補元清腦顆粒對APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠學習記憶及Bax、Bcl-2表達的影響

潘怡宏王 平

補元清腦顆粒對APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠學習記憶及Bax、Bcl-2表達的影響

潘怡宏1王 平2

目的觀察補元清腦顆粒對APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠學習記憶能力及Bax、Bcl-2表達的影響。方法將40只APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠隨機分為模型組、多奈哌齊組、補元清腦顆粒高劑量組和低劑量組，每組10只，同月齡相同遺傳背景C57BL/6J小鼠10只為空白組。從5月齡開始分別灌胃，1天1次?？瞻捉M、模型組均給予等容積生理鹽水灌胃。連續(xù)灌胃30天后進行Morris水迷宮測試評定各組小鼠學習記憶能力；采用Western Blot法檢測小鼠海馬組織Bax、Bcl-2蛋白的表達。結果與模型組比較，補元清腦顆粒高、低劑量組均可減少小鼠Morris水迷宮測試的上平臺潛伏期[（37.90±20.10）s比（66.98±21.00）s，P＜0.01；（47.65±22.93）s比（66.98±21.00）s，P＜0.05]、減少游泳總路程[（414.94±171.10）cm、（559.72±178.76）cm比（1032.12±118.66）cm，P＜0.01]和第一次抵原平臺時間[（21.36±20.22）s、（27.82±21.96）s比（51.71±20.96）s，P＜0.01]，增加穿越平臺次數(shù)[（5.90±1.60）次比（1.80±1.41）次，P＜0.01；（4.60±1.71）次比（1.80±1.41）次，P＜0.05]和目標象限時間[（17.71±7.58）s、（14.07±7.08）s比（5.55±4.42）s，P＜0.01]，增加小鼠海馬組織Bcl-2蛋白相對表達量（0.52±0.07比0.15±0.06，P＜0.01；0.42±0.06比0.15±0.06，P＜0.05）。結論補元清腦顆粒對APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠的學習記憶能力具有改善作用，及有一定的抗神經(jīng)元凋亡作用。

小鼠；阿爾茨海默??；補元清腦顆粒；Morris水迷宮；Western Blot

阿爾茨海默?。╝lzheimer's disease,AD）是老年人常見的一種與衰老相關的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，起病隱匿，呈進行性發(fā)展。隨著全球人口老齡化的發(fā)展，AD的發(fā)病率不斷上升，為家庭和社會帶來沉重的負擔。研究如何延緩衰老和防治老年病，通過預見其發(fā)生而進行有針對性、個體化的防治，使“健康老齡化”成為一種醫(yī)學發(fā)展的方向。中醫(yī)認為，AD的病因病機多為年邁體衰，元氣虧虛，髓海不足，腦失所養(yǎng)，神機失用，清竅不明。研究元氣與AD病因病機的關系及培元固本法對AD的治療作用對于AD的防治具有重要意義。本研究選用APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠作為AD動物模型，從行為學、Bax及Bcl-2蛋白的表達入手，研究補元清腦顆粒對APP/ PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠學習記憶及Bax、Bcl-2表達的影響。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 SPF級5月齡APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠40只，雄性，中國醫(yī)學科學院實驗動物研究所訂購，許可證號：SCXK（京）2013-0002。SPF級5月齡相同遺傳背景C57BL/6J小鼠10只，雄性，中國醫(yī)學科學院實驗動物研究所訂購，許可證號：SCXK（京）2012-0001。

1.2 藥 品 補元清腦顆粒（由石菖蒲、遠志、人參、茯苓、熟地等組成，湖北虎泉藥業(yè)有限公司加工成為中藥顆粒中試產(chǎn)品，批號201305。純水配成0.39g/ mL，冰箱4℃儲存?zhèn)溆茫６嗄芜啐R（鹽酸多奈哌齊片，衛(wèi)材藥業(yè)有限公司，批號H20050978）。

1.3 儀器與試劑 小鼠獨立通氣系統(tǒng)（型號：S8智能型，蘇州市蘇杭科技器材有限公司）。Morris水迷宮（型號：DMS-2，中國醫(yī)學科學院藥物研究所）。蛋白電泳儀（美國Bio-Rad公司）。凝膠圖像成像分析儀（美國Bio-Rad公司）。SDS-PAGE凝膠配制試劑盒（批號P0012A，上海碧云天生物技術有限公司）。一抗（兔抗鼠GAPDH抗體，批號ABS16；兔抗鼠Bax抗體，批號AB2915；兔抗鼠Bcl-2抗體，批號AB10546，均購自美國millipore公司）。二抗（羊抗兔二抗，購自武漢科瑞生物技術有限公司）。

2 實驗方法

2.1 動物分組及給藥 用SPSS19.0統(tǒng)計軟件產(chǎn)生一組隨機數(shù)字表，將5月齡APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠隨機分成5組，即模型組、多奈哌齊組、補元清腦顆粒高劑量組（以下簡稱高劑量組）和補元清腦顆粒低劑量組（以下簡稱低劑量組），每組10只。同月齡C57BL/6J小鼠10只作為空白組?？瞻捉M和模型組每天灌胃生理鹽水，其余各組分別灌胃相應藥物，多奈哌齊組0.65mg/（kg·d），補元清腦顆粒高劑量組15.6g/（kg·d），補元清腦顆粒低劑量組7.8g/（kg·d）。正常適應性喂養(yǎng)1周后開始灌胃，各組小鼠均灌胃20mL/kg，每天灌胃1次，連續(xù)灌胃30天。

2.2 Morris水迷宮測試 各組小鼠均進行Morris水迷宮測試，末次給藥結束后24h進行。參照文獻Morris水迷宮[1]方法。Morris水迷宮主要由一個圓形水池、一個圓形平臺和自動錄像及分析系統(tǒng)三部分組成。水池高70cm，直徑100cm，由于APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠皮毛為黑色，為了使自動錄像及分析系統(tǒng)能夠識別小鼠游泳軌跡，預先在水池中加入奶粉-清水混懸液，攪拌均勻，使池水呈乳白色，平臺位于第一象限中央。調(diào)整水池上方的攝像機位置，使其能拍攝到整個水池，同步采集記錄小鼠游泳軌跡。通過定位航行試驗（place navigation）和空間探索試驗（spatial probe）來分析小鼠的學習獲取能力和空間記憶能力。

2.2.1 定位航行試驗 將小鼠面向池壁，每天分別從平臺對側(cè)象限（第四象限）的兩個頂點處放入水中，記錄其在90s內(nèi)尋找到平臺的時間(即上平臺潛伏期)，歷時2天。當小鼠在設定的訓練時間90s內(nèi)找到并爬上平臺，且停留時間達3s時，計算機停止跟蹤，記錄下游泳軌跡，并自動計算出動物的上平臺潛伏期及游泳總路程等指標；若小鼠在90s之內(nèi)尚未找到平臺，則上平臺潛伏期按90s記錄，同時將小鼠引至平臺停留20s引導其學習與記憶。第3天隨機選取其中一個點入水，訓練成績即為定位航行試驗結果，以上平臺潛伏期和游泳總路程作為衡量其學習記憶能力的指標。

2.2.2 空間探索試驗 第4天將平臺撤除，進行空間探索試驗，任選平臺對側(cè)象限（第四象限）的一個入水點將小鼠放入水中，開始90s的空間探索試驗。記錄動物在90s內(nèi)穿越平臺次數(shù)、目標象限時間和第1次抵原平臺時間，以此作為空間記憶的檢測指標。

2.3 Western Blot法檢測Bax及Bcl-2蛋白的表達 小鼠Morris水迷宮測試結束后立即頸椎脫臼法處死，冰上斷頭，剝開頭頸部皮毛，暴露顱骨，沿枕骨大孔剪開，取出鼠腦，分離兩側(cè)海馬組織，放入凍存管，浸入液氮急凍，立即放入超低溫冰箱-80℃凍存。RIPA法提取小鼠海馬總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，進行蛋白凝膠電泳，運行Bio-Rad凝膠圖像成像分析系統(tǒng)，曝光獲得各組蛋白條帶，拍照，采用Bio-Rad凝膠圖像成像分析系統(tǒng)分析各組條帶灰度值，并作統(tǒng)計分析。

2.4 統(tǒng)計學方法 應用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進行分析，結果以（±s） 表示，兩組比較采用t檢驗，多重比較采用單因素方差分析。

3 實驗結果

3.1 Morris水迷宮測試

3.1.1 各組小鼠定位航行試驗結果 與空白組比較，模型組小鼠上平臺潛伏期明顯延長（P＜0.01），游泳總路程明顯增加（P＜0.01）；與模型組比較，各組小鼠的上平臺潛伏期均縮短（P＜0.01，P＜0.05），游泳總路程均減少（P＜0.01，P＜0.05），且補元清腦顆粒高劑量組和低劑量組間呈現(xiàn)出一定的量效關系；與多奈哌齊組比較，補元清腦顆粒高劑量組和低劑量組小鼠的游泳總路程明顯減少（P＜0.01）見表1。

表1 各組小鼠定位航行試驗結果比較（±s）

表1 各組小鼠定位航行試驗結果比較（±s）

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與多奈哌齊組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01

組別空白組模型組多奈哌齊組補元清腦顆粒高劑量組補元清腦顆粒低劑量組只數(shù)10 10 10上平臺潛伏期（s）24.93±20.85** 66.98±21.00 46.72±18.83*游泳總路程（cm）125.68±63.50** 1032.12±118.66△753.57±185.59** 1037.90±20.10**414.94±171.10**△△1047.65±22.93*559.72±178.76**△△

3.1.2 各組小鼠空間探索試驗 與空白組比較，模型組小鼠的穿越平臺次數(shù)、目標象限時間均明顯減少（P＜0.01），第1次抵原平臺時間明顯延長（P＜0.01）；與模型組比較，補元清腦顆粒高劑量組和低劑量組小鼠穿越平臺次數(shù)增加（P＜0.01，P＜0.05），各組小鼠的目標象限時間增加（P＜0.01，P＜0.05），第1次抵原平臺時間縮短（P＜0.01，P＜0.05）見表2。

表2 各組小鼠空間探索試驗結果比較（±s）

表2 各組小鼠空間探索試驗結果比較（±s）

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

組別空白組模型組多奈哌齊組補元清腦顆粒高劑量組補元清腦顆粒低劑量組只數(shù)10 10 10穿越平臺次數(shù)6.10±1.70** 1.80±1.41 3.70±1.72*目標象限時間（s）17.83±6.96** 5.55±4.42 12.60±6.58* 第1次抵原平臺時間（s）6.87±3.72** 51.71±20.96 27.85±20.69** 105.90±1.60**17.71±7.58**21.36±20.22** 104.60±1.71*14.07±7.08**27.82±21.96**

3.2 Western Blot法檢測各組小鼠Bax及Bcl-2蛋白表達 與空白組比較，模型組小鼠海馬組織Bcl-2蛋白相對表達量減少（P＜0.05），Bcl-2/Bax比值增加（P＜0.01）；與模型組比較，各組小鼠海馬組織Bcl-2蛋白相對表達量增加（P＜0.01，P＜0.05），Bcl-2/Bax比值均增加（P＜0.01，P＜0.05）。補元清腦顆粒高、低劑量組各指標與多奈哌齊組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）見表3，圖1。

表3 各組小鼠海馬組織Bax、Bcl-2蛋白相對表達量比較（s）

表3 各組小鼠海馬組織Bax、Bcl-2蛋白相對表達量比較（s）

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

只數(shù)10 10 10 Bax 0.29±0.03 0.36±0.03 0.24±0.02 Bcl-2/Bax 1.07** 0.42 2.46** 0.52±0.07** Bcl-2 0.31±0.07* 0.15±0.06 0.59±0.07** 2.48** 0.21±0.05 10 0.24±0.04 100.42±0.06*1.75*組別空白組模型組多奈哌齊組補元清腦顆粒高劑量組補元清腦顆粒低劑量組

圖1 APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠海馬組織Western Blot結果

4 討論

AD是一種不可逆的神經(jīng)退行性疾病,臨床表現(xiàn)為進行性記憶和認知障礙。AD的發(fā)病原因尚不明確，其主要的病理表現(xiàn)為β-淀粉樣蛋白（β-Amyloid，Aβ）沉積，老年斑（senile plaque，SP）形成，tau蛋白過度磷酸化和神經(jīng)纖維纏結（neurofibrillary tangles，NFTs）[2]。AD的特征是大腦皮層及某些皮層下區(qū)域的神經(jīng)元和神經(jīng)突觸喪失，在AD早期就出現(xiàn)突觸和神經(jīng)元的大量丟失，中期AD病人內(nèi)嗅區(qū)皮質(zhì)神經(jīng)元丟失達50%。尸檢報告提示，AD患者腦中一些神經(jīng)元通過凋亡機制蛻變，在AD相當早期階段，神經(jīng)元已經(jīng)普遍出現(xiàn)DNA損傷，這種損傷甚至也可在無神經(jīng)纖維纏結的神經(jīng)元見到，而且似乎在疾病全程中都存在[3]。最新的研究[4]表明，Aβ相關的神經(jīng)細胞凋亡是AD發(fā)病的重要環(huán)節(jié)。老年斑的主要成分Aβ是各種原因誘發(fā)AD的共同通路，聚集的Aβ是一種毒性蛋白，使細胞的鈣離子穩(wěn)態(tài)發(fā)生紊亂，從而誘導細胞凋亡[5]。Bcl-2/Bax是凋亡的各種信號轉(zhuǎn)導途徑的共同交匯點[6]。

Bax被認為是線粒體損傷的重要誘導分子，當死亡信號刺激后，激活的Bax移動到線粒體的外膜上，改變線粒體膜的通透性，Bax還能直接結合到線粒體膜通透性轉(zhuǎn)運孔（MPTP），增強線粒體膜的通透性，促進凋亡因子（AIF）釋放，從而啟動凋亡信號途徑。Bcl-2是一種抗細胞凋亡蛋白，與促凋亡蛋白Bax結合成異二聚體，具有抑制Bax的促凋亡作用[7]。實驗證明，Aβ誘導的海馬神經(jīng)元凋亡是通過下調(diào)Bcl-2表達和上調(diào)Bax的表達實現(xiàn)，通過Bax抑制劑的使用，或敲除Bax基因，可以顯著減少Aβ誘導的細胞凋亡[8]。

研究指出，APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠在3月齡就出現(xiàn)認知行為學變化，5月齡出現(xiàn)老年斑，6～7月齡的小鼠腦內(nèi)會形成Aβ沉淀，12月齡有大量老年斑形成，其空間學習能力明顯受損[9]。APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠作為AD動物模型已被廣泛應用于研究PS1 在Aβ沉積中的作用，以及Aβ在AD發(fā)病過程中的作用，是研究AD病情進展和預防治療的理想動物模型[10]。

補元清腦顆粒是導師王平教授根據(jù)老年性癡呆元氣虧虛、痰濁蒙竅的病機，結合多年臨床經(jīng)驗組方而成，由石菖蒲、遠志、人參、茯苓、熟地等中藥組成，具有培元固本，化痰清腦的作用。本實驗結果表明，補元清腦顆?？梢悦黠@提高APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠學習記憶能力，提高APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠海馬組織Bcl-2蛋白相對表達量，且結果與多奈哌齊無明顯差別，說明補元清腦顆粒對AD模型小鼠的學習記憶能力具有較好的改善作用，且具有一定的抗神經(jīng)元凋亡作用。

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（收稿：2016-04-09 修回：2016-06-22）

Effect of Buyuanqingnaokeli on the Ability of Learning and Memory and the Expression of Bax and Bcl-2 in APP/PS1DoubleTransgenicMice

PAN Yihong1,WANG Ping2. 1DepartmentofChineseMedicine,Hangzhou First People's Hospital,Hangzhou(310006),China;2 Institute of Geratology,Hubei University of Chinese Medicine,Wuhan(430065),China

ObjectiveTo investigate the effect of buyuanqingnaokeli on the ability of learning and memory and the expression of Bax and Bcl-2 in APP/PS1 double transgenic mice.MethodsForty APP/PS1 double transgenic mouse models were established and divided into 4 groups：model group,western medicine(donepezil)group, buyuanqingnaokeli (BYQNK)high-dose and low-dose groups,with 10 mice in each.Ten C57BL/6J mice with the same months of age and genetic background served as blank group.The equivalent volume of saline was given to model and blank groups.After gavage the corresponding drugs once a day for 30 days,Morris test was measured to assess the ability of learning and memory,and Bax and Bcl-2 in the hippocampus tissue of different groups were detected with Western Blot.ResultsCompared to model group,BYQNKL high-dose and low-dose groups had reduced platform latency(37.90±20.10s vs 66.98±21.00s,P＜0.01;47.65±22.93s vs 66.98±21.00s,P＜0.05),total swimming distance(414.94±171.10cm,559.72±178.76cm vs 1032.12±118.66cm,P＜0.01)and the time to reach the original platform for the first time(21.36±20.22s,27.82±21.96s vs 51.71±20.96s,P＜0.01),target quadrant time (17.71±7.58s,14.07±7.08s vs 5.55±4.42s,P＜0.01)and increased through platform number (5.90±1.60,4.60±1.71 vs 1.80±1.41,P＜0.01 or P＜0.05)and the relative transcript level of Bcl-2(0.52±0.07,0.42±0.06 vs 0.15±0.06,P＜0.01 or P＜0.05).ConclusionBYQNKL can improve the ability of learning and memory of APP/PS1 doubletransgenic mice,showing certain anti-apoptosis effects.

Mice;Buyuanqingnaokeli;Alzheimer's disease;Morris test;Western Blot

國家自然科學基金重點項目（No.81130064）

1杭州市第一人民醫(yī)院中醫(yī)科（杭州 310006）；2湖北中醫(yī)藥大學（武漢 430065）

王平，Tel：027-68890008；E-mail：pwang@aliyun.com