虹鱒IL-17多克隆抗體的制備及初步鑒定

曹永生，徐黎明，趙景壯，劉淼，盧彤巖

（中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所，黑龍江 哈爾濱 150070）

虹鱒IL-17多克隆抗體的制備及初步鑒定

曹永生，徐黎明，趙景壯，劉淼，盧彤巖

（中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所，黑龍江 哈爾濱 150070）

本研究根據(jù)NCBI已發(fā)表序列設(shè)計(jì)引物，提取經(jīng)植物血凝素刺激后的虹鱒Oncorhynchus mykiss頭腎細(xì)胞總RNA，采用RT-PCR方法擴(kuò)增IL-17成熟肽基因，測(cè)序結(jié)果表明所獲得的序列與發(fā)表序列相一致。將該基因重組至原核表達(dá)載體pET32a中，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌Escherichia coli Rosetta，進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。SDS-PAGE電泳結(jié)果表明：目的蛋白以包涵體形式表達(dá)，大小約為32kDa，重組蛋白經(jīng)Ni-NTA系統(tǒng)純化、復(fù)性后純度達(dá)90%以上，以其免疫小鼠制備虹鱒IL-17多克隆抗體。ELISA結(jié)果顯示其效價(jià)為1∶25 600，而間接免疫熒光結(jié)果顯示所制備的多克隆抗體能夠特異性地識(shí)別真核細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)的虹鱒IL-17。本研究成功制備虹鱒IL-17多克隆抗體，為下一步IL-17在虹鱒黏膜免疫中的作用及其佐劑效應(yīng)研究奠定基礎(chǔ)。

虹鱒；IL-17；多克隆抗體

虹鱒是典型的冷水魚，生長較快，因富含蛋白、無肌間刺、富含EPA和DHA等不飽合脂肪酸而備受全世界消費(fèi)者的青睞[1]。近年來，隨著養(yǎng)殖密度的加大和養(yǎng)殖環(huán)境的惡化，虹鱒病害時(shí)常發(fā)生，影響了我國虹鱒產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[2]。我國學(xué)者在虹鱒流行病學(xué)、疫苗制備和藥物防治等方面已取得一定的成果[3-5]，但認(rèn)知免疫機(jī)理對(duì)虹鱒病害致病機(jī)制的掌握及其防治體系的建立更具有積極的意義。

IL-17是由Th17細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，具有抵抗細(xì)菌、真菌、病毒和寄生蟲感染的作用[6-9]。更為重要的是，IL-17受體在黏膜多種細(xì)胞中均有表達(dá)，IL-17A、IL-17C、IL-17F可直接作用于上皮細(xì)胞而誘導(dǎo)多種免疫反應(yīng)，而IL-17E可作用于白細(xì)胞和誘導(dǎo)Th2型免疫反應(yīng)[10]。2013年Monte等[11]首次克隆了虹鱒IL-17，發(fā)現(xiàn)IL-17在健康魚的黏膜組織中可持續(xù)的高水平表達(dá)，而當(dāng)細(xì)菌、寄生蟲和病毒感染時(shí)IL-17在虹鱒頭腎中可顯著被誘導(dǎo)表達(dá)，同時(shí)重組IL-17可影響脾細(xì)胞中抗菌肽和促炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)水平，這意味著虹鱒IL-17在病原體感染所誘導(dǎo)的黏膜免疫中發(fā)揮重要作用。

本研究利用原核表達(dá)系統(tǒng)獲得重組虹鱒IL-17蛋白，并制備多克隆抗體，為進(jìn)一步從蛋白水平研究虹鱒黏膜免疫中IL-17的作用及其佐劑效應(yīng)提供關(guān)鍵材料。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)用健康虹鱒由黑龍江水產(chǎn)研究所渤海冷水性魚類試驗(yàn)站提供，體質(zhì)量約5g。雌性BALB/c小鼠購自哈爾濱醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

鮭胚胎細(xì)胞系CHSE-214、大腸桿菌DH5α、Rosetta均為本實(shí)驗(yàn)室保存。

RNA提取試劑盒和質(zhì)粒小量提取試劑盒為天根生化科技（北京）有限公司產(chǎn)品；弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑購自Sigma公司；DNA轉(zhuǎn)染試劑為Invitrogen公司產(chǎn)品；辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗鼠二抗和FITC標(biāo)記的抗鼠二抗為Abcam公司產(chǎn)品；DNA瓊脂糖凝膠回收試劑盒、DNA Marker、M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶、rTaq DNA聚合酶、pMD18-T simple載體、限制性內(nèi)切酶購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.2 目的基因的克隆及質(zhì)粒的構(gòu)建

虹鱒被處死后，迅速于冰上無菌條件下剝?nèi)☆^腎，經(jīng)PBS洗滌后加入適量的含10%FBS的MEM培養(yǎng)基，分離單核細(xì)胞，經(jīng)5μg/mL的植物血凝素刺激4h后利用RNA提取試劑盒提取總RNA，以引物Oligo（dT）18進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA第一條鏈。參考已發(fā)表的虹鱒IL-17序列（Genbank：NM_001124619），設(shè)計(jì)引物以擴(kuò)增IL-17成熟蛋白基因。上游引物：5'-ATCGGATCCAAAGGAATGAAGGTGACAAAGG-3'（下劃線所示為BamH I酶切位點(diǎn)），下游引物：5'-GACAAGCTTTTATCAAGTAGTCCTTGCCCA-3'（下劃線所示為HindⅢ酶切位點(diǎn)）。PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性 7min；94℃變性 30s，55℃退火30s，72℃延伸24s，25個(gè)循環(huán)；72℃終延伸10min。瓊脂糖凝膠回收目的基因片段，與pMD18-T simple載體連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，將鑒定正確的樣品送往博仕公司進(jìn)行測(cè)序。利用限制性內(nèi)切酶BamH I和HindⅢ切割陽性質(zhì)粒，膠回收獲得目的片段，并與切割好的pET32a載體在16℃下連接過夜，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α。利用PCR、限制性內(nèi)切酶切割法鑒定重組質(zhì)粒。而后，設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增IL-17基因用于構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒，上游引物：5'-CGGAAT TCGCCACCATGAAAGGAATGAAGGTGACAAAGG-3'（下劃線所示為EcoR I酶切位點(diǎn)，加粗所示為Kozark序列用于增強(qiáng)目標(biāo)基因的翻譯效率，斜體所示為起始密碼子），下游引物：5'-CCGCTCGAGTCAA GTAGTCCTTGCCCA-3'（下劃線所示為Xho I酶切位點(diǎn)），以鑒定為正確的陽性質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將目的片段連入pCDNA3.1載體，對(duì)構(gòu)建的重組質(zhì)粒進(jìn)行同樣的酶切鑒定和測(cè)序分析。

1.3 虹鱒IL-17多克隆抗體免疫原的制備

將鑒定正確的陽性原核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌 Rosetta中，自平板上挑取單菌落于含100μg/mL AMP的5mL LB培養(yǎng)基中，37℃220r/min震蕩培養(yǎng)過夜。次日將過夜培養(yǎng)物以1∶100比例接種于100mL LB培養(yǎng)基中，220r/min震蕩培養(yǎng)至OD600達(dá)到0.6～0.8，加入1mMIPTG誘導(dǎo)表達(dá)，每隔1h收集1mL培養(yǎng)物至5h，4℃4 000r/min離心收集菌體。以1/10初始培養(yǎng)基體積的PBS重懸菌體，超聲裂解破碎后分為上清和沉淀，用SDS-PAGE分析目的蛋白存在形式。在明確重組蛋白表達(dá)形式之后，依照QIAGEN公司的《含組氨酸標(biāo)簽重組蛋白的純化手冊(cè)》，采取相應(yīng)的方案純化目標(biāo)蛋白。將純化后的蛋白放入透析袋中，分別在含6mol/L、4mol/L、2mol/L、0mol/L的尿素PBS溶液中透析4h，測(cè)定蛋白濃度后保存于-80℃冰箱中備用。

1.4 重組虹鱒IL-17多克隆抗體的制備與效價(jià)測(cè)定

免疫前自尾靜脈采集三只小鼠血液，制備陰性對(duì)照血清。以純化的重組虹鱒IL-17免疫小鼠，免疫策略為：首次以弗氏完全佐劑乳化的重組蛋白免疫，1周和2周后采用弗氏不完全佐劑乳化的重組蛋白腹腔多點(diǎn)注射加強(qiáng)免疫，劑量均為100μg/只。當(dāng)多抗效價(jià)達(dá)到要求后，摘取眼球方式采集小鼠血液、分離血清，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

多抗效價(jià)的測(cè)定：以碳酸鹽包被液將稀釋純化的重組IL-17蛋白包被于ELISA板中，以5%脫脂乳封閉，將倍比稀釋的多克隆抗血清加于ELISA板中，以辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗鼠抗體為二抗進(jìn)行TMB顯色，終止反應(yīng)后在酶標(biāo)儀中讀取OD450結(jié)果。

1.5 多克隆抗體活性的初步鑒定

采用堿裂解法大量提取所構(gòu)建的重組IL-17真核表達(dá)質(zhì)粒和pcDNA3.1質(zhì)粒（陰性對(duì)照），測(cè)定濃度后與轉(zhuǎn)染試劑混合后，以1μg劑量轉(zhuǎn)染于CHSE-214細(xì)胞，培養(yǎng)72h，棄細(xì)胞上清，以4%多聚甲醛固定細(xì)胞，加入1∶500稀釋的多克隆抗體，以FITC標(biāo)記的抗鼠抗體為二抗進(jìn)行間接免疫熒光鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組質(zhì)粒的鑒定

瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示：在預(yù)期位置387bp左右出現(xiàn)目標(biāo)條帶（圖1），經(jīng)測(cè)定所克隆的序列與參考序列完全一致。以限制性內(nèi)切酶BamH I和HindⅢ切割重組原核表達(dá)質(zhì)粒pET32a-IL-17，以限制性內(nèi)切酶EcoR I和Xho I切割重組真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-IL-17，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果均可見載體片段和目的基因片段，證實(shí)已構(gòu)建包含目的基因IL-17的重組原核/真核表達(dá)質(zhì)粒（圖1）。

圖1 目的基因的擴(kuò)增和重組質(zhì)粒的構(gòu)建Fig.1 Gene cloning and the construction of recombinant plasmids

2.2 虹鱒IL-17多克隆抗體免疫原的制備

SDS-PAGE結(jié)果顯示：誘導(dǎo)2h后的含有陽性重組質(zhì)粒的Rosetta在預(yù)期位置32kDa左右處出現(xiàn)目標(biāo)蛋白條帶（圖2，泳道2），但未誘導(dǎo)的未出現(xiàn)此條帶（圖2，泳道1），證實(shí)重組IL-17在原核表達(dá)系統(tǒng)中已成功表達(dá)。此外結(jié)合BandScan軟件分析結(jié)果，發(fā)現(xiàn)在誘導(dǎo)后4h目的蛋白占全菌蛋白中的比例最高（圖2，泳道3），因此確定收集菌體的時(shí)間為誘導(dǎo)后4h。蛋白表達(dá)形式分析結(jié)果顯示：目標(biāo)蛋白主要是以包涵體形式表達(dá)（圖3，泳道4）。因此，以QIAGEN His純化試劑盒，采用變性蛋白純化策略純化了目的蛋白，經(jīng)BandScan軟件分析結(jié)果顯示：透析后的目的蛋白純度達(dá)到90%以上（圖3，泳道5），可以用于多克隆抗體的制備。

圖2 誘導(dǎo)后不同時(shí)間包含重組質(zhì)粒的Rosetta的表達(dá)產(chǎn)物分析Fig.2 The expressed products in the Rosetta containing the recombinant plasmids induced for different hours

圖3 重組虹鱒IL-17免疫原的制備Fig.3 The generation of recombinant IL-17 in rainbow trout

2.3 虹鱒IL-17多克隆抗體的制備

免疫3次后，對(duì)所制備的多克隆抗血清進(jìn)行自1∶100～1∶204 800的倍比稀釋，利用間接ELISA測(cè)定效價(jià)。結(jié)果表明，當(dāng)（陽性血清OD450-空白OD450）/（陰性血清OD450-空白OD450）＞2.1時(shí)，血清最大稀釋倍數(shù)為1∶25 600，即所制備的多克隆抗體效價(jià)為1∶25 600（圖4）。這表明虹鱒IL-17多克隆抗體已成功制備，且其效價(jià)可以滿足今后的實(shí)驗(yàn)需求。

圖4 虹鱒IL-17多克隆抗體效價(jià)的測(cè)定Fig.4 The titer of the IL-17 polyclonal antibody in rainbow trout

2.4 虹鱒IL-17多克隆抗體活性的初步鑒定

間接免疫熒光法鑒定所制備的虹鱒IL-17多克隆抗的活性結(jié)果顯示：經(jīng)4%多聚甲醛固定后的細(xì)胞形態(tài)較為完整（圖5-A），所制備的多克隆抗體能夠特異性地識(shí)別真核細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)的虹鱒IL-17（圖5-B），而瞬時(shí)轉(zhuǎn)染pcDNA3.1的對(duì)照中無特異性熒光出現(xiàn)（圖5-C），說明制備的虹鱒IL-17多克隆抗體具備理想的效價(jià)和良好的反應(yīng)原性。

圖5 間接免疫熒光鑒定虹鱒IL-17多克隆抗體活性Fig.5 Identification of the IL-17 polyclonal antibody in rainbow trout by indirect immunofluorescence

3 討論

黏膜作為魚類的第一道防線，能敏銳地區(qū)分水體中大量的無害微生物和病原微生物，保證快速有效地激發(fā)免疫反應(yīng)而抵抗病原菌的侵入，因此與陸生動(dòng)物相比，魚類的黏膜免疫系統(tǒng)更為復(fù)雜[12]。 IL-17可誘導(dǎo)產(chǎn)生巨噬細(xì)胞炎癥蛋白-2、G-CSF和趨化因子等而招募中性粒細(xì)胞，也可在IL-22的協(xié)同下誘導(dǎo)產(chǎn)生抗菌肽，清除黏膜處的肺炎克雷伯氏菌K.peneumoniae[13,14]。虹鱒IL-17在黏膜免疫反應(yīng)的作用已在基因表達(dá)水平得到證實(shí)，而劉爽等利用制備的日本七鰓鰻Lampetra japonica IL-17多克隆抗體成功檢測(cè)到了表達(dá)IL-17的淋巴細(xì)胞[15]。因此，以虹鱒IL-17多克隆抗體為材料可分析病原體感染時(shí)虹鱒黏膜組織中IL-17蛋白水平的變化和表達(dá)IL-17的細(xì)胞類群，為揭示虹鱒IL-17在黏膜免疫中的作用提供更為直接的證據(jù)。

疫苗是魚類病害防控的有效手段之一。注射免疫效果雖好，但耗時(shí)、耗力，不適合小規(guī)格魚；浸泡免疫和口服免疫操作簡單，適合批量免疫，但需要克服抗原需要量大和抗原攝入后不可控的問題[16]。而佐劑的使用可提高疫苗的免疫效果，為間接解決上述問題提供了可能?，F(xiàn)已證實(shí)，IL-17具有誘導(dǎo)炎癥因子和招募中性粒細(xì)胞的生物學(xué)特性，可有效地作為疫苗分子的佐劑[17]。同時(shí)，Th17細(xì)胞和IL-17對(duì)發(fā)揮霍亂毒素的黏膜免疫佐劑效應(yīng)具有重要作用[18]。因此，虹鱒IL-17是否對(duì)疫苗免疫效果具有輔助作用是值得探索的。

本研究利用高效、低成本的原核表達(dá)系統(tǒng)成功制備了32kDa的重組虹鱒IL-17，雖然生物信息軟件分析顯示目的基因在大腸桿菌中的CAI僅為0.29（http://www.jcat.de/），但并未影響目的蛋白在大腸桿菌中的有效表達(dá)。通過優(yōu)化誘導(dǎo)劑濃度和誘導(dǎo)溫度未獲得可溶性表達(dá)的虹鱒IL-17（結(jié)果未顯示），推測(cè)這與其為異源蛋白而表達(dá)水平又較高有關(guān)[19]。但本研究以提純的包涵體為樣品，利用Ni-NTA純化系統(tǒng)成功獲得了純度較高的重組虹鱒IL-17，以其為免疫原制備了效價(jià)較高的多克隆抗體。間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)一方面說明了所制備的多克隆抗體能夠特異性結(jié)合真核細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)的虹鱒IL-17，同時(shí)也證實(shí)了所制備的真核表達(dá)質(zhì)?？稍邗q細(xì)胞中有效表達(dá)，為其進(jìn)一步作為核酸佐劑的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

綜上所述，本研究利用原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)了重組虹鱒IL-17，并成功制備能夠特異性識(shí)別真核細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)的虹鱒IL-17，為后續(xù)IL-17在虹鱒黏膜免疫中的作用研究或作為佐劑的應(yīng)用提供關(guān)鍵的物質(zhì)材料。

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Preparation and Identification of Polyclonal Antibody of IL-17 in Rainbow Trout（Oncorhynchus mykiss）

CAO Yong-sheng,XU Li-ming,ZHAO Jing-zhuang,LIU Miao,LU Tong-yan
（Heilongjiang Fisheries Research Institute,Chinese Academy of Fishery Sciences,Harbin 150070,China）

RT-PCR was carried out to amplify IL-17 gene encoding the mature peptide using the primers designed based on the NCBI reference sequence to prepare the polyclonal antibody of IL-17 in rainbow trout（Oncorhynchus mykiss）.The head kidney leucocyte cultures in rainbow trout stimulated by PHA were used as a template.The results showed that IL-17 was successfully amplified and the sequence was the same with the reference sequence.Then,the gene fragment was inserted into the pET32a vector and expressed in Escherichia coli Rosetta.SDS-PAGE revealed that the recombinant protein with molecular weight of about 32 kDa was expressed in the inclusion bodies,and was purified using the Ni-NTA system with purity of over 90%.The purified proteins were inoculated into mice to prepare the polyclonal antibody which had titer of 1:25 600 by ELISA.Finally the indirect immunofluorescence proved that the polyclonal antibody specifically recognized the IL-17 which was transiently expressed in the CHSE-214 cells.In conclusion,the polyclonal antibody of IL-17 is successfully prepared and will contribute to the further study on the roles of IL-17 in the mucosal immunity and application in an adjuvant for rainbow trout（Oncorhynchus mykiss）.

rainbow trout（Oncorhynchus mykiss）;IL-17;polyclonal antibody

S942.5

A

1005-3832（2016）06-0001-05

2016-05-11

國家科技支撐計(jì)劃（2012BAD25B02）；黑龍江省應(yīng)用技術(shù)研究項(xiàng)與開發(fā)計(jì)劃（GA13B401）；中央級(jí)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)（HSY201411）；新疆維吾爾自治區(qū)區(qū)域協(xié)調(diào)創(chuàng)新專項(xiàng)（2016E02052）.

曹永生（1987-），男，助理研究員，從事水產(chǎn)免疫學(xué)與病害控制研究.E-mail:caoyongsheng@hrfri.ac.cn

盧彤巖.E-mail:lutongyan@hotmail.com