王艷，戴琴，莊曉洪

（1.成都市農(nóng)業(yè)質(zhì)量監(jiān)測中心，成都 610045；2.成都市食品藥品檢驗研究院，成都 610045）

超高效液相色譜法測定黃顙魚肌肉中葉黃素含量

王艷1，戴琴2，莊曉洪2

（1.成都市農(nóng)業(yè)質(zhì)量監(jiān)測中心，成都 610045；2.成都市食品藥品檢驗研究院，成都 610045）

本文建立檢測黃顙魚Pelteobagrus fulvidraco肌肉中葉黃素含量的反相超高效液相色譜分析方法。樣品經(jīng)95%乙醇提取，ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（2.1mm×100mm，1.7μm）分離，以89%甲醇-1%乙腈-10%水為流動相等度洗脫，二極管陣列檢測器檢測，檢測波長446nm，外標法定量。結(jié)果顯示：葉黃素在0.04～0.8μg· mL-1范圍內(nèi)線性良好，此方法檢出時限0.03mg·kg-1。添加量在0.5mg·kg-1、1.0mg·kg-1、5.0mg·kg-1時，葉黃素的回收率為82.0%～84.2%，相對標準偏差在10%范圍內(nèi)。結(jié)果表明：該方法可用于黃顙魚中葉黃素成分的定性和定量檢測。

葉黃素；黃顙魚；超高效液相色譜法

葉黃素是一種無維生素A活性的含氧類胡蘿卜素，廣泛存在于蔬菜、花卉、水果及某些藻類中。葉黃素具有抗氧化、抗衰老、抗癌等多種重要的生理活性[1]，同時具有色澤鮮艷、無毒害、安全性高、著色能力強等特點[2]，已廣泛應(yīng)用于食品、飼料、水產(chǎn)養(yǎng)殖等行業(yè)。葉黃素可賦予魚類的肌肉、皮膚以卵黃色、橙色和紅色，在水產(chǎn)養(yǎng)殖中已較多地使用了葉黃素類著色劑，改善養(yǎng)殖魚類體色，提高其商品價值[3-5]。黃顙魚Pelteobagrus fulvidraco又名黃辣丁，廣泛分布于我國各大江河水系，屬肉嫩味美、營養(yǎng)豐富的優(yōu)質(zhì)淡水經(jīng)濟魚類，備受消費者青睞。

目前，檢測葉黃素含量的方法有分光光度法[6-8]、薄層色譜法[9]、高效液相色譜法[10-12]、質(zhì)譜法[13]等，多見于測定食品、飼料、植物體、奶粉、保健品及血清中葉黃素的含量，極少用于水產(chǎn)動物肌肉中葉黃素含量的測定。分光光度法測試的葉黃素含量是以總類胡蘿卜素計，適合測試含量高的葉黃素浸膏和葉黃素粉末等原料中的葉黃素含量。正相液相色譜法以正相硅膠柱分離，非極性流動相體系洗脫，提取溶劑毒性大，操作較繁瑣。質(zhì)譜法雖選擇性強、檢測靈敏度高，但設(shè)備昂貴，檢測成本高。

本研究采用95%乙醇高效快速提取黃顙魚肌肉和皮中的葉黃素，利用超高效液相色譜檢測快速的特點，建立了黃顙魚肌肉和皮中葉黃素檢測的反相超高效液相色譜新方法，此法能夠滿足實際檢測需求。

1 材料與方法

1.1 材料

儀器：ACQUITY TM超高效液相色譜儀，附二極管陣列檢測器（美國Waters公司）；T25數(shù)顯高速組織勻漿機（德國IKA公司）；超純水凈化儀（美國Millipore公司）。

試劑：葉黃素標準品（20mg，純度≥95.0%，Sigma公司）；乙腈、甲醇和丙酮（HPLC級，德國Merk公司）；95%乙醇（分析純）。

1.2 方法

1.2.1 標準品及溶液制備

準確稱取葉黃素標準品5.0mg，置于50mL棕色容量瓶中，少量丙酮溶解后用甲醇定容至刻度，-20℃冰箱中避光保存。臨用前，用甲醇逐級稀釋成0.04μg·mL-1、0.08μg·mL-1、0.2μg·mL-1、0.4μg·mL-1、0.8μg·mL-1質(zhì)量濃度的標準系列溶液。

1.2.2 超高效液相色譜條件

色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18（2.1mm× 100mm，1.7μm，Waters公司）；流動相：89%甲醇-1%乙腈-10%水；流速：0.5mL·min-1；進樣量：4.0μL；檢測波長：446nm；柱溫30℃。

1.2.3 樣品處理

黃顙魚去頭、骨、內(nèi)臟后取肌肉與皮組織絞碎、混勻作為試樣。稱取試樣4.00g于50mL聚丙烯離心管中，加入 10 mL 95%乙醇，避光勻漿1min，4500r·min-1離心3min，上清液轉(zhuǎn)移至25mL棕色容量瓶中。另取1個50mL離心管，加入10mL 95%乙醇，洗滌均質(zhì)器刀頭，用玻璃棒搗碎離心管中的沉淀，加入上述洗滌均質(zhì)器刀頭溶液。渦旋混合器上避光振蕩5min，4500r·min-1離心3min，上清液合并至同一容量瓶中，用95%乙醇定容至25mL。取清液過0.22μm的有機濾膜即可上機。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取溶劑的選擇

根據(jù)葉黃素不溶于水，易溶于油脂和脂肪性溶劑的特性，分別選取95%乙醇、丙酮-95%乙醇（50∶50，v/v）作為提取溶劑，對同一樣品進行含量及回收實驗，其中95%乙醇作為提取溶劑時，測定樣品含量為1.64mg·kg-1，回收率為82.8%；丙酮-95%乙醇（50∶50，v/v）作為提取溶劑時，測定樣品含量為1.73mg·kg-1，回收率為85.2%。測定結(jié)果表明：兩種提取劑對同一樣品的提取及回收率無明顯差異。因此，選用對人體健康危害和環(huán)境污染更小的95%乙醇作為提取黃顙魚中葉黃素的溶劑。

2.2 色譜柱的選擇

分別選用三種規(guī)格色譜柱進行考察：Waters ACQUITY UPLC BEH C18（2.1mm×100mm，1.7μm）、Kromasil 100-5 C18（4.6mm×250mm，5μm）和Agilent ZORBAX C8（4.6mm×250mm，5μm）。實驗發(fā)現(xiàn)Waters ACQUITY UPLC BEH C18柱的分析時間短、峰型效果好，具有更好的靈敏度，可與雜質(zhì)峰有效分離。因此本文采用Waters ACQUITY UPLC BEH C18作為分離柱。

2.3 線性關(guān)系

配制質(zhì)量濃度 0.04μg·mL-1、0.08μg·mL-1、0.2μg·mL-1、0.4μg·mL-1、0.8μg·mL-1的標準系列溶液，測定色譜峰面積，以質(zhì)量濃度為橫坐標（x），峰面積為縱坐標（y），得線性回歸方程y=1968839x-760，r=0.9996，表明在0.04～0.8μg·mL-1范圍內(nèi)，葉黃素濃度與峰面積線性關(guān)系良好。根據(jù)信噪比S/N=3，得出檢出限為0.03mg·kg-1。葉黃素標準曲線見圖1，色譜圖見圖2。

圖1 葉黃素標準曲線Fig.1 Standard curve of lutein

圖2 色譜圖（0.52mg·kg-1）Fig.2 Chromatogram（0.52mg·kg-1）

2.4 加標回收率試驗

稱取已知葉黃素含量的黃顙魚試樣、按照0.5mg·kg-1、1.0mg·kg-1、5.0mg·kg-1添加水平進行加標回收試驗，同一添加水平重復(fù)測定6次，回收率在82.0%～84.2%范圍內(nèi)，各添加水平回收率的相對標準偏差RSD＜10%，滿足檢測要求，結(jié)果見表1。

表1 回收率Tab.1 Recoveries of the samples（n=6）

2.5 方法精密度

按照本文所述色譜條件，對試樣溶液重復(fù)進樣6次，其峰面積RSD為0.8%，表明該方法精密度良好。

2.6 樣品測定

利用本文建立的方法分析了實驗提供的22批次黃顙魚樣本，各批次樣本中黃顙魚體質(zhì)量均在50～100g之間，根據(jù)魚體色澤的差異，將樣本分為灰色與黃色兩組，結(jié)果各批次黃顙魚均有葉黃素成分檢出，測定結(jié)果見表2，樣品色譜圖見圖2。

表2表明，各批次黃顙魚中葉黃素含量水平不等，體色偏黃的黃顙魚葉黃素含量水平明顯高于體色偏灰色的樣本。絕大多數(shù)水產(chǎn)動物自身不能合成葉黃素，其所需的葉黃素必須來源于食物或飼料，采食后吸收的色素轉(zhuǎn)移到動物組織中，或轉(zhuǎn)化為動物體色素表現(xiàn)出不同的色澤。由于葉黃素是一種廣泛存在于蔬菜、花卉、水果及某些藻類生物中的天然物質(zhì)，這就是為何所有的黃顙魚均檢出葉黃素的原因。但黃顙魚養(yǎng)殖過程中，因養(yǎng)殖模式、環(huán)境不同，對天然餌料生物和人工飼料的依賴程度不同，也會使黃顙魚體色和皮膚、肌肉組織葉黃素含量出現(xiàn)差異。

表2 樣品測定結(jié)果Tab.2 Concentration of lutein in the muscle of Pelteobagrus fulvidraco

3 討論

近年來隨著水產(chǎn)動物的集約化養(yǎng)殖和人工配合飼料的使用，導(dǎo)致水產(chǎn)動物的色澤變淡，嚴重影響了水產(chǎn)品的質(zhì)量和商品價值，于是人們開始有意識在飼料中添加著色劑來改變這種狀況。農(nóng)業(yè)部《飼料添加劑品種目錄（2008）》（農(nóng)業(yè)部公告第1126號）規(guī)定：水產(chǎn)動物飼料著色劑僅允許添加蝦青素，《飼料添加劑品種目錄（2013）》（農(nóng)業(yè)部公告第2045號）新增加天然葉黃素（源自萬壽菊）可作為飼料添加劑中的著色劑用于水產(chǎn)養(yǎng)殖動物。盡管農(nóng)業(yè)部不斷更新《飼料添加劑品種目錄》，但對各類色素的使用劑量未予明確限定，也沒有水產(chǎn)動物檢測的國家或地方標準，這無疑導(dǎo)致一些著色劑的使用存在較大的安全隱患。本文建立的黃顙魚中葉黃素含量測定的高效液相色譜法前處理簡單，色譜條件易于實現(xiàn)，測試數(shù)據(jù)重復(fù)性好，精密度和準確度均能滿足理化分析要求，適用于黃顙魚中葉黃素含量的日常檢測，同時也為相關(guān)水產(chǎn)動物中葉黃素檢測提供了參考。

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Determination of Lutein in Muscle of Pelteobagrus fulvidraco by Ultra Performance Liquid Chromatography

WANG Yan1,DAI Qin2,ZHUANG Xiao-hong2
（1.Agriculture Quality Supervision and Test Center of Chengdu City,Chengdu 610045,China; 2.Chengdu Institute for Food and Drug Control,Chengdu 610045,China）

A reversed-phase ultra-performance liquid chromatography method was established for the determination of lutein in muscle of Pelteobagrus fulvidraco．The sample was extracted by 95%alcohol.Chromatographic separation was performed at the conditions of ACQUITY UPLC BEH C18column（2.1 mm×100 mm,1.7 μm）and 89%methcol-1%acetonitrile-10%water as the mobile phase with isocratic elution．It was detected on a photodiode array detector at the wavelength of 446 nm and quantified by external standard method.The results showed that the method had a good linear correlation within the range from 0.04 μg·mL-1to 0.8 μg·mL-1,and the detection limit was 0.03 mg·kg-1．The average recoveries of lutein varied from 82.0%to 84.2%spiked at 0.5 mg·kg-1、1.0 mg·kg-1、5.0 mg·kg-1with relative standard deviations less than 10%.This developed method is expeditious and reliable,especially feasible for quantitative and qualitative analysis of lutein in Pelteobagrus fulvidraco．

lutein；Pelteobagrus fulvidraco；ultra-performance liquid chromatography method

S965.199

A

1005-3832（2016）06-0052-04

2016-07-15

王艷（1978-），女，高級農(nóng)藝師.E-mail:46274001@qq.com