96孔板上倍比稀釋，然后加入等量的2%紅細胞，輕輕混勻，37 ℃溫箱放置1 h，然后4 ℃冰箱過夜，以50%的紅細胞溶解的ECP最高稀釋度為溶血價。設2個對照組，對照組A為不加任何物質的紅細胞稀釋液，對照組B為100%溶血的紅細胞懸液。1.6 胞外產(chǎn)物致病性的測定 將200尾健康斑馬魚隨機分成4組，試驗Ⅰ組將維氏氣單胞菌離心取沉淀，并用PBS反復洗滌3次，以去除ECP，并用無菌PBS十倍遞進稀釋至2.8×108、2.8×107、2.8×106、2.8×105、2.8×104、2.8×103CFU/mL，每個濃度注射10尾；試驗Ⅱ組注射維氏氣單胞菌胞外產(chǎn)物，ECP濃度為0.48 mg/mL，用無菌PBS倍比稀釋至0.24、0.12、0.06、0.03、0.015 mg/mL，每個濃度注射10尾；試驗Ⅲ組注射處理后的維氏氣單胞菌菌體與胞外產(chǎn)物的混合物，具體情況見表2；對照組20尾注射無菌PBS，每尾斑馬魚腹腔注射10 μL。感染后觀察7 d，統(tǒng)計死亡數(shù)量。

1.7 胞外產(chǎn)物蛋白成分鑒定及GO功能分析 純化WL161胞外產(chǎn)物，采用液相色譜與串聯(lián)質譜相結合的方法(LC-MSMS)對胞外產(chǎn)物蛋白成分進行鑒定。通過Blast檢索序列相似的模式生物蛋白，對鑒定到的蛋白進行GO功能分析(生物學過程、分子功能和細胞組分)，信息來自 UNIPROT (http://www.uniprot.org)網(wǎng)站。

2 結果與分析

2.1 胞外產(chǎn)物的酶活性及溶血性 維氏氣單胞菌WL161的胞外產(chǎn)物在各平板上30 ℃培養(yǎng)24～48 h后觀察發(fā)現(xiàn)，淀粉平板加入盧戈氏碘液后加樣孔周圍出現(xiàn)透明環(huán)；吐溫80平板加樣孔周圍出現(xiàn)了不透明的白色暈圈；脫脂牛奶平板加樣孔周圍出現(xiàn)了透明環(huán)；兔血培養(yǎng)基平板加樣孔周圍出現(xiàn)了無色透明環(huán)；明膠酶培養(yǎng)基平板加樣孔周圍無變化(圖1)。結果表明，維氏氣單胞菌WL161株胞外產(chǎn)物具有淀粉酶活性、脂肪酶活性、蛋白酶活性和溶血活性，不具有明膠酶活性。

A.淀粉酶;B.脂肪酶;C.蛋白酶;D.溶血活性;E.明膠酶圖1 WL161胞外產(chǎn)物的酶活性

2.2 胞外產(chǎn)物溶血譜測定結果 WL161胞外產(chǎn)物對鯉魚的溶血價最高為26；其次為鯽魚和鰱魚25；

烏鱧和草魚溶血價均為24；對兔和小白鼠溶血價分別為23、22；對雞紅細胞無溶血作用(表1)。

表1 維氏氣單胞菌胞外產(chǎn)物溶血譜

注：-為無溶血活性

2.3 致病性 健康斑馬魚攻毒后都有不同程度的死亡現(xiàn)象產(chǎn)生，試驗Ⅲ組注射處理后維氏氣單胞菌菌體與胞外產(chǎn)物混合物具有較強的致病性，2.8×107CFU/mL的菌液混有0.24 mg/mL胞外產(chǎn)物時死亡率達到100%，且攻毒后3 h即發(fā)生死亡，12 h時已死亡70%；試驗Ⅱ組注射維氏氣單胞菌胞外產(chǎn)物，濃度0.48 mg/mL時死亡率為100%，攻毒后6 h即發(fā)生死亡；試驗Ⅰ組注射處理后維氏氣單胞菌菌體，攻菌濃度為2.8×108CFU/mL時全部死亡；PBS對照組均未死亡(表2)。

2.4 質譜鑒定與蛋白功能分析 運用LC-MSMS方法分析維氏氣單胞菌WL161胞外產(chǎn)物，共檢測出118種蛋白，其中有27種為功能未知蛋白，43種假定蛋白，其余蛋白分別為蛋白酶S8、外膜血紅素受體、麥芽糖孔蛋白、菌毛蛋白、鞭毛鉤蛋白FlgE、分泌蛋白等等。其中具有絲氨酸內(nèi)肽酶活性的蛋白酶S8為可信度最高蛋白，其次為具有受體活性和轉運活性的外膜血紅素受體和具有相同功能的一種假定蛋白，可信度同樣較高的蛋白還有：位于胞外區(qū)參與幾丁質分解代謝過程和碳水化合物代謝過程的幾丁質酶、胞外區(qū)的氣溶素、具有膜孔蛋白活性的外膜蛋白Aha1等。

表2 WL161菌株及其胞外產(chǎn)物致病性分析結果

續(xù)表

根據(jù)所鑒定蛋白的GO注釋信息，對其進行GO分類：其中參與生物學過程的蛋白有40種，這些生物學過程主要包括碳水化合物代謝過程、幾丁質分解代謝過程和DNA結合等；參與分子功能的蛋白共有69種，其中具有ATP結合、金屬離子結合、碳水化合物結合功能的蛋白較多；參與細胞組分的蛋白共有19種，這些蛋白主要位于胞外區(qū)、細胞質、細胞外膜等。

3 討論與小結

本試驗對烏鱧源維氏氣單胞菌胞外產(chǎn)物的酶活性進行了初步分析。與目前已報道的維氏氣單胞菌胞外產(chǎn)物酶活性存在差異[7-9]，具體原因可能與分離魚的種類、菌株致病性不同等有關。由于淀粉酶具有分解糖原的作用，脂肪酶分解脂類，蛋白酶能分解膠原等蛋白成分，溶血活性導致各組織出現(xiàn)溶血現(xiàn)象。所以當維氏氣單胞菌感染烏鱧時，分泌的ECP的酶活性與溶血活性致使烏鱧的肌肉組織、結締組織、上皮組織等溶解，從而為細菌提供了營養(yǎng)物質。隨著時間的延長，細菌增殖，胞外產(chǎn)物中的酶量也隨即增多，對烏鱧皮膚、肌肉的破壞程度也不斷增加，從而引起烏鱧出血和潰瘍。

維氏氣單胞菌胞外產(chǎn)物能溶解多種動物的紅細胞，但對不同動物的紅細胞的敏感性存在差異。胞外產(chǎn)物對紅細胞的溶血作用與動物種類有很大關系，不同動物溶血價不同。本試驗中胞外產(chǎn)物對魚類紅細胞的溶血價比其它動物要高。鄔向東[10]等發(fā)現(xiàn)鱔魚源嗜水氣單胞菌胞外產(chǎn)物、楊賀[9]等發(fā)現(xiàn)斑點鮰源維氏氣單胞菌胞外產(chǎn)物對魚類紅細胞溶血價比對其他動物高，與本試驗結果相似。

通過對致病性的分析發(fā)現(xiàn)，菌體與胞外產(chǎn)物混合感染斑馬魚時，短時間內(nèi)即發(fā)生死亡，同等濃度時毒力較單獨攻菌體或胞外產(chǎn)物有所增強；單獨感染胞外產(chǎn)物即可導致斑馬魚的發(fā)病和死亡，死亡率也較高，且致病性較單獨感染菌體稍強；感染維氏氣單胞菌菌體時，死亡數(shù)量開始較少，隨著時間的延長，死亡數(shù)量逐漸增多，呈遞增趨勢，究其原因，該組注射的病原菌不含有ECP，對魚的致死性依賴于細菌在體內(nèi)的增值。

經(jīng)過GO分類分析發(fā)現(xiàn)，蛋白具有較為廣泛的生物學功能覆蓋范圍，從生物學過程中可以看出胞外產(chǎn)物參與調控的蛋白多是參與能量代謝相關途徑，如碳水化合物代謝、幾丁質分解代謝等。細胞組分分析發(fā)現(xiàn)這些蛋白更多定位于生命活動的主要場所細胞質、胞外區(qū)和細胞外膜。分子功能分析表明這些蛋白的功能集中在ATP結合、金屬離子結合、碳水化合物結合及水解酶活性等。

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(編輯：侯向輝)

Bioactivity Analysis of Extracellular Products ofAeromonasveroniiStrain Isolated from Channa Argus
ZHANG Hai-yue，KANG Yuan-huan，SUN Wu-wen，CHEN Long，ZHANG Dong-xing，
AN Ding-jie，TIAN Jia-xin，SHAN Xiao-feng*，QIAN Ai-dong*

(CollegeofAnimalScienceandTechnology,JilinAgriculturalUniversity,Changchun130118,China)

In order to study the pathogenic role of extracellular products(ECP) and pathogenic mechanism ofAeromonasveronii，this study extracted the extracellular products fromAeromonasveroniiWL161.The enzyme activity and hemolytic activity of extracellular products were determined by punch method.LC-MSMS and Gene Ontology method were used to identify the protein components of the extracellular products and analysed biological process,molecular function and cellular components,respectively.The results showed that WL161 had amylase and lipase activity, protease and hemolytic activity,without gelatinase activity.ECP of most animals have a hemolytic activity, and the hemolytic effect of ECP showed a high hemolytic activity to fish erythrocyte, while no hemolytic activity to chicken erythrocyte.118 kinds of proteins were detected by the extracellular products.These proteins involved in 40 kinds of biological processes,especially carbohydrate metabolism process,chitin catabolic process and DNA binding;69 kinds of molecular functions,mainly involved ATP binding,metal ion binding,carbohydrate binding;19 kinds of celelular components, including extracellular region,cytoplasm and cell outer membrane.

Aeromonasveronii; extracellular products; enzyme activity; GO classification analysis

國家自然科學基金項目(31201927)；吉林省重點科技攻關項目(20150204065NY)

2016-08-29

A

1002-1280 (2016) 10-0006-04

S852.61