唐朋林郭 勇

溫陽(yáng)活血法對(duì)寒凝血瘀證荷CT-26小鼠肺組織MMPs及ERK的影響

唐朋林1郭 勇2

目的觀察寒凝血瘀狀態(tài)及溫陽(yáng)活血法對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移靶組織微環(huán)境的影響。方法建立寒凝血瘀證荷瘤小鼠復(fù)合動(dòng)物模型。將48只Balb/c小鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組、單純荷瘤組、寒凝血瘀荷瘤組、溫陽(yáng)活血治療組，每組12只，分別造模，Western blot方法檢測(cè)各組小鼠肺組織MMPs及ERK的表達(dá)。結(jié)果與單純荷瘤組比較，寒凝血瘀荷瘤組小鼠ERK1/2、MMP-2表達(dá)均升高[ERK1/ 2 RI值：（1.40±0.01）比（0.98±0.03），P＜0.05]；[MMP-2 RI值：（1.26±0.05）比（1.00±0.04），P＜0.05]；與寒凝血瘀荷瘤組比較，溫陽(yáng)活血治療組小鼠ERK1/2、MMP-2表達(dá)均降低 [ERK1/2 RI值：（1.18± 0.01）比（1.40±0.01），P＜0.05]；[MMP-2 RI值：（1.01±0.05）比（1.26±0.05），P＜0.01]。與寒凝血瘀荷瘤組比較，溫陽(yáng)活血治療組小鼠MMP-12表達(dá)升高[MMP-12 RI值：（1.23±0.03）比（1.08±0.06）（P＜0.05）]。結(jié)論溫陽(yáng)活血法通過(guò)下調(diào)荷瘤小鼠腫瘤轉(zhuǎn)移靶器官肺組織ERK1/2、MMP-2表達(dá)及上調(diào)MMP-12從而影響腫瘤基質(zhì)及腫瘤血管生成，進(jìn)而減少轉(zhuǎn)移灶形成的發(fā)生率。

小鼠；荷CT-26結(jié)腸腺癌細(xì)胞；寒凝血瘀證；溫陽(yáng)活血法；MMP-2；MMP-12；ERK1/2

轉(zhuǎn)移和侵襲是惡性腫瘤的基本生物學(xué)特征，控制轉(zhuǎn)移是決定腫瘤患者預(yù)后的關(guān)鍵因素。腫瘤轉(zhuǎn)移是宿主、腫瘤細(xì)胞與腫瘤微環(huán)境之間多因素相互作

用的復(fù)雜過(guò)程。允許腫瘤生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)移靶組織微環(huán)境變化活化先于癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移，為腫瘤向該組織轉(zhuǎn)移提供有利條件。中醫(yī)理論解讀腫瘤的發(fā)生與發(fā)展也是機(jī)體內(nèi)環(huán)境諸多陰陽(yáng)平衡被打破的惡性循環(huán)的過(guò)程[1]，這與腫瘤轉(zhuǎn)移微環(huán)境的理論不謀而合。根據(jù)辨證論治原則，針對(duì)腫瘤患者不同證候類型施以不同治則治法，以期恢復(fù)機(jī)體內(nèi)環(huán)境平衡，達(dá)到降低腫瘤轉(zhuǎn)移發(fā)生率。血瘀證是惡性腫瘤患者的主要證候之一，“寒”是腫瘤晚期患者的又一特點(diǎn)，寒凝血瘀為血瘀證常見(jiàn)亞型之一[2]。肺組織是腫瘤轉(zhuǎn)移常見(jiàn)的靶器官，這可能與肺組織中毛細(xì)血管密集，為腫瘤細(xì)胞的增殖提供便利條件，并且大量的肺泡巨噬細(xì)胞分泌多種細(xì)胞因子，促進(jìn)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、侵襲及新生血管生成有關(guān)。本研究從腫瘤新生血管與腫瘤細(xì)胞降解細(xì)胞基底膜及細(xì)胞外基質(zhì)方面著手，通過(guò)檢測(cè)轉(zhuǎn)移靶器官肺組織中MMP-2、MMP-12、ERK1/2的表達(dá)以分析寒凝血瘀狀態(tài)及溫陽(yáng)活血法對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移的影響。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康8周齡雌性Balb/c小鼠48只，體質(zhì)量（20±2）g，由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)：上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司SCXK（滬）2008-0016。SPF條件下飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心B區(qū)：溫度（24±2）℃，濕度（55±5）%，噪音＜50db，每12h予亮暗循環(huán)，2周更換1次敷料，用無(wú)菌營(yíng)養(yǎng)顆粒飼料飼養(yǎng)。

1.2 實(shí)驗(yàn)瘤株 小鼠結(jié)腸腺癌細(xì)胞CT-26 colon cancer，購(gòu)自上海細(xì)胞庫(kù)。

1.3 藥物及主要試劑 0.9%NaCl（常州康普藥業(yè)有限公司，批號(hào)0905025）；0.1%鹽酸腎上腺素（天津金耀氨基酸有限公司，批號(hào)H12020526）；Tris、Triton X-100（ANDYBOY公司）；過(guò)硫酸銨（愛(ài)建德固賽引發(fā)劑有限公司）；丙烯酰胺（Bio-Rad公司）；十二烷基磺酸鈉（AMRESCO公司）；Tween20、Temed（Bio-Rad公司）；Marker（Ferment公司）甘氨酸（AMRESCO公司）；化學(xué)發(fā)光試劑A、B（Millipore Corparation公司）；羊抗鼠二抗、羊抗兔二抗（Santa Cruz公司）；兔抗MMP-2一抗、兔抗MMP-12一抗（Epitomics公司）；兔抗ERK1/2、兔抗pERK1/2、鼠抗β-actin一抗（CST公司）；RIPA細(xì)胞裂解液（Roch公司）；RMPI-1640培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基（GIBCO公司）；0.4%臺(tái)盼蘭溶液、Brij-35（AMRESCO公司）；胎牛血清（Hyclone公司）；0.25%胰酶-EDTA（吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司）；蛋白定量試劑盒A、B（Bio-rad公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 動(dòng)物分組 應(yīng)用計(jì)算機(jī)生成的隨機(jī)數(shù)字表將48只8周齡Balb/c小鼠隨機(jī)分為四組：空白對(duì)照組、單純荷瘤組、寒凝血瘀荷瘤組、溫陽(yáng)活血治療組，每組12只。

2.2 造模方法 （1）空白對(duì)照組：每天定點(diǎn)小鼠皮下靜脈注射無(wú)熱源生理鹽水0.2mL,隔天1次,連續(xù)2周。2周后復(fù)予皮下注射無(wú)熱源生理鹽水0.2mL，隔天1次，連續(xù)4周。（2）單純荷瘤組：每天定點(diǎn)小鼠皮下靜脈注射生理鹽水0.2mL,隔天1次,連續(xù)2周。2周后每只小鼠右前肢腋部皮下接種C26單細(xì)胞懸液（密度=4×106個(gè)/mL）0.2mL。24h后復(fù)予皮下注射無(wú)熱源生理鹽水0.2mL，隔天1次，連續(xù)4周。（3）寒凝血瘀荷瘤組：每天定點(diǎn)小鼠皮下注射0.1%腎上腺素0.08mL/kg（用生理鹽水稀釋到0.2mL），分兩次注射，第1次注射后1h，進(jìn)行冰?。?～6℃）4min，連續(xù)2周，2周后每只小鼠右前肢腋部皮下接種C26單細(xì)胞懸液（密度=4×106個(gè)/mL）0.1mL。皮下接種24h后維持造模，隔天1次，連續(xù)4周。（4）溫陽(yáng)活血治療組：同寒凝血瘀荷瘤組。

2.3 中藥干預(yù) 中藥煎劑選用溫陽(yáng)活血代表方劑血府逐瘀湯合當(dāng)歸四逆湯加減（桃仁、紅花、川芎各12g，生地15g，赤芍、牛膝、柴胡各12g，枳殼6g，桔梗12g，當(dāng)歸 15g，桂枝 12g，芍藥 15g，甘草 6g，大棗15g）。原生藥材購(gòu)自浙江中醫(yī)藥大學(xué)制劑室，按傳統(tǒng)工藝將藥物加水反復(fù)濃煎，濃縮至生藥含量為1.68g/ mL濃度的中藥水煎劑，密封，4°C保存，臨用前稀釋。溫陽(yáng)活血治療組小鼠瘤體接種24h后開(kāi)始中藥灌胃，藥量換算方法以陳奇推薦的換算法[3]為依據(jù)，根據(jù)成人每天每60kg體質(zhì)量藥量的10倍推算出等效劑量0.28g/（10g·d）按比例稀釋至0.2mL中藥煎劑灌胃，每天1次，連續(xù)4周。

2.4 動(dòng)物觀察 參照相關(guān)文獻(xiàn)[4-7]評(píng)價(jià)小鼠寒凝血瘀證模型，動(dòng)物模型寒凝血瘀證候的相關(guān)觀測(cè)指標(biāo)包括：一般情況（外在癥狀、體溫、毛發(fā)情況、耳廓毛細(xì)血管網(wǎng)外觀）、實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)（全血黏度、局部微血管血流值）。瘤體接種觀察：造模第2周瘤細(xì)胞皮下接種后每天觀察各組荷瘤小鼠瘤體大小。

2.5 標(biāo)本采集及檢測(cè) 于造模第42天通過(guò)微循環(huán)多普勒儀器檢測(cè)各組小鼠耳朵、腳趾、腹部血管的血流值，每只小鼠取血送檢全血黏度，然后采用頸椎脫臼法處死各組小鼠，解剖并取出全部肺組織，固定于10%福爾馬林，部分肺組織HE染色；部分肺組織采用Western blot檢測(cè)MMP-2、MMP-12、pERK1/2蛋白濃度。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析處理。依各數(shù)據(jù)類型分別采用方差分析（F檢驗(yàn)、多樣本均數(shù)間多重比較的Dunnett-t檢驗(yàn)及LSD-t檢驗(yàn)），率的比較用χ2檢驗(yàn)。計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s） 表示，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 模型評(píng)價(jià) 單純荷瘤組、寒凝血瘀荷瘤組、溫陽(yáng)活血治療組小鼠右前肢腋部皮下接種C26單細(xì)胞懸液1周左右后接種部位出現(xiàn)位置固定、質(zhì)地稍軟的實(shí)體腫塊，隨后腫瘤結(jié)節(jié)逐漸增大，荷瘤小鼠皮下移植瘤接種成功率為100%（36/36）。除空白對(duì)照組小鼠外，各組小鼠均有消瘦及被毛脫落、動(dòng)作遲緩等癥狀；寒凝血瘀荷瘤組、溫陽(yáng)活血治療組小鼠在造模開(kāi)始后出現(xiàn)畏寒喜暖,食少便稀,倦縮少動(dòng)，毛發(fā)變黃、枯槁，雙眼球顏色變暗紅，爪甲逐漸紫暗，耳緣毛細(xì)血管顏色由紅逐漸變深紅甚至紫紅等寒凝血瘀證癥狀，空白對(duì)照組及單純荷瘤組小鼠無(wú)寒凝血瘀證典型表現(xiàn)。寒凝血瘀荷瘤組、溫陽(yáng)活血治療組各小鼠的耳緣血管、腳趾及腹壁靜脈所測(cè)得血流值均小于空白對(duì)照組及單純荷瘤組小鼠，見(jiàn)表1，血黏度值檢測(cè)明顯高于空白對(duì)照組及單純荷瘤組小鼠，見(jiàn)表2，提示寒凝血瘀荷瘤組、溫陽(yáng)活血治療組各小鼠血液處于高黏滯狀態(tài),結(jié)合寒凝血瘀證典型表現(xiàn)說(shuō)明本研究小鼠寒凝血瘀證模型建立成功。

表1 各組小鼠局部微循環(huán)血流量（±s）

表1 各組小鼠局部微循環(huán)血流量（±s）

注：與單純荷瘤組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

組別空白對(duì)照組單純荷瘤組寒凝血瘀荷瘤組溫陽(yáng)活血治療組只數(shù)12 12 12 12耳緣42.9±2.78 35.6±5.1 33.8±3.2** 35.0±5.8*腳趾49.4±8.17 33.4±1.9 29.6±1.4* 32.7±2.1*腹壁95.1±9.8 74.0±4.0 64.0±5.4** 69.9±13.0*

表2 各組小鼠全血黏度比較（mps.s，±s）

表2 各組小鼠全血黏度比較（mps.s，±s）

注：與單純荷瘤組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

組別空白對(duì)照組單純荷瘤組寒凝血瘀荷瘤組溫陽(yáng)活血治療組只數(shù)12 12 12 12低切27.66±1.0 35.61±1.1 48.87±1.8* 44.40±2.0*中切5.70±0.40 6.61±0.55 8.25±2.75* 7.68±0.55*高切3.07±0.29 4.89±0.27 7.04±1.40** 5.22±0.18*

3.2 各組小鼠免疫組化檢測(cè)結(jié)果 48只雌性Balb/c小鼠的肺臟進(jìn)行免疫組化檢測(cè)及HE染色，病理切片上均未發(fā)現(xiàn)C26細(xì)胞轉(zhuǎn)移灶，亦未發(fā)現(xiàn)異常血管生成、腫瘤原發(fā)灶及其它癌前病變。

3.3 各組小鼠Western blot結(jié)果 與單純荷瘤組小鼠比較，寒凝血瘀荷瘤組MMP-2（P＜0.05），pERK1/2表達(dá)升高（P＜0.05）。與寒凝血瘀荷瘤組小鼠比較，溫陽(yáng)活血治療組小鼠MMP-2表達(dá)降低（P＜0.01），pERK1/2表達(dá)降低（P＜0.05）。與單純荷瘤組小鼠比較，寒凝血瘀荷瘤組小鼠MMP-12表達(dá)升高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與寒凝血瘀荷瘤組比較，溫陽(yáng)活血治療組小鼠MMP-12表達(dá)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表3 各組小鼠RI值比較（±s）

表3 各組小鼠RI值比較（±s）

注：與單純荷瘤組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與寒凝血瘀荷瘤組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01

組別空白對(duì)照組單純荷瘤組寒凝血瘀荷瘤組溫陽(yáng)活血治療組只數(shù)12 12 12 12 MMP-2 0.67±0.06 1.00±0.04 1.26±0.05* 1.01±0.05△△pERK1/2 0.73±0.01 0.98±0.03 1.40±0.01* 1.18±0.01△MMP-12 0.69±0.03 0.66±0.06 1.08±0.06 1.23±0.03△

4 討 論

早在1889年，Paget提出器官微環(huán)境（“土壤”）可影響特定腫瘤細(xì)胞（“種子”）的種植、侵襲、存活、生長(zhǎng)，腫瘤轉(zhuǎn)移早期常呈現(xiàn)特異臟器親合性，允許腫瘤生長(zhǎng)的原發(fā)腫瘤器官及轉(zhuǎn)移器官微環(huán)境，腫瘤細(xì)胞與宿主細(xì)胞間相互作用均是決定腫瘤轉(zhuǎn)移的重要因素等[8]。部分學(xué)者認(rèn)為腫瘤轉(zhuǎn)移靶組織活化先于癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移，靶組織的微環(huán)境變化對(duì)腫瘤向該組織轉(zhuǎn)移提供了有利條件[9-11]。在腫瘤微環(huán)境中主要包含了多種非惡性的支持基質(zhì)細(xì)胞，其在腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)下在其周圍產(chǎn)生大量的生長(zhǎng)因子、黏附分子、趨化因子以及基質(zhì)降解酶以促進(jìn)血管生成和基底膜破壞，使腫瘤的侵襲能力增強(qiáng)[12]。MMP-2是人體內(nèi)降解細(xì)胞外基質(zhì)的主要酶類，相關(guān)研究[13-15]表明MMP-2高表達(dá)的患者相對(duì)于MMP-2低表達(dá)患者總的生存率明顯縮短。MMP-12過(guò)表達(dá)結(jié)腸癌患者其腫瘤浸潤(rùn)深度、淋巴管及血管浸潤(rùn)程度均好于MMP-12陰性表達(dá)者，在抗腫瘤和抗血管生成方面有重要作用[16-17]。ERK1/ERK2主要功能是將細(xì)胞外各種環(huán)境因素變化的信息傳遞至胞內(nèi)，抑制ERK/MAPK信號(hào)通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)在體外能使腫瘤細(xì)胞恢復(fù)到非轉(zhuǎn)化的狀態(tài)，在體內(nèi)則能抑制腫瘤的生長(zhǎng)[18-19]。

本研究發(fā)現(xiàn)，寒凝血瘀狀態(tài)對(duì)小鼠自發(fā)性結(jié)腸癌肺轉(zhuǎn)移模型中MMP-2、ERK1/2的表達(dá)具有一定的促進(jìn)作用，采用溫陽(yáng)活血化瘀中藥干預(yù)后可下調(diào)MMP-2、ERK1/2的表達(dá)；對(duì)于寒凝血瘀狀態(tài)荷瘤小鼠采用溫陽(yáng)活血化瘀中藥干預(yù)后可一定程度上促進(jìn)MMP-12的表達(dá)。由此得出，寒凝血瘀狀態(tài)可以促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移發(fā)生，采用溫陽(yáng)活血法干預(yù)寒凝血瘀狀態(tài)可改善腫瘤靶組織轉(zhuǎn)移的微環(huán)境，從而降低腫瘤轉(zhuǎn)移率。

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（收稿：2016-02-08 修回：2016-04-30）

Effects of Yang-warming and Blood-activating Therapy on MMPs and ERK in Mice with Colorectal Tu-morwith Chinese Differentiation Syndrome of Cold Coagulation and BloodStasis

TANG Penglin1,GUO Yong21 Department of Internal Medicine,the Third Affiliated Hospital of Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou (310005),China；2 Department of Internal Medicine,the First AffiliatedHospital of Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou(310006),China

ObjectiveTo investigate the effect of Chinese medicine cold coagulation and blood stasis syndrome and Yang-warming and blood-activating therapy on tumor metastasis.MethodsForty-eight Balb/c mice were randomly divided into 6 groups：blank control group,tumor-bearing group,tumor-bearing+cold coagulation and blood stasis syndrome group（control group with tumor bearing）,tumor-bearing+cold coagulation and blood stasis syndrome+herb medicine group（treatment group）,with 12 mice in each group.Except for blank control group,cold coagulation and blood stasis syndrome model was established in other groups.The expression of MMPs and ERK in lung tissue was determined by western blot assay.ResultsCompared with tumor-bearinggroup,ERK1/2 and MMP-2 of control group with tumorbearing were higher（ERK1/2 RI value：1.40±0.01 vs 0.98±0.03;MMP-2 RI value：1.26±0.05 vs1.00±0.04;all P＜0.05）.Compared with control group with tumorbearing,treatment group had decreased ERK1/2（RI value：1.18±0.01 vs 1.40±0.01,P＜0.01）and MMP-2（RI value：1.01±0.05 vs 1.26±0.05;all P＜0.01）, but increased MMP-12 level（RI value：1.23±0.03 vs 1.08±0.06，P＜0.05）.ConclusionYang-warming and bloodactivating therapy can decrease the expression of ERK1/2 and MMP-2 and increase MMP-12 of lung tissuein tumor-bearing mice to influence tumor stroma and the formation of tumor vessels and consequently reduce the incidence of tumor metastasis.

mice;CT-26 cancer cells;cold coagulation and blood stasis;Yang-warming and blood-activating therapy;MMP-2;MMP-12;ERK1/2

浙江省中醫(yī)藥科技計(jì)劃項(xiàng)目（No.2012ZA049）

1浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第三醫(yī)院腫瘤內(nèi)科（杭州 310005）；2浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院腫瘤內(nèi)科（杭州 310006）

郭勇，Tel：13588887292；E-mail：guoyong1047@163.com